Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

تسليخ مجهري ليزر لقطة من السكان المخصب من الخلايا العصبية أو الخلايا العصبية واحدة لتحليل التعبير الجيني بعد إصابات في الدماغ

Published: April 10, 2013 doi: 10.3791/50308
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Anesthesiology, University of Texas Medical Branch

Summary

ونحن تصف كيفية استخدام الليزر التقاط تسليخ مجهري (LCM) للحصول على السكان المخصب من الخلايا العصبية قرن آمون أو الخلايا العصبية واحدة من المقاطع المجمدة من الدماغ الفئران المصاب عن الجين اللاحقة التحليل الكمي باستخدام التعبير الحقيقي PCR الوقت و / أو ميكروأرس كامل الجينوم.

Abstract

ويرتبط العجز على المدى الطويل بعد TBI المعرفية مع الإصابة التي يسببها تنكس عصبي في المنطقة A-الحصين في الفص الصدغي الإنسي التي تعد حيوية للذاكرة والتعلم والوظيفة التنفيذية، 1،2 وبالتالي لدينا دراسات تركز على تحليل التعبير الجيني من الخلايا العصبية المحددة السكان في المناطق دون الإقليمية المتميزة للقرن آمون. وقد سمحت هذه التقنية للتسليخ مجهري التقاط الليزر (LCM)، وعرض في عام 1996 من قبل Emmert-باك، وآخرون، 3 للتقدما كبيرا في تحليل التعبير الجيني للخلايا وحيدة وإثراء السكان من الخلايا من الأنسجة غير متجانسة مثل الدماغ الذي يحتوي على الثدييات الآلاف من أنواع الخلايا الوظيفية .. 4 نستخدم LCM ونموذج الفئران راسخة من إصابات في الدماغ (المصرف التجاري العراقي) للتحقيق في الآليات الجزيئية التي تكمن وراء التسبب في TBI. بعد قرع السائل TBI، تتم إزالة العقول في أوقات محددة سلفا ما بعد الإصابة، تجميد فورا على الثلج الجاف،وأعدت لتقطيع في ناظم البرد. يمكن تضمين أدمغة الفئران في أكتوبر ومقطوع على الفور، أو تخزينها عدة أشهر في -80 درجة مئوية قبل تقطيع ليزر القبض تسليخ مجهري. بالإضافة إلى ذلك، ونحن نستخدم LCM لدراسة آثار TBI على إيقاعات الساعة البيولوجية. لهذا، فإننا التقاط الخلايا العصبية من نوى فوق التصالبة التي تحتوي على مدار الساعة ماجستير في الدماغ في الثدييات. هنا، ونحن لشرح استخدام واحد للحصول على LCM الخلايا العصبية التي تم تحديدها (وجرح التحول، الفلورية اليشم إيجابية، أو لم يصب، الفلورية اليشم السلبية) والسكان من الخلايا العصبية قرن آمون المخصب لاحقة تحليل الجينات التعبير PCR الوقت الحقيقي، و/ أو كامل الجينوم ميكروأرس. وقد كشفت هذه الدراسات LCM تمكين أن تنعكس الضعف انتقائية من مناطق مختلفة تشريحيا من قرن آمون الفئران في ملامح التعبير الجيني مختلفة من مجموعات مختلفة من الخلايا العصبية التي حصلت عليها من هذه المناطق LCM متميزة. النتائج من الدراسات وحيدة الخلية لدينا، حيثقارنا ملامح الترانسكربتي من الموت والبقاء على قيد الحياة مجاور الخلايا العصبية قرن آمون، واقتراح وجود خلية مقاومة متغيرة التي تنظم بقاء موت الخلايا والبقاء على قيد الحياة بعد TBI.

Introduction

وكان الجين التعبير عن تحليل الأنسجة غير متجانسة دائما إشكالية، وهذا صحيح بشكل خاص في أدمغة الثدييات التي لديها حوالي 5،000 أنواع مختلفة من الخلايا قبل 4 تطوير تسليخ مجهري التقاط الليزر (LCM) تقنية، دراسات الجينية من آثار TBI في الجسم الحي واستندت على تحليل التعبير الجيني في السكان مختلطة تتألف من خلايا الدماغ، وليس فقط من مختلف أنواع الخلايا العصبية، ولكن أيضا لدعم الخلايا الدبقية المناعية و. الناتج ملامح التعبير الجيني معقدة تم الحصول عليها من هذه الأنسجة غير المتجانسة، وكثيرا ما تكون متضاربة أنماط الإصابة التي يسببها الإشارات الخلوية، قد يكون أحد التفسيرات لفشل في تجارب اكلينيكية على البشر من الاستراتيجيات العلاجية أثبتت فعاليتها في الدراسات ما قبل السريرية من TBI 5

