Summary
우리는 정량 실시간 PCR 및 / 또는 전체를 게놈 microarrays를 사용하여 후속 유전자 발현 분석을위한 부상을 쥐의 뇌의 냉동 섹션에서 hippocampal 뉴런 또는 단일 뉴런의 풍부한 인구를 얻기 위해 레이저 캡처 microdissection (LCM)를 사용하는 방법에 대해 설명합니다.
Abstract
외상성 뇌 손상 후 장기인지 장애는 학습, 메모리 및 집행 기능에 대한 중요 중간 측두엽에있는 해마 - 지역의 부상을 유발 neurodegeneration와 연결되어 있습니다. 1,2 따라서 우리의 연구는 특정 neuronal의 유전자 발현 분석에 초점을 해마의 독특한 하위 지역의 인구. Emmert - 벅에 의해 1996 년에 도입 된 레이저 캡처 microdissection (LCM)의 기술, 외., 3 단일 세포의 유전자 발현 분석에 상당한 발전을 위해 허용 드높여 왔습니다 등이 포함 된 포유류의 뇌와 같은 이기종 조직에서 세포의 인구 기능 세포 유형의 수천 4. 우리는 LCM 및 외상성 뇌 손상의 pathogenesis을 기초 분자 메커니즘을 조사 할 외상성 뇌 손상의 잘 설립 쥐 모델을 (외상성 뇌 손상)을 사용합니다. 유체 - 타진 외상성 뇌 손상 후, 뇌는 즉시 드라이 아이스에 냉동, 미리 정해진 시간 이후 부상에서 제거됩니다와 그라 이오 스탯에 sectioning 준비. 쥐 두뇌은 즉시 10월과 sectioned에 포함하거나, -80에서 몇 개월 저장할 수 있습니다 ° C 레이저 캡처 microdissection에 대한 sectioning 전에. 또한, 우리는 circadian 리듬에 외상성 뇌 손상의 효과를 연구 할 LCM 사용합니다. 이를 위해, 우리는 포유류의 뇌의 마스터 클럭을 포함 suprachiasmatic 핵의 뉴런를 캡처합니다. 여기, 우리는 실시간 PCR 및 / 단일 식별 뉴런 (부상 및 degenerating, 플루오로 - 제이드 - 긍정적, 또는 손상되지 않은, 플루오로 - 제이드 - 제외) 및 후속 유전자 발현 분석을위한 hippocampal 뉴런의 풍부한 인구를 확보 할 수 LCM의 사용을 보여줍니다 또는 전체 - 게놈 microarrays. 이러한 LCM 가능 연구는 쥐 해마의 해부학 고유 한 영역의 선택적 취약성이 뚜렷한 지역에서 LCM 얻은 뉴런의 다른 인구의 서로 다른 유전자 발현 프로파일에 반영하는 공개했다. 우리의 단일 셀 연구, 어디에서 결과우리는 죽음과 인접 hippocampal 뉴런을 생존의 전사 프로파일을 비교 외상성 뇌 손상 후 세포 죽음과 생존을 조절 세포 생존 가감 저항기의 존재를 권장합니다.
