Summary
Ett protokoll för kroniska infusioner av glukos och Intralipid hos råttor beskrivs. Denna modell kan användas för att studera effekten av näringsämnen överskott på orgel funktion och fysiologiska parametrar.
Abstract
Kronisk exponering för höga halter av näringsämnen förutsätts att påverka funktionen av flera organ och vävnader samt att bidra till utvecklingen av de många komplikationer som är förknippade med fetma och det metabola syndromet, däribland typ 2-diabetes. För att studera de mekanismer genom vilka höga nivåer av glukos och fettsyror påverkar bukspottkörtelns beta-celler och utsöndringen av insulin, har vi etablerat en kronisk näringsämne infusion i råtta. Proceduren består av catheterizing den högra halsvenen och vänster halspulsådern under narkos, så en 7-dagars återhämtningsperiod, ansluta katetrarna till pumparna med en lekare och motvikt system som gör det möjligt för djuret att röra sig fritt i buren, och infusion glukos och / eller Intralipid (en sojabönolja emulsion som genererar en blandning av cirka 80% unsaturated/20% mättade fettsyror när infunderas med heparin) för 72 timmar. Denna modell erbjuder flera fördelaktigaGES, däribland möjligheten att fint modulera målnivåer av cirkulerande glukos och fettsyror; möjlighet att infundera farmakologiska föreningar, och den relativt korta tid i motsats till dietary modeller. Den kan användas för att undersöka mekanismerna för näringsämne-inducerad dysfunktion i en mängd olika organ och för att testa effektiviteten av läkemedel i detta sammanhang.
Introduction
Kroniskt förhöjda nivåer av glukos och lipider i cirkulationen har föreslagits för att bidra till patogenesen av typ 2-diabetes genom att förändra funktionen av flera organ som är inblandade i upprätthållandet av glukoshomeostas inklusive, men inte begränsat till, den pankreatiska beta-cell (omdömet i 1). De glucotoxicity hypotesen posits att kronisk hyperglykemi förvärrar beta-cell defekter som gav upphov till hyperglykemi i första hand, vilket skapar en ond cirkel och bidra till försämring av blodsockerkontroll vid typ 2 diabetes patienter. Likaså föreslår glucolipotoxicity hypotesen att samtidigt förhöjt glukos-och lipid nivåer, som ofta observeras i typ 2-diabetes, är skadliga för betaceller.
Dechiffrera de cellulära och molekylära mekanismer av de skadliga effekterna av kroniskt förhöjda näringsämnen på bukspottkörtel betacellfunktion är nyckeln till understanding av patogenesen av typ 2-diabetes 1. För detta ändamål har ett stort antal studier som undersökt mekanismerna bakom kronisk näringsämnen överskott ex vivo i isolerade Langerhanska öarna eller in vitro i klonade, insulinutsöndrande cellinjer. Dock är översättningen av resultaten som erhållits i dessa modellsystem för hela organismen komplex, särskilt eftersom koncentrationerna av fettsyror används i odlade celler eller skär sällan matchar cirkulerande nivåer i närheten av de betacellerna in vivo 2. Å andra sidan, har de mekanismer av beta-cell-misslyckande som svar på näringsämnen överskott undersökts i gnagarmodeller av diabetes, såsom exemplifieras av Zucker Diabetic Fatty-råtta 3,4, den gerbil Psammomys obesus 5 och fettrik kost- Fed mus 6. Dessa modeller är emellertid kännetecknas av inneboende metaboliska störningar och är inte lätt mottagliga för manipulationer av blodglukosoch / eller lipidnivåer i en mer kontrollerad och mindre kronisk inställning. För att kunna ändra cirkulerande nivåer av näringsämnen i en tidsram dagar i övrigt normala djur, har vi utvecklat en kronisk infusion modell i normala råttor som gör att vi kan undersöka effekterna av lipider och glukos, ensamt eller i kombination, på fysiologiska parametrar och funktion 7,8.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Översikt: Proceduren består av catheterizing den högra halsvenen och vänster halspulsådern under narkos, så en 7-dagars återhämtningsperiod, ansluta katetrarna till pumparna med en lekare och motvikt system som gör det möjligt för djuret att röra sig fritt i buren; och infusion glukos och / eller Intralipid (en sojabönolja emulsion som genererar en blandning av cirka 80% unsaturated/20% mättade fettsyror när infunderas med heparin 9) under 72 timmar.
