In vivo Makrofag Imaging Brug MR Målrettet kontrastmiddel til Longitudinal Evaluering af septisk arthritis

Summary

Vi viser, hvordan du udfører makrofag MR billeddannelse ved hjælp ultrasmall superparamagnetisk kontraststof (USPIO) i septisk arthritis, så en indledende og langsgående

Abstract

Makrofager er nøgle-celler i indledningen, udvikling og regulering af den inflammatoriske respons på bakteriel infektion. Makrofager intensivt og i stigende grad rekrutteret septiske samlinger fra de tidlige faser af infektion og infiltrationen formodes at relatere engang effektiv fjernelse af patogener opnås. Evnen til at identificere in vivo makrofag aktivitet i en inficeret fælles kan derfor tilbyde to primære formål: tidlig påvisning af akut synovitis og overvågning af behandlingen.

In vivo invasiv påvisning af makrofager kan udføres med magnetisk resonans med jern nanopartikler såsom ultrasmall superparamagnetisk jernoxid (USPIO). Efter intravaskulær eller intraartikulær indgivelse er USPIO specifikt phagocytized af aktiverede makrofager, og på grund af deres magnetiske egenskaber, inducere signal ændringer i væv frembyder makrofaginfiltration. A quantitative evaluering af infiltrere er muligt, da området med signaltab (antal mørke pixel) observeret på gradient ekko MR-billeder efter partikler injektion er korreleret med mængden af ​​jern i vævet og derfor afspejler antallet af USPIO-loaded celler.

Vi præsenterer her en protokol til at udføre makrofag imaging ved hjælp USPIO-MR billeddannelse i en dyremodel for septisk arthritis, så en indledende og langsgående in vivo noninvasive evaluering af makrofager infiltration og en vurdering af behandlingen handling.

Introduction

Magnetic resonance imaging (MRI) anses for at være de billeddannende modalitet valg for demonstration af smitsomme synovitis på grund af sin høj rumlig opløsning og blødt væv kontrast. Signal observerede ændringer på MRI i gigt lav T1 og høj T2 signal afspejler den øgede tilstedeværelse af ekstracellulært vandindhold og en markant forbedring efter gadolinium-baseret-kontrastmiddel administration, der er forenelige med histologisk fund af øget vaskularisering på grund af vasodilation og angiogenese ^1. Ikke desto mindre, MR er ofte ude af stand til at demonstrere løsningen af infektion under antibiotikabehandling som persistente ekstraudstyr kan observeres i leddene i patienter med klinisk og biologisk helbredt septisk arthritis grund vedvarende forstørret ekstracellulære rum (granulationsvæv, fibrotisk ar) ^2.. Udover ekstracellulære ændringer massivt inflammatoriske celler, herunder en intens rekruttering af makrofager infiltrere ipåvirket synovia. Makrofager spiller en vigtig rolle i både den akutte og kroniske fase af bakterieinfektion ^3.. De inducerer den inflammatoriske reaktion kræves for at udrydde patogene mikroorganismer, og koordinere betændelse opløsning, som makrofag-induceret inflammation fortsætter så længe nekrotiske væv ikke er fjernet, forhindrer reparation begynde ^4.. Således kan reduktionen af ​​makrofaginfiltration inden inficeret synovia efter en effektiv terapi være en pålidelig indikator for løsningen af ​​infektionen. Cellular billeddannelse er i stand til at demonstrere specifik cellulær infiltration inde patologisk væv. Specifik makrofag MR billeddannelse ved hjælp målrettet kontrastmiddel er blevet bredt undersøgt og har demonstreret sin evne til at vise fælles betændelse eller infektion ^5-7. Efter intravenøs injektion, er sådanne målrettede kontrastmidler, såsom USPIO (ultrasmå superparamagnetiske jernoxider) partikler taget op af fagocytiske celler, såsom makrofager og,på grund af deres magnetiske egenskaber, inducere signal ændringer i væv frembyder makrofaginfiltration ^8.. Det langsgående opfølgning af de MR-signal skifter terapi giver mulighed for en in vivo invasiv vurdering af makrofaginfiltration, og en reduktion af USPIO loaded-makrofager relaterede signal ændringer ville vise terapi succes. Formålet med denne rapport er at præsentere, hvordan du udfører makrofag MR billeddannelse til ikke-invasiv overvågning septisk arthritis ved at demonstrere en reduktion af makrofaginfiltration i synovia.

