Summary
En murin model af kutan sårheling, der kan bruges til at vurdere terapeutiske forbindelser i fysiologiske og patofysiologiske indstillinger.
Abstract
Sårheling og-reparation er de mest komplekse biologiske processer, der foregår i menneskets liv. Efter skade, bliver flere biologiske veje aktiveres. Nedsat sårheling, som forekommer hos diabetikere for eksempel kan føre til alvorlige ugunstige resultater såsom amputation. Der er derfor et stigende incitament til at udvikle nye midler, der fremmer sårheling. Afprøvningen af disse er begrænset til store dyremodeller såsom svin, der ofte upraktisk. Mus repræsenterer det ideelle præklinisk model, da de er økonomisk og medgørlige til genmanipulation, hvilket giver mulighed for mekanistiske undersøgelser. Men sårheling i en mus er fundamentalt anderledes end mennesker, som det foregår primært via sammentrækning. Vores musemodel overvinder dette ved at indarbejde en skinne omkring såret. Ved fiksering såret, er reparationen derefter afhængig af epitelisering, cellulær proliferation og angiogenese, som nøje afspejlebiologiske processer i den menneskelige sårheling. Mens der kræver konsekvens og omsorg, går denne musemodel ikke indebære komplicerede kirurgiske teknikker og giver mulighed for den robuste afprøvning af lovende midler, der kan for eksempel fremmer angiogenese eller hæmme inflammation. Desuden har hver mus fungerer som sin egen kontrol som to sår fremstilles, således at anvendelsen af både testforbindelsen og køretøjet kontrol på det samme dyr. Afslutningsvis demonstrerer vi en praktisk, let at lære, og robust model af sårheling, som er sammenlignelig med mennesker.
Introduction
Nedsat sårheling er ansvarlig for betydelig sygelighed og dødelighed på verdensplan, og dette gælder især for folk der lider af diabetes mellitus 1,2. Hos mennesker er sårheling et kontinuum af processer, hvor der er betydelig overlapning 3.. Umiddelbart efter sårede, inflammatoriske processer indledes. Inflammatoriske celler frigiver faktorer der tilskynder de processer af celleproliferation, migration og angiogenese. Efter reepitelialisering og nyt væv dannelse er der en fase af ombygningen, der indebærer både apoptose og re-organisering af matrix proteiner såsom collagen.
Kompleksiteten af sårheling kan i øjeblikket ikke replikeres in vitro og dette indebærer anvendelse af dyremodeller. Til dato har sårhelende undersøgelserne været begrænset til store dyremodeller, såsom svin, for at sikre, at den helbredende processer er ækvivalente og kan sammenlignes med mennesker. Men ved hjælp af store animals for sådanne undersøgelser kan være svært at hus og er ikke altid praktisk 4.. Laboratoriet mus repræsenterer en økonomisk dyremodel, der let kan manipuleres genetisk til mekanistiske undersøgelse 5-7. Men murine sår heler forskelligt på menneskets, primært som følge af processen med sammentrækning 8.. Dette er til dels på grund af en omfattende subkutant tværstribede muskler lag kaldet panniculus carnosus der er stort set fraværende i mennesker. Hos mus, tillader denne muskel lag huden til at bevæge sig uafhængigt af de dybere muskler og er ansvarlig for den hurtige nedgang huden efter såring.
For at overvinde denne begrænsning, kan murine sårheling tilpasses til at replikere menneskelig sårheling ved anvendelse af en skinne (figur 1) 8,9. I denne video viser vi den splinted murine sår model, der eliminerer sårkontraktion og mere nærmest de menneskelige processer i re-epithelialization og ny vævsdannelse. I denne model to fuld tykkelse knuder, der omfatter panniculus carnosus er skabt på dorsum, en på hver side af midterlinjen af musen. En silikone skinne placeres omkring såret med hjælp af klæbemiddel og bandagen fastgøres derefter med afbrudte suturer. Hver mus fungerer som sin egen kontrol med én såret modtager behandling, og det andet køretøj kontrol, og derved reducere antal dyr. Efter aktuelle programmer er en gennemsigtig okklusiv forbinding anvendes. Forbindingen kan fjernes, når der kræves yderligere aktuelle programmer og / eller måling af sårområdet 10,11. Ved afslutningen af forsøgene, sårlukning, morfologisk arkitektur og graden af neovaskularisering kan vurderes ved immunohistokemi. Denne økonomisk og let at udføre model kan også anvendes til at vurdere sårheling i forbindelse med diabetes mellitus eller andre patofysiologier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1.. Udarbejdelse af benskinner og okklusionsbandager
- Outline 10 mm cirkler på 0,5 mm tyk silikone presenningen og bruge saks eller en biopsi punch til at skabe silikone diske.