للحصول على فهم واضح للالتعبير الجيني الناجم عن إصابة في الفئات الضعيفة من السكان من الخلايا العصبية من الفئران في الوركpocampus، اعتمدنا أسلوب LCM التي نشرتها اولا وآخرون Emmert-باك .. 3 بعد ذلك، ونحن والأمثل تعديل هذه التقنية تسليخ مجهري لالتقاط كفاءة السكان المخصب من الخلايا العصبية والخلايا العصبية واحد لاستخدام التنميط مرنا الكمية الحقيقية PCR الوقت وتحليل ميكروأري . للحفاظ على سلامة مرنا في الفروع المجمدة من أنسجة المخ للتحليل الجيني، نحن تعديل البروتوكولات القائمة لتحديد، وتلطيخ والتقاط سريع للخلايا العصبية في الدماغ من الفئران المجمدة أقسام. لتحديد وعزل الخلايا العصبية قرن آمون الجرحى والمحتضرين، ونحن الأمثل أيضا تقنية تلطيخ الفلورية اليشم لLCM. الفلورية اليشم لا يميز بين موت الخلايا أفكارك ونخرية. وبالتالي، يمكن أن يتم الكشف عن جميع أنواع الخلايا العصبية التحول من 6،7 صمة عار. هذا

هنا، نحن تصف البروتوكول المستخدم في مختبرنا للحصول على برك من الخلايا العصبية على قيد الحياة واحد أو يموتون، وكذلك مساحات من populati التخصيبإضافات متميزة من أنواع الخلايا العصبية (أي الخلايا العصبية CA1-CA3 لتحليل التعبير الجيني بعد TBI). ووصف إجراءات السوائل قرع إصابات الدماغ أجريت في مختبرنا بالتفصيل في شيمامورا وآخرون، 8 و هي مشابهة جدا لبروتوكول الوحشي إصابة قرع السائل بالنسبة للفئران نشرت في ألدر إن الرب من وآخرون .. 9 منذ تقنية LCM له ثبت أن لها تأثير ضئيل أو معدوم على سلامة الحمض النووي، والجيش الملكي النيبالي والبروتينات في الأنسجة، وهذا هو أداة ممتازة لتحليل البروتين الجزيئي والخلوي من أنواع المعرفة.

Protocol

1. العمليات الجراحية والسوائل قرع TBI

  1. تمت الموافقة أولا جميع التجارب على الحيوانات من قبل رعاية الحيوان واللجنة المؤسسية الاستخدام من جامعة تكساس الطبية فرع غالفستون، تكساس والمعاهد الوطنية للصحة دليل لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية (8 الطبعة، المجلس القومي للبحوث).
  2. ويعيش الفئران (الذكور البالغين سبراغ داولي الفئران، 400-500 ز تشارلز ريفرز تم الحصول عليها من البائعين، بورتلاند، مين) اثنين في القفص وتقديم الطعام والماء libitum الإعلانية في الحظيرة مع هذه الظروف ثابت: دورة الضوء (600 إلى 1،800 ساعة ساعة)، ودرجة الحرارة (21 ° C إلى 23 ° C)، والرطوبة (40٪ إلى 50٪) أسبوع واحد قبل استخدامها.
  3. تخدير الفئران مع 4٪ isoflurane، ينبب، وتهوية ميكانيكيا (نيمي العلمية؛ نيو انغلاند الأدوات الطبية، ميدواي، MA) في الفئران مع 1،5-2،0٪ isoflurane في الأكسجين: الهواء (70:30) وإعدادهم للمجاور للسهمي السائل قرع إصابة كما هو موضح سابقا .. 8، 10
  4. التضحية الفئران عند نقطة الوقت المناسب بعد الإصابة اعتمادا على التصميم التجريبي. إزالة بسرعة العقول، وتجميد فورا على الثلج الجاف، وتخزينها في -80 درجة مئوية في أنبوب 50 مل أو الشروع فورا في تضمين في أكتوبر لباجتزاء المجمدة.