Introduction
이종 조직의 유전자 발현 분석은 항상 문제가되었습니다,.이 약 5,000 다른 세포 유형을 가진 포유류의 뇌에 특히 사실이다 전에 레이저 캡처 microdissection (LCM) 기술, 외상성 뇌 손상의 효과 게놈 연구의 발전 4 생체에서 다른 neuronal 세포 유형의뿐만 아니라 glial 및 immunomodulatory 세포를 지원뿐만 아니라 구성 뇌 세포의 혼합 인구의 유전자 발현 분석을 기반으로했다. 그 결과 복잡한 유전자 발현 프로파일이 이기종 조직에서 얻은, 그리고 부상을 유발 세포 신호의 자주 충돌 패턴은 외상성 뇌 손상 5.의 사전 임상 연구에서 효과가 입증 된 치료 전략의 인간 임상 실험에 실패에 대해 하나의 설명이 될 수 있습니다
쥐 엉덩이에서 뉴런의 위험에 노출 된 인구에 부상을 유발 유전자 표현의 명확한 이해를 구하려면pocampus, 우리가 처음 Emmert - 벅 외에 의해보고 LCM의 기술,. 3 그 후, 우리는 정량 실시간 PCR과 microarray 분석을 사용하여 뉴런과 mRNA 프로파일위한 단일 뉴런의 풍부한 인구를 효율적으로 캡처이 microdissection 기술을 수정 및 최적화를 채택 . 게놈 분석을위한 뇌 조직의 냉동 섹션에서 mRNA의 무결성을 유지하기 위해, 우리는 고정, 염색 및 냉동 쥐 뇌 섹션에서 뉴런의 빠른 캡쳐를위한 기존의 프로토콜을 수정했습니다. 식별 및 부상자와 죽어 hippocampal 뉴런의 격리를 들어, 우리는 또한 LCM에 대한 플루오로 - 제이드의 착색 기술을 최적화. 플루오로 - 샤오 뤼는 apoptotic 및 괴사 세포 죽음을 구분하지 않습니다. 따라서, degenerating의 뉴런의 모든 종류의이 얼룩. 6,7에 의해 감지 할 수 있습니다
여기, 우리는 하나의 죽어 또는 생존 뉴런의 수영장뿐만 아니라 강화 populati의 swaths를 얻기 위해 우리 실험실에서 사용되는 프로토콜을 설명서로 다른 neuronal 세포 유형 (외상성 뇌 손상 후 유전자 발현 분석을위한 예 CA1-CA3 뉴런)의 기능. 저희 연구실에서 수행 유체 타악 뇌 손상에 대한 절차는 Shimamura 외., 8에 자세히 설명하고 앨더 외에 의해 목성에 출판 된 마우스의 측위 유체 - 타진 부상 프로토콜과 매우 유사 수 있습니다. 9 LCM 기술이 있기 때문에 DNA의 무결성에 최소한의 또는 전혀 효과가 표시되어, RNA와 조직에 단백질,이 정의 세포 유형의 분자와 단백질 분석을위한 훌륭한 도구입니다.
Protocol
1. 수술 절차 및 외상성 뇌 손상 유체 타악기
- 모든 동물 실험이 처음 실험실 동물 (8 판, 국립 연구위원회)의 관리 및 이용 텍사스 의료 지점, Galveston, 텍사스와 건강 가이드의 국립 연구소의 대학 기관 동물 케어 및 사용위원회에 의해 승인됩니다.
- 쥐 (업체 찰스 리버스 포틀랜드에서 얻은 성인 남성의 Sprague-Dawley 쥐, 400-500그램, 메인)은 케이지 당 두 자리 잡고 있으며이 일정한 조건 동식물 사육장에 먹이와 물 광고 libitum를 제공합니다 : 빛주기를 (600 시간에 1800 사용 시간), 온도 (21 ° C 23 ° C), 습도 (40 % ~ 50 %) 일주 전에.
- 4퍼센트, isoflurane intubate 및 기계적 환기와 쥐를 마취 (NEMI 과학, 뉴 잉글랜드 의료 기기, Medway, MA)는 산소의 isoflurane 1.5-2.0 %를 쥐 : 공기 (70:30) 및 유체 - 타진 parasagittal 수 있도록 준비 부상으로 이전에 설명했다. 810
- 실험 설계에 따라 부상 후 적절한 시점에서 쥐를 희생. 신속하게, 머리를 제거 드라이 아이스에 즉시 고정 및 저장 -80에서 50 ML 관 ° C 또는 냉동 sectioning에 대한 10월에 포함 할 바로 진행합니다.