- Centre en 5 mm biopsitang i midten af 10 mm cirkel og tryk fast at skabe et hul til dannelse af en "doughnut"-lignende disk, vil blive anvendt som en skinne.
- Outline 10 mm cirkler på en gennemsigtig okklusiv forbinding såsom Opsite og bruge en saks til at skabe cirkulære forbindinger.
2.. Forsoegsdyr
- Opnå Animal Ethics Committee godkendelse til alle eksperimenter, der vil blive udført.
- Brug 8 uger gamle (22-26 gram) mandlige C57BL/6J-mus fra en kommerciel opdrætter (f.eks The Jackson Laboratories).
- Hold mus under standardbetingelser på 21 ° C og en 12 timers lys-mørke-cyklus med fri adgang til foder og vand.
- (Valgfri): Diabetes kan induceres i 6 til 7 uger gamle mus ved en bolus intraperitoneal injeIndsatsen på 165 mg / kg streptozotocin (i citratbuffer, pH 4,5) med hyperglykæmi bekræftet ved regelmæssig overvågning af blodsukker (accuchek glucometer). Diabetiske mus kan have polyuri, og så deres strøelse kan være nødvendigt at ændre oftere at fjerne fugtighed og deres vægte skal overvåges nøje.
3.. Anæstesi og operative Forberedelse
- Fremkald generel anæstesi med 5% isofluran i 100% oxygen (flow 1 L / min) og opretholde anæstesi ved hjælp 1-3% isofluran.
- Sikre de dybe pedal reflekser med musen undertrykkes og placere musen i liggende stilling.
- Forbered operative område ved at fjerne skind med klippere fra bunden af halsen til 3 cm længere nede på ryggen og mellem to skulderbladene.
- En let anvendelse af hårfjerningsmiddel kan anvendes længere end 2 min. Våd gaze podninger kan bruges til at sikre, at alle fløde og resterende skind er fjernet.
- Tør huden med enspritserviet og to ansøgninger på 10% povidon-jod (Betadine), og drapere musen.
4.. Excision og fiksering af Wound
- Skematisk gengivelse af det murine sårheling modellen er vist i figur 1..
- Brug en steril 4 mm biopsitang at skitsere to cirkulære mønstre for såret på begge sider af musens midterlinjen på niveau med skuldrene (se figur 2a-2b).
- Brug savtakkede pincet til at løfte huden i midten af omridset og iris saks til at skabe en fuld tykkelse sår, der strækker sig gennem det subkutane væv (figur 2c-2d), herunder panniculus carnosus (fig. 2e), og udskære cirkulære stykke af væv.
- Gentag processen for såret på den anden side af midterlinjen (fig. 2f).
- Fjern plastik beskyttende belægning fra hver side af silikone skinne.
- Påfør cyanoacrylate klæbemiddel (f.eks Super Glue eller Krazy Lim) til den ene side af en silikone bandagen.
- Centrer skinne over såret (Figur 2 g) og forankre skinne med afbrudte 6-0 nylonsuturer at sikre positionering (Figur 2h).
- Gentag fiksering processen på den anden såret.
- Hvis det er nødvendigt på dette tidspunkt-punkt, anvende den terapeutiske forbindelse, der skal testes (op til 100 ul) til en sår (fig. 2i), og køretøjet kontrol til den anden.
- Dække såret med en gennemsigtig okklusiv forbinding (f.eks OpSite) (fig. 2j-2k).