2. باجتزاء وتلطيخ للدماغ الفئران

  1. يمكن أن تظل أنسجة المخ التي لم يتم استخدامها على الفور في C ° -80 لمدة تصل إلى شهر واحد إذا كان يحتفظ بها في درجة حرارة ثابتة. العقول التي جمدت في -80 ° C، ثم إذابة إلى -20 درجة مئوية لتقطيع، ومن ثم إعادة تجميدها لم تسفر RNA نوعية بعد ذوبان الثانية. بمجرد إذابة الدماغ، التي شنت في أكتوبر ومقطوع، ينبغي صبغ الشرائح في غضون 24 ساعة وتستخدم لLCM في غضون 30 دقيقة إلى ساعة واحدة من تلطيخ. وهذا يضمن RNA نوعية جيدة. بعد LCM، يمكن تخزين الخلايا والقبض على القبعات LCM في المخزن المؤقت تحلل في C ° -80 لمدة تصل إلى أسبوع واحد، ولكن ينبغي أن تكون معزولة RNA في الوقت المناسب لضمان أعلى مستويات الجودة. </ لى>
  2. قبل تقطيع الدماغ، مسح ناظم البرد مع ريبونوكلياز-زاب وتنظيف فرش مع ETOH (استبدال شفرة المتاح بين كل الدماغ).
  3. استرداد المخ في أنبوب 50 مل من الفريزر -80 ° C؛ وضعه في ناظم البرد في درجة حرارة -22 ° C من ذوبان الجليد في أنبوب ولما يقرب من 10 دقيقة. إزالة الدماغ من الأنبوب ومكان على خشبة المسرح على الشاش، حتى الجانب البطني.
  4. باستخدام شفرة حلاقة، شريحة الدماغ لإزالة جزء الخلفي من الدماغ فقط لمنقاري المخيخ والجزء الأمامي في chiasm البصرية. ملء cryomold مع تصاعد المتوسطة أكتوبر (تك الأنسجة)، ووضع الدماغ في القالب مع الجانب الأمامي لأسفل. السماح للأنسجة المخ لتجميد المتوسطة في تصاعد حتى يتحول البيض (حوالي 10 دقيقة).
  5. تجميد القرص العينة (الأنسجة تيك) على الدماغ مع أكتوبر إزالة الدماغ من القالب. إدراج الدماغ في الرأس العينات وتضييق الخناق.
  6. إدراج disposaبلي، شفرة الانظار (فيشر العلمية) في حامل سكين وتشديد رافعة أسفل.
  7. بدء تشريح الدماغ في 20 ميكرون لإزالة الطبقة الخارجية من أكتوبر مرة واحدة يتم الوصول إلى المنطقة الحصين، اضبط قرص ميكرون إلى 10. جمع المسلسل أقسام الاكليلية من خلال وضع شريحة زجاجية أو شريحة من الزجاج بالإضافة إلى قسم الأنسجة (فيشر العلمية). يتم الاحتفاظ الشرائح في -20 ° C في رف تلطيخ ريبونوكلياز خالية حتى باجتزاء كاملة.
  8. لإزالة كافة RNases من الأواني الزجاجية حيث تتم معالجة الأنسجة أقسام، مسح أسفل كل الحاويات تلطيخ وتخرج مع اسطوانات Eliminase (فيشر العلمية) وشطف في الماء س الملة. إعداد كل الحلول مع ريبونوكلياز خالية المياه وتصفية البنفسجي الكريزيل (سيغما الدريخ) والفلورية اليشم (Histo الكيميائي) وصمة عار 0،2 ميكرومتر مع مرشح قبل استخدامها.
  9. ذوبان الجليد في أقسام الدماغ RT لمدة 30 ثانية وإصلاح في ETOH٪ 75 (1 دقيقة).
  10. لLCM احد من الخلايا العصبية بجروح بعد التثبيت، وشطف الشرائح في ريبونوكلياز خالية المياه (1 دقيقة)، ملون مباين مع البنفسجي الكريزيل 1٪ (15-20 ثانية)، وشطف في الماء ريبونوكلياز خالية (2 × 30 ثانية)، وصمة عار مع اليشم الفلوري (4 دقائق)، وشطف في الماء ريبونوكلياز خالية (3 × 1 دقيقة)، يذوى مع ETOH 95٪ مصنوعة من ريبونوكلياز خالية المياه (30 ثانية)، 100٪ ETOH (30 ثانية)، والزيلين (2 × 3 دقيقة).
  11. لLCM من مساحات من الخلايا العصبية بعد التثبيت، وشطف الشرائح في ريبونوكلياز خالية المياه (1 دقيقة)، وصمة عار مع البنفسجي الكريزيل 1٪ (1 دقيقة)، وشطف في الماء ريبونوكلياز خالية ل(3 × 1 دقيقة)، يذوى مع 95٪ ETOH (2 × 30 ثانية)، ETOH 100٪ (2 × 30 ثانية)، والزيلين (2 × 3 دقيقة).
  12. الهواء الجاف في جميع أقسام غطاء الدخان لمدة 15 دقيقة قبل LCM. ويمكن تخزين الشرائح الجانبين القسم، وحتى، في مربع الشريحة التي تصطف مع dessicant، إذا كانت تحتاج إلى نقلها من غرفة الى غرفة. ومع ذلك، يتم الحصول على أفضل النتائج إذا تم تنفيذ LCM مباشرة بعد المقاطع جافة. وينبغي أن يقتصر LCM من 30 دقيقة إلى 1 ساعة. في المقطع التالي، وصفنا أولا كيف لالتقاط مساحات المستمر للخلايا، وهو عصامsiest لإتقان لأولئك الذين يتعلمون هذه التقنية. ثم نحن تصف كيفية التقاط بالضبط الخلايا العصبية واحدة. في إجراء دينا، ونحن تحديد الخلايا العصبية تموت من قرابتهم لالفلورية اليشم علامة التحول من الخلايا العصبية. يفترض الخلايا الفلورية اليشم سلبية على قيد الحياة إلى أن الخلايا العصبية.