Protocol

Alle procedurer, der involverer dyr emner er blevet godkendt af University Hospital Institutional Animal Care udvalg.

1.. Intraartikulær Bakteriel Inokulation

1. Før injektion, bedøver kaniner ved hjælp af intramuskulær injektion af ketamin (30 mg / kg legemsvægt) blandet med xylazin (4 mg / kg) i erector spinae muskel. Sørg dyr er fuldt bedøvet ved at kontrollere, at de undlader at reagere på pote knibe. Denne protokol giver tilstrækkelig anæstesi til intraartikulær injektion af knæleddet. Placer dyrene under iltmaske under anæstesi.
2. Shave dyrenes knæet. Forbered knæet til aseptisk injektion med 3 skiftende servietter af povidon-jod krat og alkohol efterfulgt af anvendelse af povidon-jodopløsning.
3. Manuelt identificere patellarsenen som en elastisk struktur på den forreste del af knæet ved hjælp af en steril nål hætte som vist eller en steril sonde.
4. Injicere hver knæ med 1 ml af en bakteriel suspension af Staphylococcus aureus (Neumann stamme) ved en koncentration på 10 ⁶ UFC / ml. En injektion uden modstand bekræfter intraartikulære placering af spidsen af ​​nålen.
5. Efter injektion procedurer, holde dyret under konvektive kilde for at undgå varmetab og overvåge respirationsfrekvens ved at observere bevægelse af brystet. Når vågen, holde dyr i bure med fri adgang til mad og vand.
6. Styre smerte ved indgivelse af en intramuskulær injektion af 0,1 mg / kg buprenorphin hver 8. time.
7. Klinisk observere kaniner hver dag, overvågning forbrugte mængder af mad og vand, vægttab, temperatur og generel adfærd.
8. Til billedet den akutte fase af infektionen udføre den første MR billeddannelse session, så snartsom et dyr udviser et væsentligt vægttab (10%) generelt dette sker efter ca 2 dage.
9. Hvis intravenøs administration af lægemidlet er nødvendig, før MRI-undersøgelse, kan en auricular veneadgang være installeret (se nedenfor).

2.. MRI-undersøgelse

Når imaging levende dyr, en omhyggelig dyr installation er et centralt element for at sikre dyrenes komfort og optimal anæstesi. Dette vil gøre det muligt for de bedste imaging resultater og sikre reproduktiv billede erhvervelse for longitudinelle studier. På grund af størrelsen af ​​dyret, anvendelse af en klinisk størrelse MR enhed (1,5 T eller 3 T) er mest egnet. 8-kanals klinisk knæ spole anvendes som den giver passende opløsning og kontrast-støj-forholdet for kaninknæleddet udforskning.

1. Før installation på billedbehandlingssystem installere en perifer venøs adgang gennem en auricular vene. Denne adgang vil tjene til at injicere kontrastmidlet.
   1. Shave og desinficere øret.
   2. Sæt en 25 G kateter inde i laterale auricular vene.
   3. Vurdere permeabiliteten ved injektion af 1 ml sterilt fysiologisk serum.
   4. Bevar kateteret med selvklæbende aflytning.
2. Bedøver dyr ved hjælp af intramuskulær injektion af ketamin (30 mg / kg legemsvægt) blandet med xylazin (4 mg / kg). Dyrene er fuldt bedøvet, når de undlader at reagere på pote knibe. Placer en ansigtsmaske på kaninen, giver det ilt med en strømningshastighed på 200 ml / min.
3. Når det er fuldt bedøvet, dyr til MR billeddannelse enhed. Place dyr således at knæene er placeret i centrum af MR spole. Placer dyrenes ben i fuldstændig forlængelse, således at den lange akse af skinnebenet er parallel med MR-billeddannelse enhed tabel. Brug velcrobånd eller sandsække for at bevare optimal benstilling.
4. Cardio-respiratorisk overvågning af dyrene er ikke nødvendig, daanæstesi protokol tillader dybe anæstesi på spontan vejrtrækning, men dyr skal dækkes for at undgå anæstesi-induceret varmetab.
5. MR protokol er beskrevet i Tabel 1.. Den gennemsnitlige tid for total overtagelse herunder en optimal installation er omkring 20 min.
6. Udfør MR scanning i forskellige planer. Ikke desto mindre er den tværgående plan knæene (vinkelret på tibia) er henvisningen planen, da det sikrer anatomisk reproducerbarhed imageposition for sekventielle langsgående undersøgelser og giver optimal korrelation med histologiske skiver.
7. Ved afslutningen af ​​ikke-forøgede sekvenser, injicere UPSIO kontrastmiddel gennem øret veneadgang. Langsomt administrere jernoxid partikler i en enkelt dosis på 150 pmol Fe / kg. Skyl kateteret ved injektion af 1 ml sterilt fysiologisk serum.
8. Gentag den forbedrede GRE vægtede sekvens 24 timer efter injektionen. Denne forsinkelse tillader partikler, der skal phagocytized vedmakrofager.
9. For langsgående studier, som evaluerede narkotika effekt (antibiotika, steroider, anti-makrofag antistoffer, osv.), Gentag sekventielle MR-undersøgelser ved hjælp af den ovenfor beskrevne protokol.