- En lineal er placeret under skinner og et mikrofotografi taget (Figur 2l).
6.. Postoperativ Management
- Carprofen (5 mg / kg) indgives én gang dagligt via subkutan injektion til post-operativ smertelindring.
- Efter operationen dyrene individuelt bur og vedligeholdes på varme mats indtil fuldt tilbagebetalt.
- Overvåge dyrene to gange dagligt i manifestationer af smerte og vægttab. Vi observerede ingen store adfærdsmæssige skærme af smerte eller vægttab.
7.. Sår Måling og behandling
- Såret kan måles dagligt.
- Fremkald generel anæstesi med 5% isofluran gas (flow rate 1 L / min), og derefter sikre de dybe sensoriske reflekser med musen undertrykkes ved hjælp af 1-3% isofluran.
- Forsigtigt skræl tilbage okklusiv forbinding med en pincet.
- Brug kirurgiske calipre til at måle såret diameter. Vi tager gennemsnittet af tre målinger langs X-, Y-og Z-akse (figur 2m-2o) samt et mikrofotografi til fremtidig reference (fig. 2p).
- Valgfrit: På dette tidspunkt dyret kan vurderes for blodperfusion ved hjælp af en laser Doppler Imager (Figur 2q).
- Re-anvendelse af den terapeutiske forbindelse og køretøjet styring kan være udøvetwith på dette punkt.
- En ren transparent okklusionsbandage derefter igen anvendt, og dyrene holdes varm indtil fuldt tilbagebetalt.
- Bemærk: Hvis benskinner ikke er sikret ordentligt såret vil let kontrakt (Figur 2r).
8.. Histologisk analyse
- Aflive mus efter 10 dage med en overdosis af anæstesi.
- Ved hjælp af en pincet og en skalpel kniv fjerne suturer og forsigtigt væk skinne.
- Brug iris saks til at skabe en bred, fuld excision omkring og under sårområdet og inkuberes vævet i 4% paraformaldehyd i phosphatpufret saltopløsning (PBS) ved 4 ° C natten over.
- Overfør væv til 17% saccharose i PBS-opløsning i yderligere 24 timer ved 4 ° C og derefter fjerne overskydende opløsning ved duppe forsigtigt på væv og sted i OCT-forbindelse og fryses ved -80 ° C.
- Hematoxylin og eosin-farvning kan anvendes til at visualisere såret struktur og epitelial hul. Neovascularisation kan vurderes ved immunhistokemiske analyser til at bestemme antallet af kapillærer (ved hjælp af Von Willebrand faktor).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En sårlukning kurve bestemmes ved beregning af den gennemsnitlige diameter af såret og udtrykke resultaterne som en procentdel, dvs 100 - (dag 0 diameter / dag x diameter). I dette eksperiment en terapeutisk forbindelse (eller vehikel kontrol) blev anvendt dagligt på såret. Den terapeutiske forbindelse stærkt accelereret sårlukning (figur 3). Det er vigtigt at bemærke, at skinnerne skal opretholdes under hele forsøget, som fjernelse af skinner vil føre til en hurtig sårkontraktion (Figur 2r) og afviger fra det mønster af sårheling hos mennesker.
Figur 1. Skematisk fremstilling af den murine sårheling model. I denne model to sår af fuld tykkelse er skabt på either side af midterlinjen så hver mus til at tjene som deres egen kontrol. Silikone bandager er klæbet og sutureres til såret perimeter afskærmning sårkontraktion, giver en model replikerbar som mennesker.