3. تسليخ مجهري لقطة ليزر (LCM)

LCM من مساحات السكان المخصب من الخلايا العصبية قرن آمون

  1. يتم تنفيذ LCM باستخدام مجهر معهد التعليم الدولي PixCell مع ليزر ديود الأشعة تحت الحمراء (لايف تكنولوجيز).
  2. ضبط ذراع التحكم المركز إلى الوضع الرأسي. تدوير وقفل الهدف 4X في الموقف.
  3. وضع شريحة في وسط مرحلة المجهر وضبط يدويا حتى منطقة قرن آمون في طريقة العرض. استخدام التركيز التعديلات الخشنة وغرامة لجعل الصورة إلى التركيز.
  4. تفعيل تشاك الفراغ عن طريق الضغط على زر فراغ على وحدة تحكم. تدوير وقفل الهدف 10X في PLالآس. التركيز مرة أخرى مع تعديلات الخشنة وغرامة.
  5. تحميل ماكرو CapSure LCM قبعات (لايف تكنولوجيز) في CapSure حدة كاسيت وسقف الموقف في موقف تحميل الخط. تدوير الذراع الموضع كاب وموقف حول الغطاء. رفع الذراع الموضع كاب لإزالة الغطاء CapSure من وحدة كاسيت.
  6. تدوير الذراع الموضع كاب على الشريحة وخفض الذراع طائرته فوق الشريحة، وهذا سوف يضع قبعة على الشريحة. ضبط التركيز وغرامة حرك عصا التحكم للتحقق مما إذا الخلايا داخل دائرة سوداء على الغطاء. ينبغي لجميع الأسرى داخل الخلية تكون هذه الدائرة السوداء.
  7. تعيين المعلمات الليزر. أولا، اضغط على زر الليزر تمكين على وحدة تحكم. سوف البقعة المستهدفة ليزر وتكون مرئية نقطة الوردي في مجال الرؤية على شاشة الكمبيوتر.
  8. تعيين حجم بقعة الليزر للمشاريع الصغيرة (7.5 ميكرومتر) لتركيز الليزر وضبط السلطة ومدتها ل65 حتي 75 ميغاواط، ل1،0-2،0 ميللي ثانية حسب الحاجة لالتقاط الخلايا الأمثل.
  9. الشركة المصرية للاتصالات لسانت ليزر، استخدم عصا التحكم لتحريك بقعة الليزر إلى منطقة لا توجد فيها خلايا لالتقاط. إطلاق الليزر باستخدام التبديل الإبهام. استخدم عصا التحكم لتحريك بقعة الليزر بعيدا عن بقعة البوليمر الذائب وتحقق لمعرفة ما إذا كان حلقة مرئية الظلام يحيط منطقة واضحة حيث أطلق الليزر.
  10. لالتقاط الخلايا، استخدم عصا التحكم لتحريك بقعة الليزر على المنطقة من الخلايا لالتقاط. إطلاق الليزر باستخدام التبديل الإبهام. حرك عصا التحكم أثناء اطلاق الليزر لالتقاط مساحة واسعة من الخلايا. عندما يتم تشغيل الليزر يذوب بالحرارة البوليمر الفيلم على الغطاء على سطح الخلايا المستهدفة. البوليمر تمتص أشعة الليزر، وبالتالي لا تغيير، RNA DNA أو البروتين ضمان سلامة العينة الجزيئية للتطبيقات المستقبلية.
  11. بعد اطلاق جميع الخلايا ذات الاهتمام، ورفع الذراع الموضع كاب. وخلايا القبض على فصل من قسم الأنسجة والانضمام إلى غطاء CapSure. فإن الأنسجة والخلايا المتبقية في عداد المفقودين فيما يكونible في مجال الرؤية. ويمكن أيضا الخلايا على الغطاء أن ينظر من خلال وضع غطاء على الجزء الفارغ من الشريحة.
  12. رفع الذراع الموضع كاب وتناوب عليها لإلغاء محطة كاب. خفض الحد الأقصى إلى المحطة وتدوير الذراع الموضع كاب مرة أخرى إلى وضعها السابق.
  13. حرك أداة الإدراج CapSure على طول منصة وعلى الغطاء. رفع الأداة من النظام الأساسي. والحد الأقصى للبقاء المرفقة. مسة خفيفة الحد الأقصى لوحة نظيفة CapSure لتنظيف بعيدا الأنسجة غير المرغوب فيها.
  14. ضع الغطاء في أنبوب 0.5 مل ريبونوكلياز خالية ملء مع 100 ميكرولتر من العازلة تحلل الحصول عليها من كيت الصغرى، عزل RNAqueous. دوامة فورا الغطاء لمدة 30 ثانية لليز الخلايا. احتضان العينات في 42 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة وتجميد -80 درجة مئوية في حين RNA العزلة.

LCM احد من الخلايا العصبية + FJ في قرن آمون

  1. لالتقاط الخلايا واحدة، تحميل CapSure HS LCM القبعات في CapSure حدة كاسيت وpositiعلى سقف الموقف في تحميل الخط. تدوير الذراع الموضع كاب وضعه حول الغطاء. رفع الذراع الموضع كاب لإزالة الغطاء CapSure من وحدة كاسيت.
  2. تعيين حجم بقعة الليزر للمشاريع الصغيرة (7.5 ميكرومتر) لتركيز الليزر وضبط قوة الليزر لمدة و-75 65 ميغاواط 0،45 حتي 0،50 مللي ثانية لالتقاط الخلايا من الخلايا الأمثل واحدة.
  3. تدوير الذراع الموضع كاب على الشريحة وخفض الذراع لأسفل في اتجاه الشريحة. وهذا وضع غطاء على الشريحة. يجلس رفع سقف السطح Capsure HS من العينة خلال LCM.
  4. استخدم عصا التحكم لتحريك الليزر على الخلايا واحد + FJ. يجب على جميع الخلايا إلقاء القبض عليه داخل الحلبة وتكون سوداء صغيرة على الغطاء. إطلاق الليزر باستخدام التبديل الإبهام.
  5. عندما تم إطلاق جميع الخلايا داخل منطقة دائرة سوداء مع ليزر، ورفع الذراع الموضع كاب. وخلايا القبض على فصل من قسم الأنسجة والانضمام إلى غطاء HS CapSure.
  6. ضع شريحة أخرى على مايكروونمواجهة المرحلة وجمع FJ + الخلايا حتى الحد الأقصى HS ممتلئ. ضع الغطاء في أنبوب 0.5 مل ريبونوكلياز خالية مليئة 40-50 ميكرولتر من العازلة تحلل. دوامة فورا الغطاء لمدة 30 ثانية لليز الخلايا. احتضان العينات في 42 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة وتجميد -80 درجة مئوية في حين RNA العزلة.