Ett. Canulation den högra halsvenen och den vänstra karotisartären
- Sterilisera kirurgiska instrument. Canulation slangar måste också vara kall-steriliseras med användning av ett flytande steriliseringsmedel (2,6% glutaraldehyd) före ingreppet. Doppa slangen i en autoklaverad behållare för 16-24 timmar. Skölj samt sköljas grundligt med sterilt destillerat vatten för att avlägsna alla spår av glutaraldehyd före användning.
- Väg råttan att beräknadrogdoseringar:
Karprofen 5 mg / kg: utspädning 1/10 = Kroppsvikt (g) x 0,001 ml SC (analgetikum)
Glykopyrrolat 0,01 mg / kg: utspädning 1/10 = BW (g) X 0,0012 ml SC (antikolinerg) - Söva råttan med isofluran och syre.
- Placera råttan på sin mage. Raka området bakom öronen till basen på axlarna. Placera råttan på rygg. Raka regionen under halsen till framben.
- Prep operationsområdet med klorhexidin, alkohol, och jod. Administrera droger.
- Överför råttan till det kirurgiska området.
- Använd aseptisk teknik, canulate den högra halsvenen och den vänstra halspulsådern med en PE-50 kanyl fäst till en 1 ml spruta fylld med 5 U av hepariniserad koksaltlösning. Spola kanyler med 50 U av hepariniserad koksaltlösning för att undvika koagulering under återhämtningsperioden. Använd trubbiga 23G nålar. Stäng varje kanyl med en 23G stift.
- Efter operationen, trimma cirka 2,5 mm frånbotten framtänder och placera råttan i en infusion jacka för att förhindra att canulas från att bli uppätna.
- Ge syre (1 L / min under 10 min) för att hjälpa evakuera isofluran.
- Placera råttan i en uppvärmd bur tills den är helt vaken.
- Driva fyra råttor att använda en per infusion tillstånd (tabell 1).
2. Postoperativ vård (Post-kirurgisk behandling och anslutning av katetrar)
- Väg råttorna på dag 1 och dag 2 efter operationen.
- Administrera glykopyrrolat (BW (g) x 0,00048 ml) subkutant två gånger på dag 1 efter operation och en gång på dag 2 efter operationen.
- Ytterligare stödjande behandlingar kan administreras vid behov: vätskor, värmedyna, våt kost, syrgasbehandling, analgetika, antikolinergika.
- På dag 7 efter operation, väga råttorna att beräkna flödeshastigheter för infusion.
- Anslut varje råtta till ett infusionssystem använder ett tjuder och vridbart monterad på en bur grill topp (figur 1).
- Spola kanyler med 5 U av hepariniserad saltlösning för att avlägsna blodproppar. Spola canulas gång med 50 U av hepariniserad koksaltlösning för att förhindra koagulering.
- Låt råttorna acklimatisera sig förankringstrossen och vridas i minst 24 timmar innan infusionen startas.
Tre. Infusion
- Rita 0,15 ml blod från halspulsådern hos varje råtta och mät glycemia. Spola våldsam attack kanyler. Använd 50 U av hepariniserad koksaltlösning för att förhindra koagulering i båda kanyler i varje råtta.
- Överför blodprovet till en 0,5 ml uppsamlingsrör innehållande 2% EDTA. Centrifugera vid 10.000 rpm under 2 min och frysa plasman vid -20 ° C.
- Fyll två 60 ml sprutor för varje infusion villkor som anges nedan. Placera Spruta 1 på framsidan pumpens läge och plats Spruta 2 på baksidan pumpens läge.
- Gå med varje par av lösningar tillsammans med y-kontakter och CO-EX T22 slangar som har steriliserats. Placera sprutor på en Harvard 33dubbel sprutpump.
- Ändra bur botten och ta bort all mat från buren grillen toppen.
- Väg 150 g standard chow och plats på buren grillen toppen.
- Anslut sprutorna till svängtappen på buren grillen. Spola sprutorna ordentligt för att avlägsna instängd luft från ledningarna.
- Beräkna infusionshastigheter flödet med kroppsvikten som togs innan du ansluter råttan till infusionen systemet. Priserna är beräknade med en Microsoft Excel-fil som konverterar hastigheten glukosinfusion (GIR) i ml / tim.
- Ställ pumpen att administrera flödeshastigheter för 60 ml sprutor enligt tillverkarens inställningar. Ange hastigheten för spruta 1 (främre spruta) och priset för spruta 2 (back spruta).
- Starta pumpen.
4. Övervakning
- Efter start av pumpen, kontrollera att det inte läcker från det vridbara eller från kanyler och att infusionen slangen inte är vriden. Kontrollera också att det inte finns några luftbubblor islangen.