Figur 2. Sårheling kirurgi og postoperative målinger. Efter hårfjerning og forberedelse af huden med jod og alkohol (ab) en biopsitang forsigtigt bruges til at skitsere to cirkler på dorsum, hver side af midterlinjen. (C) Et lille indsnit oprettes derefter og (d) et cirkulært stykke hud er fjernet, (e) inklusive panniculosus carnosus, (f) at skabe to fuld tykkelse sår. (g) Klæbemiddel påføres derefter SILIC en benskinner og skinner klæbet til såret omkredsen. (h) Skinner fastgøres derefter med suturer. (i) Behandlinger påføres topisk og (jk) en okklusiv, gennemsigtig forbinding anbringes over såret og klæbet til skinnerne (klæbemiddel kan anvendes, hvis det kræves). (l) Mikrofotografier tages dagligt og sårområdet er beregnet ud fra gennemsnittet af tre diameter målinger på (m) y-aksen, (n) x-aksen og (o) z-aksen. (p ) Et repræsentativt foto af sårene på dag 10, at bemærke den mindre sår på højre, der blev behandlet med en terapeutisk forbindelse. (q) Repræsentant laser Doppler billede af blodtilførslen i såret på dag 6. (R) Eksempel på en hurtig sår sammentrækning efter fjernelse af silikone skinner.
65/50265fig3.jpg "alt =" Figur 3 "fo: content-width =" 4in "fo: src =" / files/ftp_upload/50265/50265fig3highres.jpg "/>
Figur 3. Repræsentative sårlukning graf. Sårområde beregnet ud fra gennemsnittet af tre daglige diameter målinger langs x, y og z-akserne. Sårlukning udtrykkes som en procentdel af den indledende sårområdet på dag 0.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dette er en eksperimentel murin model af kutan sårheling. Et væsentligt træk ved denne model er brugen af silikone skinner at forhindre sårkontraktion så reepitelialisering og ny vævsdannelse kan forekomme, hvilket gør det ligner den proces, der forekommer hos mennesker. Denne model er alsidig og kan bruges til at vurdere sårheling i både fysiologiske og patofysiologiske (f.eks diabetes mellitus) indstillingerne. Modellen kan også anvendes til at vurdere potentielle sårheling eller angiogenese lægemidler i en økonomisk indstilling. Med hver mus optræder som sin egen kontrol, er antallet af dyr minimeres. De kirurgiske teknikker, der kræves for denne model er ikke meget sofistikeret, og dermed denne model kan være almindeligt anvendt af dem med en relativt lille kirurgisk erfaring.
At sikre reproducerbarhed og præcis kvantificering er det bydende nødvendigt, at skinnen tilstrækkeligt klæbet og forankret til huden med suturer, og at ther er minimal forsinkelse mellem at skabe de to sår. Tilbøjelighed murine sår til hurtigt aftale efter lempelse af skinne eller delvis fjernelse grundet skrabe med musen kræver daglig overvågning af benskinner. Omhyggelig limpåføring er også forpligtet til at minimere irritation af sund hud omkring skinne, der kan fremme ridser. Det er også meget vigtigt at følge aseptisk teknik og grundigt desinficere udstyr, især kalibre, mellem mus. Anvendelsen af okklusiv forbinding skal også overvejes, især hvis sår ikke vil blive behandlet eller beredte dagligt. OPSITE og Tegaderm (3M) forbindinger er sammenlignelige 12, og det har vist sig, at Tegaderm forbindinger kun kan forblive klæbet til 1-2 dage. Bør langsigtede sårbandager kræves en alternativ fremgangsmåde er blevet beskrevet af Chung og kolleger 13.
Potentielle svagheder af denne model kan omfatte inflammation d ue til forankring af suturer, udbredelsen af behandlingen eller køretøjet mellem sår og angivelsen af behandlingen i det systemiske kredsløb. I forhold til suturerne inducerer lokal inflammation, er suturer placeres relativt langt fra såret og som hvert sår er skabt ens, hvorfor enhver betændelse, der kan ske, bør være ens mellem sår. Tilsvarende ville afstanden mellem de sår og manglende ødem mellem sårene minimere diffusion mellem de to senge. Der er nogle beviser, at en behandling kan indtaste den systemiske cirkulation, hvilket kan fremskynde heling af kontrollen viklet 9,10. At bestemme omfanget af en behandling ind i systemisk cirkulation, kan kuldsøskende mus anvendes, hvor de to sår kun behandlet med køretøjet. Forskellene i satserne for sårlukning mellem mus behandlet med vehikel alene, og de mus, der modtog både køretøjet og behandling kan derefter sammenlignes.
"> Sammenfattende har vi vist en relativt simpel murin model af sårheling, der udviser mange af de træk, der ses i human sårheling.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at afsløre.