4. مجموع RNA بمعزل عن عينات LCM (سوف فقط هذا القسم يمكن وصفها في عرض فيديو)

  1. يتم عزل الحمض النووي الريبي مجموع من الخلايا باستخدام أدوات RNAqueous الدقيقة (Ambion) بعد بروتوكولات الشركة المصنعة. يتم توفير جميع الكواشف والحلول في غسل هذه المجموعة. قبل الرطب الجزئي خرطوشة تصفية بإضافة 30 ميكرولتر من العازلة تحلل حل لعامل التصفية. بعد 5 دقائق، أجهزة الطرد المركزي تصفية لمدة 30 ثانية في ز × 10،000.
  2. إضافة 3 ميكرولتر من LCM المضافة إلى المحللة العينة، ماصة لخلط، وأجهزة الطرد المركزي.
  3. إضافة 52 ميكرولتر من ETOH 100٪ (1/2 حجم) إلى عينة المحللة؛ ماصة لخلط ونقل المحللة لتصفيةالعمود.
  4. أجهزة الطرد المركزي في العمود تصفية ز × 10،000 ل1 دقيقة لربط RNA إلى العمود. إذا كان هناك مباراة دولية متعددة لعينة واحدة، وتدور كل المحللة خلال نفس العمود على حدة.
  5. استكمال إجراءات العزلة RNA كما هو موضح في عدة مايكرو RNAqueous.
  6. أداء الدناز العلاج وتعطيل الدناز من عينات الحمض النووي الريبي LCM كما هو موضح في هذه المجموعة، نقل RNA إلى أنبوب ريبونوكلياز خالية وتخزينها في -80 درجة مئوية.

5. RNA الكمي وتطبيقات المصب

يتم تنفيذ تقييم نوعية RNA النوعي والكمي مع Bioanalyzer اجيلنت باستخدام الكواشف من أدوات بيكو (اجيلنت تكنولوجيز، سانتا كلارا، كاليفورنيا) بعد بروتوكول الشركة المصنعة.

  1. ويتم تحليل الحمض النووي الريبي مجموع Bioanalyzer على اجيلنت 2100 (اجيلنت تكنولوجيز). البرنامج بتقييم التركيز وسلامة العينة RNA عن طريق تخصيص عدد النزاهة RNA (RIN) لكل عينة و تتراوحROM 1 إلى 10. 1-5 تشير RNA المتدهورة و 7-10 يشير RNA نوعية جيدة.
  2. وسيتم استخدام غير سليمة RNA المتدهورة في الوقت الحقيقي PCR؛ المقايسات Taqman فرد أو صفائف التعريف RT2 باستخدام Sybr الخضراء الكيمياء. ويمكن أيضا أن تستخدم الحمض النووي الريبي لتحليل ميكروأري مرنا والرنا الميكروي تحليل ميكروأري.

Representative Results

في دراستنا LCM الأولى، كنا قادرين على إظهار أن المناطق الفرعية وظيفيا متميزا (CA1 وCA3) من الفئران الحصين لها ملامح التعبير الجيني التي تعكس ضعفها أمام الشكل 8 TBI. 1A-1C يظهر القبض على الخلايا العصبية الهرمية الليزر قرن آمون (CA1- CA3)، الخلايا العصبية والخلايا العصبية التلفيف المسنن SCN من قبل، وبعد LCM. وتظهر لقطات نظيف لحبيبة، أو الخلايا العصبية الهرمية SCN، على التوالي، على القبعات الماكرو. الشكل 2A-2B يوضح الموت، الفلورية اليشم الخلايا العصبية الهرمية الإيجابية والباقين على قيد الحياة، الفلورية اليشم الخلايا العصبية الهرمية السلبية قبل وبعد LCM. يظهر التقاط نظيفة من الموت أو البقاء على قيد الحياة عن طريق عرض الخلايا العصبية الخلايا والقبض على القبعات LCM.

بعد LCM، يمكن استخدام الحمض النووي الريبي مجموع لمجموعة متنوعة من الدراسات الجزيئية بما في ذلك التحليل الكمي في الوقت الحقيقي PCR في التعبير الجيني باستخدام TaqMan أو كيمياء الخضراء SYBR (الشكل 3A)، صغيرة focuالحوار الاقتصادي الاستراتيجي مع صفائف PCR تحقيقات SYBR الخضراء (الشكل 3B) أو كامل الجينوم الدراسات ميكروأري (الشكل 3C).