- Efter 3 timmar av infusion, ta ett blodprov för att övervaka glycemia. Upprepa efter 6, 24, 48, och 72 timmar för infusion. Som en försiktighetsåtgärd glycemia också övervakas efter 30, 34, 54, och 60 hr av infusionen. Blodglukos kan mätas med hjälp av en droppe av helblod med användning av en bärbar glukos monitor. Detta begränsar den mängd blod dras under infusionen och undviker därför att väsentligt förändra blodvolym och / eller hematokrit.
- Hastigheten för spruta 1 justeras utifrån glycemia värden att hålla blodsockret på 220-250 mg / dl. Hastigheten för spruta 2 ändras inte under 72 timmar för infusion eftersom fria fettsyror bibehålls vid 1 mmol / L.
- Infusion villkor är ihopkopplade så att volymen mottagits för kontroll djuren är lika med volymen mottagits för försöksdjuren (tabell 1).
- Efter 24 timmar av infusion, ändra burens botten och väga maten kvar i buren grillen. Returnera uppätet delen to buren grillen. Upprepa efter 48 timmar.
- Refill sprutor dagligen efter behov under 72 timmar för infusion.
- Under infusionen, alltid iaktta råttan efter tecken på inflammation eller obehag. Administrera lämplig vård om det behövs.
Fem. Post-infusion Eutanasi
- Efter 72 h av infusion, råttor bedövas intravenöst med 0,5 ml av en ketamin / xylazin cocktail (182 mg / kg ketamin och 11,6 mg / kg av xylazin utspädd 1:02 med 0,9% NaCl).
- The toe-nypa reflex används för att verifiera nivån av anestesi. Ytterligare narkosmedel administreras som behövs.
- När råttan är sövda, är bukhålan öppnas med kirurgisk sax. Råttan tömdes på blod genom att rita 10-15 ml blod i en spruta från aorta eller vena cava.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ut ur en serie av 42 råttor som genomgick kirurgi, var 5 råttor förlorade under den postoperativa perioden och 1 råtta förlorades under infusionen, vilket motsvarar en total framgång på 86%. Den genomsnittliga kroppsvikten av de 37 råttorna som slutligen infunderas var 608 ± 5 g före operation och 588 ± 6 g vid initieringen av infusionen (medelvärde ± SE, n = 37, p <0,0001 med parat t-test). Följande representativa resultat erhölls i två infusion grupper:. Saline (SAL) och glukos + Intralipid (GLU + IL) Figurerna 2A och 2B visar blodglukos och fettartade nivåer syra, respektive, under 72-hr infusionsperioden. Genom design, är glukosnivåerna bibehållas runt 220-250 mg / dl under hela infusionen, bygger på regelbundna mätningar och justeringar av glukos infusionshastigheten (GIR) som visas i figur 3. Gnagare har en stark förmåga att kompensera för glukos infusion genom att öka insulinproduktion SEcretion. Därför måste GIR ökas under infusionen för blodglukosnivåer skall hållas på en relativt steady-state. Ändå blodsockernivåer tenderar att minska mot slutet av infusionen, såsom ses i figur 2A. Eftersom djuren är infunderas med kalori näringsämnen, minskar de spontant deras födointag (Figur 4).
| Infusion skick | Spruta 1 (främre läget) | Spruta 2 (bakre läget) |
| 1 | Dextros 70% | Saltlösning |
| 2 | Saltlösning | Saltlösning |
| 3 | Dextros 70% | Intralipid 20% + Heparin 20U/ml |
| 4 | Saltlösning | Intralipid 20%% + Heparin 20U/ml |
Tabell 1. Infusion regimer.
Figur 1. Fotografera av infusionen systemet visar råtta med katetrarna på plats och tjuder, snurr, och motvikt arm monterad på buren grillen.
Figur 2. . Plasma nivåer av glukos (A) och fria fettsyror (B) under infusion av saltlösning (SAL) eller samtidig infusion av glukos och Intralipid (GLU + IL) i 6-månader gamla Wistarråttor Data är medelvärden ± SEM av 3 - fyra djur i varje grupp.
Figur 3 "src =" / files/ftp_upload/50267/50267fig3.jpg "/>
Figur 3. Justering av glukos infusionshastigheten under samtidig infusion av glukos och Intralipid (GLU + IL) i 6-månader gamla Wistarråttor. Data är medelvärde ± SEM för 4 djur.