2. Sectioning와 쥐의 뇌의 착색
- 일정한 온도에서 보관하는 경우 즉시 사용하지 않는 뇌 조직은 한 달에 최대 -80 ° C에서 보관 할 수 있습니다. -80에서 고정되어 두뇌는 ° 후 sectioning에 -20 ° C에 해동 C, 그리고 다시 냉동 두 번째 해동 후 품질 RNA를 얻을하지 않습니다. 뇌가 해동 10월에 장착하고 sectioned되면, 슬라이드는 24 시간 이내에 물들과 착색 한 시간에 30 분 이내에 LCM에 사용되어야합니다. 이 양질의 RNA를 보장합니다. LCM 후, LCM 캡에서 캡처 한 세포가 일주일에 -80 ° C에서 용해 버퍼에 저장 될 수 있지만, RNA는 최고 품질을 보장하기 위해 적시에 격리해야합니다. <이/ 리>
- 전에 뇌를 sectioning에, RNase-해치와 그라 이오 스탯를 흔들고 ETOH (각 뇌 사이의 일회용 블레이드를 교체)와 브러쉬를 청소.
- -80 ° C 냉장고에서 50 ML 튜브의 뇌를 검색, -22 ° C 약 10 분에 관 해동의 온도에 그라 이오 스탯에 넣습니다. 거즈에 무대로 튜브와 장소, 최대 복부 측면에서 뇌를 제거합니다.
- 면도날 사용하여 광 chiasm의 소뇌와 앞 부분에 불과 뱃 부리 장식이있는 뇌의 뒤쪽 부분을 제거하는 뇌를 갈라. 10월 장착 매체 (조직 테크)와 cryomold을 입력하고 앞 측면으로 금형에 뇌를 넣으십시오. 가 (약 10 분) 화이트집니다 때까지 뇌 세포가 장착 매체에 고정 할 수 있습니다.
- 10월과 뇌에 표본 디스크 (조직 테크)를 고정. 금형의 뇌를 제거합니다. 표본 머리에 뇌를 삽입하고 나사를 조입니다.
- disposa를 삽입경, 낮은 프로파일 칼 홀더에 블레이드 (피셔 과학)과 레버를 조입니다.
- 10월의 외부 층을 제거하는 20 μm의 뇌를 부러 뜨리 시작합니다. hippocampal 지역에 도달하면 10 미크론 다이얼을 설정합니다. 조직 섹션 (피셔 과학)에 유리 슬라이드 나 플러스 유리 슬라이드를 삽입하여 코로나 시리얼 부분을 수집합니다. sectioning가 완료 될 때까지 슬라이드는 RNase 무료 염색의 랙에 -20 ° C에서 보존되어 있습니다.
- 조직 섹션 처리 유리에서 모든 RNases를 제거하려면, 모든 착색 용기를 닦아하고 Eliminase (피셔 과학)와 실린더를 졸업하고 밀리 Q 물에 씻어. RNase 무료 물과 모든 솔루션을 준비하고 cresyl 보라색 (시그마 - 알드리치)과 플루오로 - 파란 (조직을 화학)를 사용하기 전에 필터를 0.2 μm로 얼룩을 필터링합니다.
- 30 초에 RT에서 뇌 부분을 해동하고 75% ETOH (1 분)에 수정 프로그램입니다.
- 고정 후 단일 부상 뉴런의 LCM를 들어, RNase없는 물 (1 분)에 슬라이드를 헹굼, 1 % cresyl 보라색 (15-20 초)로 counterstain, RNase 무료 물 (2 × 30 초)에 헹구고, 플루오로 - 샤오 뤼 (4 분)와 얼룩, RNase없는 물 (3 × 1 분)에 헹굼 RNase 무료 물 (30 초), 100 % ETOH (30 초) 및 크실렌 (2 × 3 분)로 만든 95 % ETOH과 탈수.
- 고정 후 뉴런의 swaths의 LCM를 들어, RNase 무료 물 (1 분)에 슬라이드를 씻어, 1 % cresyl 보라색 (1 분)와 얼룩, (3 × 1 분)에 대한 RNase 무료 물에 헹구고, 95 %의 탈수 ETOH (2 × 30 초), 100 % ETOH (2 × 30 초) 및 크실렌 (2 × 3 분).