الشكل 1
الشكل 1. تسليخ مجهري بالليزر القبض على مساحات محددة من السكان خلية من الدماغ الفئران. يتم إصلاحها مجمدة 10 ميكرومتر المقاطع الاكليلية من الدماغ الفئران في الإيثانول، ملطخة مع (البنفسجي الكريزيل) وصمة عار نيسل وإعدادها للLCM. المعروضة هي صور للقرن آمون الفئران ونواة suprachiasmatic قبل وبعد الخلايا العصبية A. LCM والخلايا التي تم التقاطها في تصور القبعات على الماكرو. الهرمية من الحقول الفرعية CA1-CA3 من قرن آمون الفئران. B. الخلايا الحبيبية في التلفيف المسنن لقرن آمون. C. نوى فوق التصالبة الثنائية تقع على جانبي البطين الثالثوتقع فوق التصالبة البصرية. اضغط هنا لمشاهدتها بشكل اكبر شخصية .

الشكل 2
الشكل 2. تسليخ مجهري بالليزر القبض على الخلايا العصبية قرن آمون واحدة من الفئران. أظهرت هي A. التحول، الفلورية اليشم إيجابية (الملون) الخلايا العصبية قرن آمون CA3 والنجاة B.، الفلورية اليشم سلبية (غير ملوثين) CA3 الخلايا العصبية قبل وبعد LCM. القبض على الخلايا وتصور. اضغط هنا لمشاهدتها بشكل اكبر شخصية .

الشكل 3 الشكل 3. تحليل الجينات التعبير من الحمض النووي الريبي مجموع الخلايا العصبية معزولة عن الليزر القبض عليه. A. الكمي في الوقت الحقيقي PCR من البيانات على مدار الساعة الإيقاعية التعبير الجيني في SCN. B. Heatmap في التعبير الجيني في الخلايا العصبية على قيد الحياة والموت قرن آمون يظهر تعبير عن موت الخلايا المبرمج باستخدام الجينات ذات الصلة ركزت صفائف PCR جيم كامل الجينوم اجيلنت تحليل ميكروأري التعبير الجيني في الخلايا العصبية CA1-CA3 الحصين من الفئران التي تلقت اصابة الشام، TBI أو TBI بالإضافة إلى المؤتلف الفيروس سيرنا الغدة المرتبطة تهدف إلى التعبير عن الجينات ضربة قاضية الناجمة عن إصابات الدماغ (العصبية أكسيد النيتريك والجلوتاثيون بيروكسيديز سينسيز-1). اضغط هنا لمشاهدتها بشكل اكبر شخصية .

Discussion

هذه التقنية LCM مكنتنا من تحقيق تقدم كبير في فهم الآليات الجزيئية لTBI. 8،10،11،12،13 كنا أول من المحققين استخدام هذه التقنية لإثبات أن المناطق الفرعية المتميزة للقرن آمون الفئران لها ملامح التعبير الجيني التي ترتبط ضعفها انتقائية للإصابة. أظهرت دراساتنا أن نتمكن من تحديد التعبير الجيني، من qPCR، من خلايا ليزر عدد قليل إلى 10 أسير وأننا يمكن أن تؤدي الجينوم على نطاق تحليل ميكروأري من عدد قليل من الخلايا إلى 600 أسر. وLCM أن يكون أداة قيمة في دراسات مماثلة في مناطق أخرى من الدماغ التي هي معروفة لتكون متورطة في مختلف الاضطرابات العصبية والعصبية النفسية. على سبيل المثال، قد تسلط الدراسات الضوء إلى استخدام LCM التسبب في مرض باركنسون في الخلايا العصبية الدوبامين في المادة السوداء و 14 و بمساعدة دراسات الجينوم على نطاق التنميط من النواة المتكئة، التي تشارك في دوائر مكافأة المتورطين في قاضطرابات تعاطي ubstance 15

وينعكس عدم التجانس العصبية على مستوى الجينوم 16 و يمكن أن تسهم في عدم نجاح علاجات تجريبية لTBI في التجارب السريرية. وبالتالي، فإن هدفنا هو استخدام هذه التقنية لتحقيق العناصر الحاسمة التي تؤثر بقاء الخلايا العصبية بعد TBI. واقترح لدينا دراسة حديثة التنميط الجينوم على نطاق والموت المجاورة على قيد الحياة الخلايا العصبية قرن آمون بعد TBI أن مقاومة متغيرة الخلوية التي تعكس نسبة مستويات التعبير عن الجينات بقاء الخلية إلى موت الخلايا ينظم مصير الخلية بعد TBI. وهذه الدراسات الجارية المساهمة في تصميم وتطوير الاستراتيجيات التي يمكن أن تؤثر pharmacotherapeutic إيجابيا على مقاومة متغيرة بقاء الخلية. وعلاوة على ذلك، ونحن نستخدم حاليا LCM لتتبع ورصد الآثار المحتملة للعلاجات الدوائية العلاجية في الخلايا العصبية قرن آمون بعد TBI. وهكذا، لدينا دراسات تثبت أن تعطى حذرا تقنيات التعامل مع ريبونوكلياز خالية وبعضإدخال تعديلات على البروتوكولات القائمة، فمن الممكن الحصول على جودة عالية عينات من الحمض النووي الريبي لLCM دقيقة الكمية الجينات تحليل التعبير.