3.. Image Analysis

1. For langsgående evaluering udføre målinger på samme anatomiske niveau og definere en let identificerbar vartegn. For eksempel er erhvervelse ved det aksiale plan, hvor den største diameter af patella observeres en pålidelig måde at opnå reproducerbar måling (figur 1).
2. Udføre billedanalyse under anvendelse af en DICOM-baseret software (såsom OsiriX) eller billedbehandling software (ImageJ).
3. Brug ImageJ software segmenteringen af ​​synovial område, der demonstrerer signaltab på USPIO-enhanced GRE T2-vægtet billede ved hjælp af "irregulær area" tegneværktøj udføre. Når synovium med mørk signal er skitseret, så klik på "Analyze" for at få området /antal pixels (figur 2).

Representative Results

På ikke-forøgede billeder, præsenterer synovium af inficerede knæ diffus hævelse af mellemliggende signal, der er ikke skelnes fra omgivende bløde væv, mens lårben og patella fremstår som lave signalværdier strukturer (figur 1).

På USPIO-forbedrede billeder, vil 24 timer efter kontrastmidlet administration, synovial område indeholdende USPIO-loaded makrofager demonstrere signaltab (figur 1 og 2).

Makrofaginfiltration inden synovium kan påvises ved hjælp af specifikke immunfarvning (Figur 3). Perls 'Prussian blåsplint kan detektere jernpartikler, der vises som blå prikker (figur 4).

	GRE T2 vægtet
Gentagelse tid (msek)	450
Ekkotid (msek)	4	Flipvinkel	30
Turbo faktor
Fat undertrykkelse
Slice tykkelse (mm)	1.5
Interval hul	0
Synsfelt (mm)	70
Matrix	448 x 360
Båndbredde	80
Signaler erhvervede	2
Scan længde	3'10

Tabel 1. Eksempel på parametre GRE T2-vægtede MR-sekvensen på en 3T MR enhed.

Figur 1. Axial GRE T2-vægtede billeder af en kanin knæ på akutfase af infektion, før (A) og 24 timer efter (B) intravaskulær administration af USPIO, Billeder opnås på niveauet af patella (p) og lårbenet (F). På den ikke-forstærket billede (A), synovium er fortykket (pil) og præsenterer en homogen mellemliggende signal utydelig fra de omgivende bløde væv. Efter USPIO administration (B), synovium vises nu som et båndlignende område af massivt mørke signaler (pilespids) på grund af tilstedeværelsen af USPIO-loaded makrofager. (Genoptrykt fra Lefevre S. et al. ⁹ med tilladelse).

Figur 2.. Segmentering og fastlæggelse af synovial område, der præsenterede signaltab hjælp ImageJ.

Figur 3.. Mikrofotografi af specifik makrofag immunfarvning demonstrerer den intense infiltration af makrofager i den inficerede synovium (pil). (RAM 11 immunfarvning, oprindelig forstørrelse 40X).