- 공기는 LCM하기 전에 15 분을위한 연기 후드의 모든 부분을 건조. 사람들이 방에서 방으로 이동해야 할 경우 슬라이드는 dessicant 늘어서 슬라이드 상자에, 위로, 섹션면에게 저장할 수 있습니다. 섹션 건조 후 LCM 즉시 수행되는 경우에는 최적의 결과를 얻을 수 있습니다. LCM은 30 분에서 1 시간으로 제한해야합니다. 다음 섹션에서, 우리는 EA이다 세포의 지속적인 swaths을 캡처하는 방법 첫번째 설명siest이 기술을 배우는 사람들을 위해 습득합니다. 그럼 우리가 정확하게 하나의 뉴런을 캡처하는 방법에 대해 설명합니다. 우리의 절차에서 우리는 degenerating의 뉴런의 플루오로 - 제이드 - 마커 대한 친화력에 의해 죽어 뉴런을 식별합니다. 플루오로 - 제이드 - 부정적인 세포는 뉴런을 생존 할 수 추정하고 있습니다.
3. 레이저 캡처 Microdissection (LCM)
hippocampal 뉴런의 풍부한 인구의 swaths의 LCM
- LCM은 적외선 다이오드 레이저 (생명 기술)와 PixCell 거짓말 현미경을 사용하여 수행됩니다.
- 수직 위치로 중심 조이스틱을 조정합니다. 회전 및 위치에 4X 목표를 잠그십시오.
- 현미경 단계의 중심에서 슬라이드를 놓고 해마의 영역보기에 될 때까지 수동으로 조정할 수 있습니다. 초점 이미지를 가지고 조립 및 고급 초점 조정을 사용합니다.
- 컨트롤러의 진공 버튼을 눌러 진공 척을 활성화합니다. PL에 10X 목표를 회전 잠금에이스. 굵고 정밀한 조정하여 다시 초점을 맞 춥니 다.
- CapSure 카세트 모듈과 위치 부하 선 위치에서 모자에 CapSure 매크로 LCM 캡 (생명 기술)로드합니다. 캡 주변의 모자 배치 팔과 위치를 회전합니다. 카세트 모듈에서 CapSure 캡을 제거하는 모자 배치 팔을 올립니다.
- 슬라이드 위에 모자 배치 팔을 회전하여 슬라이드 위에 팔을 아래로 내려 가서,이 슬라이드에 뚜껑을 게재합니다. 미세 초점을 조정하고 세포가 뚜껑에 검은 색 원 안에 있는지 확인하기 위해 조이스틱을 이동합니다. 모든 세포 캡처이 검은 색 원 안에 있어야합니다.
- 레이저 매개 변수를 설정합니다. 먼저, 컨트롤러의 레이저 사용하도록 설정 버튼을 누르십시오. 레이저 목표 지점은 컴퓨터 모니터에서보기 분야의 분홍색 점으로 표시됩니다.
- 75 MW, 1.0-2.0 밀리 초에 대한 최적의 셀 캡처 필요에 따라 - 레이저 초점을 맞출 65의 전원과 기간을 조정 작은에 레이저 스폿 사이즈를 (7.5 μm)로 설정합니다.
- 테에레이저 ST, 픽업 할 셀이없는 곳 지역으로 레이저 자리를 이동하려면 조이스틱을 사용합니다. 엄지 손가락 스위치를 사용하여 레이저를 발사 해요. 보이는 어두운 반지 레이저가 발사 된 명확한 지역을 둘러싸고 있는지 거리에 녹은 폴리머 지점에서 레이저 자리를 이동하고 확인하기 위해 조이스틱을 사용합니다.
- 세포를 캡처하려면 캡처 세포의 영역 위에 레이저 자리를 이동하려면 조이스틱을 사용합니다. 엄지 손가락 스위치를 사용하여 레이저를 발사 해요. 세포의 넓은 지역을 캡처 레이저를 발사하면서 조이스틱을 이동합니다. 레이저가 발사 될 때 그 대상 세포의 표면에 캡에있는 열가소성 폴리머 필름을 녹아. 폴리머 따라서 미래의 분자 응용 프로그램 샘플의 무결성을 보장 RNA, DNA 나 단백질을 변경하지, 레이저 방사선을 흡수.
- 관심의 모든 세포를 발사 한 후 캡 배치 팔을 들어 올린다. 캡처 세포는 조직 섹션에서 분리하고 CapSure 캡을 준수합니다. 나머지 조직과 누락 된 셀이 마주됩니다뷰의 분야에서 였죠. 캡에있는 세포는 또한 슬라이드의 빈 부분에있는 뚜껑을 배치하여 볼 수 있습니다.