ولكن هناك عدد قليل المزالق المرتبطة تقنيات LCM. على سبيل المثال، يمكن جمع الخلايا العصبية فقط دون أي تلوث الخلايا الدبقية الصغيرة من المستحيل تقريبا. في طبقة الخلايا الهرمية للالحصين وتشير التقديرات إلى أن 95٪ من الخلايا هي الخلايا العصبية مع 90٪ من هذه الفئة من السكان لتكون الخلايا الهرمية وinterneurons 10٪، وترك نسبة ضئيلة من أنواع الخلايا الدبقية وغيرها. 8،17، 18 في دراساتنا التي نستخدمها الفلورية اليشم صبغة الفلورسنت التي تصف على وجه التحديد الخلايا العصبية فقط بجروح في أنسجة المخ. ومن شأن وصمة عار المختلفة التي هي علامة للحصول على GFAP يكون من الضروري وصمة عار الخلايا الدبقية الصغيرة 19 فقط جمع الفلورية اليشم الملون الهيئات الخلايا العصبية واحد يضمن يبلغ عدد سكانها أكثر تجانسا من الخلايا العصبية. آخر مشكلة شائعة التي قد تتطلب استكشاف الأخطاء وإصلاحها هو أن الدائرة لار محددة عندما يتم تشغيل الليزر. إذا حدث هذا، فمن الضروري للتحقق من إعدادات ضبط الليزر والطاقة ومدتها حسب الضرورة. أيضا من المهم للتأكد من أن يتم وضع سقف شقة في الأنسجة ويجلس بشكل صحيح في الذراع. ويشير إلى دليل LCM التقنية، أو الدعوة إلى الدعم الفني في بعض الأحيان يكون ضروريا. بعد LCM والعزلة RNA، ينبغي دائما نوعية RNA يتم تقييم باستخدام bioanalyzer قبل أي جينات تحليل التعبير.

هناك عدة أنواع من الصكوك التقاط الليزر حاليا في السوق بما في ذلك القطع بالليزر (لايف تكنولوجيز، لايكا مايكروسيستمز) وأخرج الليزر (زايس) الصكوك. نظامنا LCM يعمل بشكل جيد لالتقاط أعداد صغيرة من الخلايا. قد غيرها من نظم عالية الإنتاجية والآلية أكثر يكون أكثر ملاءمة للحصول على عدد أكبر من الخلايا لتحليل الجيني والبروتين بشكل خاص. في الواقع، LCM استخدام هذه النظم الآلية لديها امكانات كبيرة لتحليل العلاقات العامةotein التعبير في الخلايا التي تم تحديدها أو السكان المخصب من الخلايا 20 وعلاوة على ذلك، يمكن تسهيل LCM الجين التعبير عن تحليل الخلايا immunolabeled، 21 مما يسمح لنا للتحقيق في التعبير الجيني في أنواع الخلايا محددة بغض النظر عن التعقيد في معظم الأنسجة غير المتجانسة. وهكذا، LCM هو أداة ممتازة لأحدث الدراسات الجزيئية للسكان واحدة أو المخصب من الخلايا.

Disclosures

الكتاب يعلن أن لديهم أي تضارب في المصالح.

Acknowledgments

ويتم تمويل هذا العمل من قبل R01 NS052532 (لHLH)، ومؤسسة موديز، وقسم التخدير. نشكر لوري البنط الأسود، كريستين كورتو بتلر وبيري كريستي للمساعدة على التحرير، وكريستي بيري لتخطيط وإنتاج ممتاز من جميع الجداول والأرقام والعمل الفني.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
PixCell IIe Laser Capture Microscope Life Technologies (Arcturus)
Agilent 2100 Bioanalyzer Agilent Technologies
RNAqueous Micro- Kit Life Technologies (Ambion) AM1931
Agilent 6000 Pico Kit Agilent Technologies 5067-1513
Capsure LCM caps Applied Biosystems LCM0211/LCM0214
Fluoro-Jade Histo-chem Inc. #1FJ
Cresyl Violet Acetate Sigma-aldrich C5042-10G
Xylene (Histological grade) Fisher Scientific X3P-1GAL
Ethanol 200 proof (Histological grade) UTMB pharmacy
RNase free barrier pipette tips Fisher Scientific 2123635, 212364, 212361, 21-236-2A
Arcturus Laser Capture Microdissection system (Life Technologies)
Zeiss Laser Microdissection The PALM family
Leica Microsystems