Figur 4. Genomsnittliga dagliga födointaget av 6-månader gamla Wistarråttor infunderas med koksaltlösning (SAL) eller infunderas tillsammans med glukos och Intralipid (GLU + IL). Uppgifterna är medelvärde ± SEM av 3-4 djur i varje grupp. ** P <0,01.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Även ett antal tidigare studier har anställt kroniska infusioner av glukos (t.ex. 10-15) eller lipider (t.ex. 16,17) i gnagare, till vår kunskap kombinerad infusion av båda bränslena har endast rapporterats i möss 18. Den kroniska infusion modell som presenteras här ger flera fördelar för att studera effekterna på näringsämnen överskott på en mängd olika biologiska funktioner hos råttor. Först, innebär det inte genetiskt feta gnagare, och sedan gemensamt fetma hos människor är polygenisk 19, resultaten är därför mer sannolikt att vara relevant för effekterna av näringsämnen överutbud i den allmänna befolkningen. Det andra har den här modellen en möjlighet att testa effekterna av olika näringsämnen (särskilt socker eller fett) på olika cirkulerande nivåer, genom att ändra deras natur och infusionen flödet. Tredje, möjliggör IV administreringsväg samtidig infusion av föreningar eller läkemedel tillsammans med Nutrients 20. Slutligen, är det relativt kort tidsram av experimentet (72 timmar vs veckor för fettrik inducerade kost modeller) kostnads-och tidseffektiv för prekliniska studier.
Denna modell har även vissa nackdelar och begränsningar. Först som alla kirurgiska modell kräver välutbildad och kompetent personal inom aseptisk kirurgi. Det andra, som nämnts i Representativa resultat avsnittet djuren tenderar att kompensera för glukos infusion genom att öka insulinproduktion, vilket kräver frekvent kontroll av blodsockernivåerna och justeringar av GIR att bibehålla målet blodsockernivåer under hela infusionen. Det tredje är förfarandet inte lätt att tillämpa till möss, som skulle krävas för att kunna använda den i genetiskt modifierade djur. Enligt vår erfarenhet är kateterisering av både halsvenen och halspulsådern hos möss i tekniskt utmanande och enklaste metoden för dessa mindre djur att placera en jugular kateter för infusionen och prov från ett perifert kärl. Detta är dock avsevärt begränsar volymen och frekvensen av provtagningen under infusionen.
Med tanke på inriktningen av vårt laboratorium har vi använt denna modell för att studera mekanismerna för glucolipotoxicity i pankreas beta-celler 7,8. Däremot kan den tillämpas för att studera effekterna av näringsämnen överskott i alla vävnader och organ, såsom, men inte begränsat till, hjärtat 21, skelettmuskel, 22, och lever 23.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Vincent Poitout är medgrundare av och fick forskningsavtal från Bêtagenex Inc., ett avtal forskningsorganisation som erbjuder infusionen modellen som presenteras i den här artikeln som en kommersiell tjänst.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av National Institutes of Health (R01DK58096 till Vincent Poitout). Vincent Poitout innehar Kanada forskning ordförande i Diabetes och bukspottkörtel betacellfunktion. Bader Zarrouki fick postdoktorala stipendier från Merck och Eli Lilly. Ghislaine Fontes fick stöd av ett post-doc stipendium från kanadensiska Diabetes Association.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Saline 0.9% | BD | JB1324 | |
| Dextrose 70% | McKesson | ||
| Intralipid 20% | Fresenius Kabi | JB6023 | |
| Metricide (Glutaraldehyde 2.6%) | Metrex | 11-1401 | |
| Heparin Sodium 10,000 USP u/ml | PPC | ||
| Carprofen | Metacam | ||
| Glycopyrrolate | Sandoz | ||
| Isoflurane | Abbott | ||
| Chlohexidine 2% | |||
| Alcohol 70% | |||
| Iodine | |||
| PE-50 | BD | 427411 | |
| CO-EX T22 | Instech Solomon | BCOEX-T22 | |
| Connector 22G | Instech Solomon | SC22/15 | |
| Swivel 22G | Instech Solomon | 375/22PS | |
| Y-Connector 22G | Instech Solomon | ||
| Counterbalance and arm | Instech Solomon | CM375BP | |
| 23 G blunted needles | Instech Solomon | LS23 | |
| 23 G canulation pins | Instech Solomon | SP23/12 | |
| Tethers (12 inch) | Lomir | RT12D | |
| Infusion jackets | Lomir | RJ01, RJ02, RJ03, RJ04 | |
| (SM-XL) | |||
| Tether attachment piece | Lomir | RS T1 | |
| 60 ml syringe | BD | 309653 | |
| 1 ml syringe | BD | 309602 |
References
- Poitout, V., Robertson, R. P. Glucolipotoxicity: fuel excess and beta-cell dysfunction. Endocr. Rev. 29, 351-366 (2008).