- 모자 배치 팔을 들어 캡틴 역을 언로드하는 데 회전 할 수 있습니다. 역에 캡을 절감하고 이전 위치로 다시 모자 배치 팔을 회전 할 수 있습니다.
- 플랫폼을 따라 캡 위에 CapSure 삽입 도구를 밀어 넣습니다. 플랫폼에서 도구를 들어. 캡 부착 된 상태로 유지됩니다. 살짝 원치 않는 조직을 멀리 세척 할 수있는 CapSure 깨끗한 패드에 뚜껑을 터치합니다.
- RNAqueous 마이크로 절연 키트에서 얻은 용해 버퍼 100 μl로 가득 0.5 ML RNase 무료 튜브에 뚜껑을 놓으십시오. 세포를 lyse하는 데 30 초 동안 즉시 소용돌이 캡. 42에서 샘플을 배양 ° -80시 30 분, 동결에 대한 C ° C RNA 격리까지.
해마의 단일 FJ + 뉴런의 LCM
- 하나의 세포를 캡처하려면, CapSure 카세트 모듈과 positi에 CapSure HS LCM 캡을로드로드 라인 위치에서 캡 있습니다. 모자 배치 팔을 회전 캡 주위 위치. 카세트 모듈에서 CapSure 캡을 제거하는 모자 배치 팔을 올립니다.
- 레이저 초점을 맞출 및 단일 세포의 최적의 세포 캡처에 대한 0.45-0.50 밀리 초에 65 -75 MW에 레이저 파워와 기간을 조정 작은에 레이저 스폿 크기 (7.5 μm)을 설정합니다.
- 슬라이드 위에 모자 배치 팔을 회전하여 슬라이드를 향해 팔을 내려. 이 슬라이드에 뚜껑을 게재합니다. Capsure HS 캡 표면은 LCM 동안 샘플 상승에 자리 잡고 있습니다.
- 하나의 FJ + 세포를 통해 레이저를 이동하려면 조이스틱을 사용합니다. 캡처되는 모든 세포는 캡에 작은 검은 색 링 내에 존재해야합니다. 엄지 손가락 스위치를 사용하여 레이저를 발사 해요.
- 검은 색 원 지역 내의 모든 세포를 레이저로 발사 된 경우, 모자 배치 팔을 들어 올린다. 캡처 세포는 조직 섹션에서 분리하고 CapSure HS 캡을 준수합니다.
- 마이크로의 다른 슬라이드를 삽입합니다단계를 극복하고 HS 캡이 가득 될 때까지 FJ + 세포를 수집합니다. 용해 버퍼의 40-50 μl로 가득 0.5 ML RNase 무료 관에 뚜껑을 놓으십시오. 세포를 lyse하는 데 30 초 동안 즉시 소용돌이 캡. 42에서 샘플을 배양 ° -80시 30 분, 동결에 대한 C ° C RNA 격리까지.
4. LCM 샘플에서 총 RNA 절연가 (이 섹션은 단지 비디오 프리젠 테이션에 설명 될 것이다)
- 세포의 총 RNA는 제조업체의 프로토콜에 따라 RNAqueous - 마이크로 키트 (Ambion)를 사용하여 절연되어 있습니다. 모든 시약 및 세탁 솔루션이 키트에 제공됩니다. 필터에 용해 용액 버퍼 30 μl를 추가하여 사전 젖은 마이크로 필터 카트리지 어셈블리. 5 분 후, 10,000 × g에서 30 초 동안 필터를 원심 분리기.
- 샘플 lysate에 LCM 첨가제의 3 μl를 추가 피펫은 혼합하고 원심 분리기합니다.
- 샘플 lysate 100 % ETOH (1 / 2 볼륨)의 52 μl를 추가, 피펫은 혼합하고, 필터에 lysate를 전송하는열.
- 열에 RNA를 바인딩하기 위해 1 분에 10,000 × g에서 필터 열을 원심 분리기. 한 샘플에 대해 여러 개의 모자가있는 경우, 별도로 동일한 열을 통해 각 lysate를 돌리다.