Figur 4.. Photomicrograph (Perls 'preussisk blå plet, original forstørrelse 40X) viser flere blå-farvede celler correspondig de USPIO-belastede makrofager (pil). (Gengivet fra Lefevre S. et al. ⁹ med tilladelse).

Discussion

Mens uspecifik gadolinium-baserede kontrastmidler give oplysninger om mængden og perfusion af det ekstracellulære rum, makrofag billeddannelse ved USPIO-MR giver en præcis anatomisk lokalisering og en kvalitativ evaluering af makrofaginfiltration inden inficerede synovium uden brug af væv prøveudtagning ^9.. På grund af deres høje følsomhed, kan USPIO udvise endog subtile celleinfiltratet stede i de tidlige faser af infektionen. Under vellykket antibiotikabehandling, som de patogener gradvis fjernes denne infiltration anses at falde, hvilket fører til en reduktion af USPIO optagelse i synovium. Da området på mørke signaler er korreleret til tissular jernindhold, kan synovial signal efter USPIO administration betragtes som en biomarkør, en kvantitativ repræsentation af cellulær infiltration som kan være langsgående evalueret ^10. Desuden, i og kontrast til andre billeddannende modaliteter såsom optical imaging eller isotop billedbehandling, cellulære MR billeddannelse har evnen til at generere høj opløsning anatomiske billeder, der tillader præcis lokalisering af celler-relaterede signal ændringer.

Makrofag billeddannelse tillader estimering af cellens tilstedeværelse og fordeling i vævet af interesse uden behov for væv prøveudtagning. Det undgår derfor to største ulemper ved gentagne væv prøvetagning ofte kræves i in vivo biologiske undersøgelser, der er invasionsevne og modifikation af nativ væv normal biologi. Desuden kan sekventiel væv prøvetagningen ikke mulig i små dyr, der ikke tåler gentagne stressende procedurer, udelukker langsgående evaluering. I modsætning in vivo opfølgning billeddannelse af makrofag indhold inden et væv ved hjælp af sekventiel USPIO-MR-scanning nemt kan anvendes til små dyr for langsgående overvågning af antibiotikabehandling i infektionssygdomme, anti-inflammatorisk behandling i modeller af Noninsmitsom arthritis, eller behandling i enhver makrofager-involverede sygdomme.

Når modellen af interesse er valgt (arthritis, septisk synovitis osv.) Er kontraststof administration let udføres via langsom intravaskulær injektion og er i almindelighed ikke er teknisk udfordrende. Den største begrænsning af MR cellulær billeddannelse ved hjælp USPIO kontrastmiddel er behovet for gentagen scanning 24 hr injektion, denne forsinkelse tillader specifik fagocytose af makrofager ^5-7. Derfor, for at få sammenlignelige billeddata, er en præcis dyr installation inden MR enhed obligatorisk. Det er vores erfaring, observerede vi, at dyr installation i bugleje i MR spole forbundet med lavere ben komplet forlængelse opnås ved klæbende tape tilladt yderst reproducerbare og sammenlignelige billeder.

Vi præsenteres i denne rapport, hvordan du nemt mærke in vivo makrofager med USPIO, udnytter deres naturligefagocytære aktivitet. Selv om en yderligere indledende ex vivo procedure kunne være påkrævet (for at tillade kontraststof indtrængen i ikke naturligt fagocytceller), kan cellemærkning med meget følsomme MR-kontrastmiddel, såsom jernoxidpartikler anvendes på andre celletyper, såsom lymfocytter, polymorfkernede leukocytter eller mastceller. Cellular MR scanning kan derfor være en meget interessant redskab til noninvasively undersøgelse af sekventiel rekruttering af alle celletyper involveret i infektioner relateret inflammation, og for at vurdere virkningen af ​​såvel generelle som celle-målrettede behandlinger.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name of Reagent/Material	Company	Catalog Number	Comments
P904	Guerbet		Dose: 150 μmol Fe/kg
Ketamine (500 mg/ml ketamine)	Virbac		Dose: 30 mg/kg
Rompun (20 mg/ml Xylazine)	Axience		Dose: 4 mg/kg
Buprenorphine	Vetoquinol		Dose: 0.1 mg/kg/8 hr
BD 22 G, 1 inch	BD Biosciences	381423
BD 25 G, 5/8 inch	BD Biosciences	305122