- Poitout, V., et al. Glucolipotoxicity of the pancreatic beta cell. Biochim. Biophys. Acta. 1801, 289-298 (2010).
- Unger, R. H. Minireview: weapons of lean body mass destruction: the role of ectopic lipids in the metabolic syndrome. Endocrinology. 144, 5159-5165 (2003).
- Harmon, J. S., Gleason, C. E., Tanaka, Y., Poitout, V., Robertson, R. P. Antecedent hyperglycemia, not hyperlipidemia, is associated with increased islet triacylglycerol content and decreased insulin gene mRNA level in Zucker diabetic fatty rats. Diabetes. 50, 2481-2486 (2001).
- Bachar, E., Ariav, Y., Cerasi, E., Kaiser, N., Leibowitz, G. Neuronal nitric oxide synthase protects the pancreatic beta cell from glucolipotoxicity-induced endoplasmic reticulum stress and apoptosis. Diabetologia. 53, 2177-2187 (2010).
- Peyot, M. L., et al. Beta-cell failure in diet-induced obese mice stratified according to body weight gain: secretory dysfunction and altered islet lipid metabolism without steatosis or reduced beta-cell mass. Diabetes. 59, 2178-2187 (2010).
- Hagman, D. K., et al. Cyclical and alternating infusions of glucose and intralipid in rats inhibit insulin gene expression and Pdx-1 binding in islets. Diabetes. 57, 424-431 (2008).
- Fontes, G., et al. Glucolipotoxicity age-dependently impairs beta cell function in rats despite a marked increase in beta cell mass. Diabetologia. 53, 2369-2379 (2010).
- Stein, D. T., et al. Essentiality of circulating fatty acids for glucose-stimulated insulin secretion in the fasted rat. J. Clin. Invest. 97, 2728-2735 (1996).
- Leahy, J. L., Cooper, H. E., Weir, G. C. Impaired insulin secretion associated with near normoglycemia. Study in normal rats with 96-h in vivo glucose infusions. Diabetes. 36, 459-464 (1987).
- Hager, S. R., Jochen, A. L., Kalkhoff, R. K. Insulin resistance in normal rats infused with glucose for 72 h. The American Journal of Physiology. 260, 353-362 (1991).
- Laybutt, D. R., Chisholm, D. J., Kraegen, E. W. Specific adaptations in muscle and adipose tissue in response to chronic systemic glucose oversupply in rats. The American Journal of Physiology. 273, E1-E9 (1997).
- Jonas, J. C., et al. High glucose stimulates early response gene c-Myc expression in rat pancreatic beta cells. The Journal of Biological Chemistry. 276, 35375-35381 (2001).
- Tang, C., et al. Glucose-induced beta cell dysfunction in vivo in rats: link between oxidative stress and endoplasmic reticulum stress. Diabetologia. 55, 1366-1379 (2012).
- Alonso, L. C., et al. Glucose infusion in mice: a new model to induce beta-cell replication. Diabetes. 56, 1792-1801 (2007).
- Magnan, C., Gilbert, M., Kahn, B. B. Chronic free fatty acid infusion in rats results in insulin resistance but no alteration in insulin-responsive glucose transporter levels in skeletal muscle. Lipids. 31, 1141-1149 (1996).
- Goh, T. T., et al. Lipid-induced beta-cell dysfunction in vivo in models of progressive beta-cell failure. Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. 292, 549-560 (2007).
- Pascoe, J., et al. Free fatty acids block glucose-induced beta-cell proliferation in mice by inducing cell cycle inhibitors p16 and p18. Diabetes. 61, 632-641 (2012).
- Bell, C. G., Walley, A. J., Froguel, P. The genetics of human obesity. Nature Reviews. Genetics. 6, 221-234 (2005).
- Fontes, G., Hagman, D. K., Latour, M. G., Semache, M., Poitout, V. Lack of preservation of insulin gene expression by a glucagon-like peptide 1 agonist or a dipeptidyl peptidase 4 inhibitor in an in vivo model of glucolipotoxicity. Diabetes Res. Clin. Pract. 87, 322-328 (2010).
- Crawford, P. A., Schaffer, J. E. Metabolic stress in the myocardium: Adaptations of gene expression. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. , (2012).
- Kewalramani, G., Bilan, P. J., Klip, A. Muscle insulin resistance: assault by lipids, cytokines and local macrophages. Curr. Opin. Clin. Nutr. Metab Care. 13, 382-390 (2010).
- Cusi, K. Role of obesity and lipotoxicity in the development of nonalcoholic steatohepatitis: pathophysiology and clinical implications. Gastroenterology. 142, 711-725 (2012).