- RNAqueous 마이크로 키트에 설명 된대로 RNA 격리 절차를 완료합니다.
- DNase 처리 등 키트에 설명 된 LCM RNA 샘플의 DNase의 불 활성화를 수행 -80에서 RNase 무료 튜브 및 매장 ° C.로 RNA를 전송
5. RNA의 정량화 및 다운 스트림 응용
RNA 품질과 정량화의 평가는 애질런트 Bioanalyzer는 제조업체의 프로토콜에 따라 피코 키트 (애질런트 테크놀로지스, 산타 클라라, CA)에서 시약을 사용하여 수행됩니다.
- 총 RNA는 애질런트 Bioanalyzer 2100 (애질런트 테크놀로지스)에서 분석합니다. 이 소프트웨어는 각각의 샘플까지 F에 RNA 무결성 번호 (린)를 지정하여 농도와 RNA 샘플의 무결성을 평가ROM 1-10. 1-5 저하 RNA를 나타냅니다과 7-10은 좋은 품질의 RNA를 나타냅니다.
- Sybr - 녹색 화학을 사용하여 개별 Taqman의 assays 또는 RT2 프로파일 러 배열, 비 저하 그대로 RNA는 리얼 타임 PCR에 사용됩니다. RNA는 mRNA의 microarray 분석 및 microRNA의 microarray 분석에 사용할 수 있습니다.
Representative Results
첫 번째 LCM 연구에서, 우리는 외상성 뇌 손상 8. 그림 1A-1C에 자신의 취약점을 반영 유전자 발현 프로파일을 가지고있는 쥐의 해마의 기능 별개의 하위 지역을 (CA1과 CA3) 표시 할 수있었습니다은 (hippocampal 피라미드 뉴런의 레이저 캡처를 보여줍니다 CA1- CA3), 이전, 그리고 LCM 후 이가있는 이랑의 뉴런과 SCN의 뉴런. 피라미드, 과립 또는 각각 SCN의 뉴런의 클린 캡처, 매크로 뚜껑에 표시됩니다. 그림 2A-2B는 설명 플루오로 - 제이드 양의 피라미드 뉴런, 죽음과 LCM 이전과 이후, 플루오로 - 파란 부정적인 피라미드 뉴런을 생존. 죽어 나 뉴런을 생존의 깨끗한 캡처 LCM 캡에 캡처 된 세포를 확인하여 표시됩니다.
LCM 후, 총 RNA는 TaqMan 또는 SYBR 녹색 화학 (그림 3A), 작은 focu를 사용하여 유전자 발현의 정량 실시간 PCR 분석을 포함한 분자 연구의 다양한 배열에 사용할 수 있습니다SYBR 녹색 프로브 (그림 3B) 또는 전체 게놈 microarray 연구 (그림 3C)와 PCR 배열을 SED.
1 그림. 쥐의 뇌에서 정의 된 세포 인구의 swaths의 레이저 캡처 microdissection은. 쥐의 뇌의 냉동 10 μm 코로나 섹션은 에탄올에 고정 nissl 얼룩 (cresyl 보라색)으로 물들과 LCM 준비되어 있습니다. 표시는 쥐 해마와 suprachiasmatic 핵의 사진 hippocampal 이가있는 이랑의 쥐 해마의 CA1-CA3 subfields에서 LCM과 매크로 캡의 시각화로 캡처 세포. A. 피라미드 뉴런 전후. B.의 과립 세포입니다. C. 정무 suprachiasmatic의 핵이 세 번째 뇌실의 양쪽에있는그리고 광 chiasma 위에 위치하고 있습니다. 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오 .
그림 2. 쥐 해마에서 하나의 뉴런의 레이저 캡처 microdissection. 표시는 CA3 뉴런 이전과 LCM 후 A. Degenerating, 플루오로 - 제이드 - 긍정적 (스테인드) hippocampal 뉴런 CA3와 B. 생존, 플루오로 - 제이드 - 제외 어 (흠없는)입니다. 캡처 된 셀 시각화 수 있습니다. 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오 .