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Squire, L. R., Stark, C. E., Clark, R. E. The medial temporal lobe. Annual Review of Neuroscience. 27, 279-306 (2004).
  2. Bast, T. Toward an integrative perspective on hippocampal function: from the rapid encoding of experience to adaptive behavior. Rev. Neurosci. 18 (3-4), 253-281 (2007).
  3. Emmert-Buck, M. R., Bonner, R. F., et al. Laser capture microdissection. Science. 274 (5289), 998-1001 (1996).
  4. Bota, M., Dong, H. W., Swanson, L. W. From gene networks to brain networks. Nat. Neurosci. 6 (8), 795-799 (2003).
  5. Schouten, J. W. Neuroprotection in traumatic brain injury: a complex struggle against the biology of nature. Curr. Opin. Crit. Care. 13 (2), 134-142 (2007).
  6. Schmued, L. C., Albertson, C., Slikker, W. Fluoro-Jade: a novel fluorochrome for the sensitive and reliable histochemical localization of neuronal degeneration. Brain Research. 751 (1), 37-46 (1997).
  7. Ye, X., Carp, R. I., Schmued, L. C., Scallet, A. C. Fluoro-Jade and silver methods: application to the neuropathology of scrapie, a transmissible spongiform encephalopathy. Brain Res. Brain Res. Protoc. 8 (2), 104-112 (2001).
  8. Shimamura, M., Garcia, J. M., Prough, D. S., Hellmich, H. L. Laser capture microdissection and analysis of amplified antisense RNA from distinct cell populations of the young and aged rat brain: effect of traumatic brain injury on hippocampal gene expression. Mol. Brain Res. 17 (1), 47-61 (2004).
  9. Alder, J., Fujioka, W., Lifshitz, J., Crockett, D. P., Thakker-Varia, S. Lateral Fluid Percussion: Model of Traumatic Brain Injury in Mice. J. Vis. Exp. (54), e3063 (2011).
  10. Shimamura, M., Garcia, J. M., et al. Analysis of long-term gene expression in neurons of the hippocampal subfields following traumatic brain injury in rats. Neuroscience. 131 (1), 87-97 (2005).
  11. Shah, S. A., Prough, D. S., Garcia, J. M., DeWitt, D. S., Hellmich, H. L. Molecular correlates of age-specific responses to traumatic brain injury in mice. Exp. Gerontol. 41 (11), 1201-125 (2006).
  12. Hellmich, H. L., Garcia, J. M., et al. Traumatic brain injury and hemorrhagic hypotension suppress neuroprotective gene expression in injured hippocampal neurons. Anesthesiology. 102 (4), 806-814 (2005).
  13. Rojo, D. R., Prough, D. S., et al. Influence of stochastic gene expression on the cell survival rheostat after traumatic brain injury. PLoS One. 6 (8), e2311 (2011).
  14. Elstner, M., Morris, C. M., et al. Expression analysis of dopaminergic neurons in Parkinson's disease and aging links transcriptional dysregulation of energy metabolism to cell death. Acta Neuropathol. 122 (1), 75-86 (2011).
  15. Chen, H., Liu, Z., et al. Genome-Wide Gene Expression Profiling of Nucleus Accumbens Neurons Projecting to Ventral Pallidum Using both Microarray and Transcriptome Sequencing. Front. Neurosci. 5, 98 (2011).
  16. Lein, E. S., Hawrylycz, M. J., et al. Genome-wide atlas of gene expression in the adult mouse brain. Nature. 445 (7124), 168-176 (2007).
  17. Amaral, D. G., Ishizuka, N., Claiborne, B. Neurons, numbers and the hippocampal network. Prog. Brain Res. 83, 1-11 (1990).
  18. Zeng, Y. C., Bongrani, S., et al. Effect of long-term treatment with L-deprenyl on the age-dependent microanatomical changes in the rat hippocampus. Mech. Ageing Dev. 79 (2-3), 169-185 (1995).
  19. Schmued, L. C., Hopkins, K. J. Fluoro-Jade: novel fluorochromes for detecting toxicant-induced neuronal degeneration. Toxicol. Pathol. 28 (1), 91-99 (2000).
  20. Banks, R. E., Dunn, M. J., et al. The potential use of laser capture microdissection to selectively obtain distinct populations of cells for proteomic analysis-- preliminary findings. Electrophoresis. 20 (4-5), 689-700 (1999).
  21. Fend, F., Emmert-Buck, M. R., et al. Immuno-LCM: laser capture microdissection of immunostained frozen sections for mRNA analysis. Am. J. Pathol. 154 (1), 61-66 (1999).

Tags

علم الأعصاب، العدد 74، بيولوجيا الأعصاب، الطب، الهندسة الطبية الحيوية، علم التشريح، علم وظائف الأعضاء، علم الأحياء الخلوي، علم الأحياء الجزيئية، علم الوراثة، الجراحة، التخدير، المجهرية، تسليخ مجهري، ليزر تسليخ مجهري لقطة، LCM، تقنيات التحقيق، إصابات الدماغ، TBI، الحصين الفلوري، -اليشم، تحليل الجينات التعبير، التعبير الجيني، الخلايا العصبية، نموذج حيواني
تسليخ مجهري ليزر لقطة من السكان المخصب من الخلايا العصبية أو الخلايا العصبية واحدة لتحليل التعبير الجيني بعد إصابات في الدماغ
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Boone, D. R., Sell, S. L., Hellmich, … More

Boone, D. R., Sell, S. L., Hellmich, H. L. Laser Capture Microdissection of Enriched Populations of Neurons or Single Neurons for Gene Expression Analysis After Traumatic Brain Injury. J. Vis. Exp. (74), e50308, doi:10.3791/50308 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter