敗血症性関節炎の経時的評価のためにMRターゲット造影剤を用いたin vivoイメージングのマクロファージ

Summary

我々は最初のと縦ができ、化膿性関節炎で超小型、超常磁性造影剤（USPIO）を使用してマクロファージMRイメージングを実行する方法を示し

Abstract

マクロファージは、開始、開発、細菌感染に対する炎症反応の調節に重要な細胞である。マクロファージは、ますます集中感染の初期段階から敗血症関節で募集され、浸潤が病原体の効率的な除去が得られる一度退縮することになっている。治療の急性滑膜炎及び監視の早期発見：感染した関節インビボマクロファージ活性を識別する能力は、したがって、二つのアプリケーションを提供することができる。

インビボでマクロファージの非侵襲的検出は、例えば、超小型、超常磁性酸化鉄（USPIO）などの鉄ナノ粒子を用いた磁気共鳴イメージングを行うことができる。 USPIOが具体的に活性化マクロファージによる貪食、そして、それらの磁気特性に起因している血管内または関節内投与後、マクロファージ浸潤を提示組織における信号の変化を誘導する。 quantitativ粒子噴射が組織内の鉄の量と相関するので、USPIO負荷された細胞の数を反映した後、信号損失を有する領域（暗い画素数）は勾配エコーMR画像で観察されるように浸潤の電子評価は、実現可能である。

我々は、マクロファージの浸潤および治療 ​​作用の評価のインビボで非侵襲的評価の初期及び長手方向を可能にする、ここで敗血症性関節炎の動物モデルにおいてUSPIOが強化されたMRイメージングを用いたマクロファージ撮影を行うためのプロトコルを提示する。

Introduction

磁気共鳴イメージング（MRI）は、その高い空間分解能及び軟組織コントラストに起因する感染性滑膜炎の実証のための選択の撮像モダリティであると考えられる。血管拡張と血管新生¹に増加した血管のせいでの組織学的所見と一致して関節炎低いT1および細胞外の水分含量の増加存在を反映して高いT2信号、及びガドリニウムベース·造影剤投与後の顕著な増強をMRIで観察された信号の変化、。それにもかかわらず、MRIは拡大された細胞外空間（肉芽組織、線維性瘢痕^）2の持続のために臨床的および生物学的に治癒した敗血症性関節炎患者の関節で観察することができ、多くの場合、永続的な拡張として抗生物質治療中に感染の分解能を発揮することができません。細胞外の変化に加えて、マクロファージの強烈な動員を含む炎症性細胞が大量に潜入滑液をフェクト。マクロファージは細菌感染³の急性および慢性期の両方で重要な役割を果たす。彼らは、病原微生物を根絶するために必要な炎症反応を誘発し、マクロファージ誘発性炎症が^4を開始^し修復を防止、壊死組織が ​​除去されない限り解消されないように、炎症の解像度を調整します。したがって、効率的な治療後に感染した滑液内のマクロファージ浸潤の減少は感染の分解能の信頼できる指標となることができます。細胞イメージングは​​、病理組織内の特定細胞浸潤を発揮することができます。標的造影剤を使用して、特定のマクロファージMRイメージングが広く検討されており、関節の炎症や感染^5-7を実証する能力を実証した。静脈内注射、例えばUSPIO（超小型、超常磁性酸化鉄）粒子はマクロファージなどの食細胞によって取り込まれるような標的造影剤と、後その磁気特性のために、マクロファージ浸潤^8を提示する組織における信号変化を誘導する。 生体侵襲マクロファージ浸潤の評価、及びUSPIOロードされ、マクロファージの削減関連信号変化における治療の成功を証明するであろうため、これらのMR信号の変化治療のフォローアップ縦が可能になります。この報告書の目的は、非侵襲的に滑膜内のマクロファージ浸潤の低減を示すことによって、敗血症性関節炎を監視するマクロファージMRイメージングを実行する方法を提示することである。

Protocol

動物を対象とするすべての手順は、大学病院制度動物ケア委員会によって承認されている。

1。関節内細菌接種

1. 注射前に、脊柱起立筋の筋肉内キシラジン（4 mg / kg体重）と混合ケタミンの筋肉内注射（30 mg / kg体重）を用いてウサギを麻酔。動物は、彼らは足のピンチに反応しないことをチェックすることによって、完全に麻酔であることを確認してください。このプロトコルは、膝関節の関節内注射のために十分な麻酔を提供します。麻酔時に酸素マスクの下に動物を配置します。
2. 動物の膝を剃る。ポビドンヨード溶液の塗布に続いポビドンヨードスクラブとアルコールの3交互ワイプによって無菌注射のために膝を準備します。
3. 手動で図のように滅菌針キャップまたは滅菌プローブを用いた膝の前方側面に弾性構造として膝蓋腱を識別します。
4. 10 ⁶の濃度UFC / mlで黄色ブドウ球菌の細菌懸濁液（ノイマン株）1mlでそれぞれ膝を注入。抵抗なく注入は、針の先端の関節位置を確認します。
5. 注射の手続きの後、熱損失を回避し、胸の動きを観察することによって、呼吸数を監視するために対流ソースの下に動物を保つ。いったん目を覚まし、食料と水への無料アクセスをケージに動物を飼う。
6. 8時間毎に0.1 mg / kgをブプレノルフィンの筋肉内注射を投与することによって痛みを管理する。
7. 臨床的に食物および水、体重減少、温度、および一般的な挙動の消費量を監視して、毎日ウサギを観察する。
8. 画像への感染の急性期には、すぐに最初のMRイメージングセッションを行う動物としてかなりの体重減少（10％）を提示、一般的に、これは約2日後に発生します。
9. 静脈内薬物投与はMRI検査前に必要とされている場合は、耳介静脈アクセスが（参照以下）をインストールすることができます。

2。 MRI検査

イメージングは​​動物を生きているときは、慎重に動物のインストールでは、動物の快適性と最適な麻酔を確保するための重要な機能です。これは最高のイメージング結果を可能にし、縦断的研究のための生殖の画像取得が保証されます。動物の大きさに起因し、臨床サイズのMR部（1.5 T 3またはT）の使用が最も好適である。それは、ウサギの膝探査するのに適した解像度とコントラスト対ノイズ比を提供するように8チャンネル臨床膝コイルが使用される。

1. イメージング·システムにインストールする前に、耳介静脈を通じて末梢静脈アクセスをインストールしてください。このアクセ​​スは、造影剤を注入するのに役立つであろう。
   1. 剃ると耳を消毒。
   2. 横耳介静脈の内側25 Gカテーテルを挿入します。
   3. 1ミリリットル滅菌生理血清を注射することにより浸透性を評価する。
   4. 接着タッピングとカテーテルを維持。
2. キシラジン（4 mg / kg体重）と混合ケタミンの筋肉内注射（30 mg / kg体重）を用いて動物を麻酔。彼らは足のピンチへの応答に失敗した後の動物は完全に麻酔する。 200ml /分の流量でそれを酸素を与え、ウサギに顔のマスクを配置する。
3. 一度完全に麻酔、MRイメージング装置に動物を取る。膝がMRコイルの中心部に位置されるように動物を配置します。脛骨の長軸はMR撮像部テーブルと平行になるように、完全な拡張で動物の足を置く。最適な足の位置を維持するために、ベルクロファスナーや砂袋を使用してください。
4. 心肺動物のモニタリングは、次のようにする必要はありません麻酔プロトコルは、自発呼吸に深い麻酔を可能にしますが、動物は麻酔誘発性熱損失を避けるために、カバーされなければならない。
5. MRプロトコルは、表1に詳述されている。最適なインストールを含む総取得のための平均時間は約20分です。
6. 異なる平面でMRイメージングを実行します。それはシーケンシャル縦検査用画像位置の解剖学的再現性を確保し、組織学的スライスを最適な相関が許す限りそれにもかかわらず、膝（脛骨に直交）の横断面は参考プランです。
7. 非造影シーケンスの完了時に、耳介静脈アクセスを介してUPSIO造影剤を注入する。ゆっくり150モルのFe / kgを単回用量で酸化鉄粒子を管理します。滅菌生理血清を1mlの注入によってカテーテルをすすぐ。
8. 注射後に強化されたGRE加重シーケンス24時間を繰り返します。この遅延は、粒子はで貪食することができるマクロファージ。
9. 薬物の効果（抗生物質、ステロイド、抗マクロファージ抗体等 ）を評価長手研究のために、上述したプロトコルを用いて順次MR検査を繰り返す。

3。画像解析

1. 縦評価のために、同じ解剖学的レベルで測定を行い、容易に識別マークを定義します。例えば、膝蓋骨の最大直径が観測される軸平面を通じて買収は、再現性のある測定（ 図1）を得た信頼性の高い方法である。
2. DICOMベースのソフトウェア（例えば、OsiriXのような）又は画像処理ソフト（ImageJの）を用いて画像解析を行う。
3. ImageJのソフトウェアを使用して、 "不規則なエリア"描画ツールを使用してUSPIO強化GRE T2強調画像上の信号損失を示して滑膜領域のセグメンテーションを行う。暗信号と滑膜が概説されたら、/面積を得るために、 "分析"をクリック画素数（ 図2）。

Representative Results

非造影画像に、感染した膝の滑膜は、大腿骨と膝蓋骨が低信号構造（ 図1）のように表示されている間、軟部組織の周囲から区別ないです中間信号の拡散腫れを提示します。

USPIO-強調画像、造影剤投与の24時間後に、USPIO担持マクロファージを含む滑領域は、信号損失（ 図1および2）を実証する。

滑膜内のマクロファージ浸潤は特定の免疫染色（ 図3）を使用して証明することができる。シミパールズ'プルシアンブルーは、青い点（ 図4）のように表示され、鉄粒子を検出することができます。

	GRE T2は重み付け
繰り返し時間（ミリ秒）	450
エコー時間（ミリ秒）	4	角度を反転	30
ターボファクター
脂肪抑制
スライス厚さ（mm）	1.5
インターバルギャップ	0
視野（mm）の	70
マトリックス	448 X 360
帯域幅	80
信号が取得	2
長さをスキャン	3'10

表1。 3T MRユニットのGRE T2強調MRシーケンスのパラメータの例。

図1。急性でウサギ膝の軸方向のGREは、T2強調画像感染の段階の前（A）およびUSPIOの（B）血管内投与24時間後、画像は、膝蓋骨た（p）および大腿骨（f）のレベルで得られる。非造影画像上に（A）、滑膜が厚くなる（矢印）と周囲の軟部組織から不明瞭な均質な中間信号を提示します。 USPIO投与後（B）、滑膜はUSPIOロードされたマクロファージの存在に起因する大規模ダーク信号の帯状の領域（矢印）として表示されるようになりました。 （許可を得てルフェーブルS. ら ⁹から転載）。

ImageJのを使用して信号の損失を発表した滑膜面積の2。セグメンテーションと決意図 。

図3特定のマクロファージ免疫染色の顕微鏡写真は、感染した滑膜（矢印）内マクロファージの強烈な浸潤を示しています （RAM 11免疫染色、オリジナルの倍率40X）。

図4は、顕微鏡写真（パールズ'プルシアンブルーは、シミ、オリジナルの倍率40X）はUSPIO仕掛けのマクロファージ（矢印）にcorrespondig複数ブルー染色された細胞を示しています （許可を得てルフェーブルS. ら ⁹から転載）。

Discussion

非特異ガドリニウムベースの造影剤は、細胞外の空間の容積と血流に関する情報を提供しながら、USPIO強化MRによってマクロファージイメージングは、組織採取⁹を必要とせずに感染した滑膜内の正確な解剖学的局在とマクロファージ浸潤の定性的な評価を可能にします。その高感度のため、USPIOも微妙セルラー、感染の初期段階に存在する潜入発揮できる。病原体が徐々に削除される成功した抗生物質療法の下で、この浸潤が滑膜内USPIO取り込みの減少につながる、減少すると考えられる。暗信号としての面積がUSPIO投与後の滑信号が¹⁰長手評価することができる細胞浸潤の定量的表現、バイオマーカーとして考えることができる、tissular鉄含有量と相関している。また、このようなオプトなどの他の撮像モダリティとは対照的にiCalの撮像又は同位体イメージングは​​、細胞のMRイメージングは​​、細胞に関連する信号の変化の正確な局在を可能にする高解像度の解剖学的画像を生成する能力を有する。

マクロファージイメージングは​​、組織採取を必要とせず、関心のある組織内の細胞の存在と分布の推定を可能にします。したがって、ネイティブの組織正常生物の侵襲性と修正され生体内の生物学的研究ででしばしば必要と繰り返される組織サンプリングの2主な欠点を回避することができます。また、連続した組織サンプリングは縦評価を排除、繰り返されるストレス手順を容認しない小動物では不可能かもしれない。対照的に、シーケンシャルUSPIO増強MRスキャンを容易noninのモデルにおいて抗炎症療法のため、感染症における抗生物質治療の長手監視用小動物に適用することができる用いて組織内のマクロファージコン ​​テンツのフォローアップビボイメージングfectious関節炎、または任意のマクロファージ-関わる疾患で治療。

その他のモデルは（リウマチ、敗血症性滑膜炎など ）選択されると、造影剤の投与を容易に遅い血管内注射を介して行われ、一般的には技術的に困難ではない。 USPIO造影剤を用いたMR細胞イメージングの主な制限は、24時間注射^5-7マクロファージによるファゴサイトーシスを特定できるように、この遅延を走査するために繰り返される必要がある。したがって、同等の撮像データを得るために、MRユニット内の正確な動物のインストールは必須である。我々の経験では、我々は非常に再現性と同等の画像を許可された接着剤テーピングによって得られた下肢の完全な拡張子に関連付けられたMRコイル内に発生しやすい位置にその動物のインストールを観察した。

私たちは、彼らの自然を活用し、簡単にUSPIOを用いたin vivoマクロファージにラベルを付ける方法このレポートで紹介貪食能。追加の予備のex vivoでの手続きが必要になるかもしれなくても（しない自然な食細胞への造影剤の浸透を可能にする）、このような酸化鉄粒子などの高感度なMR造影剤による細胞標識は、多形、リンパ球などの他の細胞型にも適用することができる白血球、または肥満細胞。細胞のMRイメージングは​​、したがって感染関連炎症に関与するすべての細胞型の逐次採用の非侵襲的な調査のために非常に興味深いツールにすることができ、一般の影響だけでなく、細胞をターゲットとした治療法を評価する。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name of Reagent/Material	Company	Catalog Number	Comments
P904	Guerbet		Dose: 150 μmol Fe/kg
Ketamine (500 mg/ml ketamine)	Virbac		Dose: 30 mg/kg
Rompun (20 mg/ml Xylazine)	Axience		Dose: 4 mg/kg
Buprenorphine	Vetoquinol		Dose: 0.1 mg/kg/8 hr
BD 22 G, 1 inch	BD Biosciences	381423
BD 25 G, 5/8 inch	BD Biosciences	305122