Acknowledgments
Forfatterne vil gerne anerkende midler støtte fra National Sundhed og Medical Research Council (NHMRC) i Australien (Projekt Grant ID: 632.512). Louise Dunn blev støttet af en NHMRC tidlige karriere Fellowship og Christina Bursill ved National Heart Foundation Karriereudvikling Fellowship.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Press-to-seal silicone sheeting 0.5 mm thick | Invitrogen | P18178 | Cut into "donuts" with external diameter of 1cm external, 0.5 cm internal diameter |
| Biopsy punch 5 mm | Steifel | BC-B1-0500 | To outline wound area to be excised |
| Vannas scissors 8.5 cm curved | World Precision Instruments | 501232 | For wound incision and excision |
| Dumonte #7b forceps, 11 cm | World Precision Instruments | 501302 | To grip skin when creating incision and excising skin |
| Graefe forceps, serrated 10cm | World Precision Instruments | 14142 | To help attach silicone splint to skin |
| Needle holder, smooth jaws, curved, 12.5 cm | World Precision Instruments | 14132 | |
| Malis forceps, smooth, straight, 12 cm | Codman and Shurtleff, Inc (J&J) | 80-1500 | To suture the silicon rings to the skin |
| Ruler, 0.5 mm gradation | n/a | ||
| Calipers 0.25 mm gradation | Duckworth and Kent | 9-653 | To measure wound area |
| Opsite FlexiFix transparent adhesive film. 10 cm x 1 m | Smith & Nephew | 66030570 | |
| Rimadyl (Carprofen) | Pfizer | 462986 |
References
- Sen, C. K., et al. Human skin wounds: a major and snowballing threat to public health and the economy. Wound Repair. 17, 763-771 (2009).
- Sen, C. K. Wound healing essentials: let there be oxygen. Wound Repair Regen. 17, 1-18 (2009).
- Gurtner, G. C., Werner, S., Barrandon, Y.
- Lindblad, W. J. Considerations for selecting the correct animal model for dermal wound-healing studies. J. Biomater. Sci. Polym. Ed. 19, 1087-1096 (2008).
- Grose, R., Werner, S. Wound-healing studies in transgenic and knockout mice. Mol. Biotechnol. 28, 147-166 (2004).
- Reid, R. R., Said, H. K., Mogford, J. E., Mustoe, T. A. The future of wound healing: pursuing surgical models in transgenic and knockout mice. J. Am. Coll. Surg. 199, 578-585 (2004).
- Fang, R. C., Mustoe, T. A. Animal models of wound healing: utility in transgenic mice. J. Biomater. Sci. Polym. Ed. 19, 989-1005 (2008).
- Wong, V. W., Sorkin, M., Glotzbach, J. P., Longaker, M. T., Gurtner, G. C. Surgical approaches to create murine models of human wound healing. J. Biomed. Biotechnol. 2011, 969618 (2011).
- Galiano, R. D., Michaels, J. t, Dobryansky, M., Levine, J. P., Gurtner, G. C. Quantitative and reproducible murine model of excisional wound healing. Wound Repair. 12, 485-492 (2004).
- Galiano, R. D., et al. Topical vascular endothelial growth factor accelerates diabetic wound healing through increased angiogenesis and by mobilizing and recruiting bone marrow-derived cells. The American Journal of Pathology. 164, 1935-1947 (2004).
- Thangarajah, H., et al. The molecular basis for impaired hypoxia-induced VEGF expression in diabetic tissues. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 13505-13510 (2009).
- Raza, A., Bayles, C., Biebel, D. Investigation of Bacterial Growth and Moisture Handling Properties of Transparent Dressings: 3M Tegaderm Transparent Dressing, 3M Tegaderm HP Transparent Dressing, and Opsite IV3000 Transparent Dressing. Smith and Nephew Report. , (1998).
- Chung, T. Y., Peplow, P. V., Baxter, G. D. Testing photobiomodulatory effects of laser irradiation on wound healing: development of an improved model for dressing wounds in mice. Photomed. Laser Surg. 28, 589-596 (2010).