그림 3. 총 RNA의 유전자 발현 분석은 레이저 캡처 뉴런으로부터 격리. SCN의 circadian 시계 유전자의 표현 A. 수량 실시간 PCR 데이터입니다. 초점을 맞춘 PCR 배열을 사용하여 apoptosis 관련 유전자의 표현을 보여주는 hippocampal 뉴런을 죽음과 생존의 유전자 표현의 B. 히트 . C. 애질런트 외상성 뇌 손상이나 외상성 뇌 손상 사기 상처를받은 쥐뿐만 아니라 뇌 손상 (neuronal 질소 산화물에 의해 유도 유전자의 최저 표현으로 설계된 재조합 adeno - 관련 siRNA 바이러스에서 hippocampal CA1-CA3 뉴런의 유전자 표현의 전체 - 게놈 microarray 분석 synthase와 글루타티온 퍼 옥시 데이즈-1). 더 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오 .
Discussion
이 LCM 기술은 외상성 뇌 손상의 분자 메커니즘을 이해하는 중요한 발전을 할 수있게되었습니다. 8,10,11,12,13 우리는 쥐 해마의 독특한 하위 지역은 유전자 발현 프로파일을 가지고 있다는 것을 입증하는이 기술을 활용하는 최초의 조사로 말입니다 부상의 선택적 보안 취약점과 상관 관계. 우리의 연구는 우리가 아니라 몇 십 등의 레이저 캡처 세포에서 qPCR에 의해 유전자 발현을 수량화하고 600 촬영 셀처럼 몇의 게놈 전체의 microarray 분석을 수행 할 수 있다는 수 있다는 보여 주었다. LCM은 다양한 신경과 neuropsychiatric 장애에 연루 것으로 알려져있는 다른 뇌 영역의 유사한 연구에 귀중한 도구가 될 것입니다. 예를 들어, LCM을 사용하여 연구들에 연루 보상 회로에 관여하는 핵 accumbens의 게놈 전체의 프로파일 연구를 substantia nigra, 14 도파민 뉴런에서 파킨슨 병의 pathogenesis에 빛을 버리고 왔으며ubstance 남용 장애. 15
Neuronal 이질성은 게놈 수준 16에서 반영되어 있으며 임상 실험에서 외상성 뇌 손상에 대한 실험 치료의 성공의 부족에 참여할 수 있습니다. 따라서, 우리의 목표는 외상성 뇌 손상 후 neuronal 생존에 영향을 미치는 중요한 요소를 조사하기 위해이 기술을 활용하는 것입니다. 죽음과 인접 외상성 뇌 손상 후 hippocampal 뉴런을 생존의 최근 게놈 전체의 프로파일 연구는 세포 죽음의 유전자에 세포 생존의 표현 수준의 비율을 반영하는 휴대 가감 저항기는 외상성 뇌 손상 후 세포의 운명을 조절하는 것이 좋습니다. 이러한 지속적인 연구 적극적으로 세포 생존 가감 저항기에 영향을 미칠 수 pharmacotherapeutic 전략의 설계 및 개발에 기여하는 것입니다. 또한, 현재 외상성 뇌 손상 후 hippocampal 뉴런의 잠재적 인 치료 약물 치료의 효과를 추적하고 모니터링 할 수 LCM 사용합니다. 따라서, 우리의 연구는 주어진주의 RNase 무료 처리 기술과 일부를 보여기존 프로토콜의 수정, 그건 정확한 정량 유전자 발현 분석을위한 LCM에서 고품질의 RNA 샘플을 얻을 수 있습니다.
그러나 LCM 기술과 관련된 몇 가지 함정이 있습니다. 예를 들어, microglia 오염없이 만 neuronal 세포를 수집하는 것은 거의 불가능 할 수 있습니다. 해마의 피라미드 세포 레이어에는, 세포의 95 %가 glial 및 다른 세포 유형의 작은 비율을 남겨두고 피라미드 세포와 10 %의 interneurons 될이 인구의 90 %를 뉴런. 8,17 것으로 추산되었습니다 우리의 연구에서 18 우리는 플루오로 - 비취 특히 뇌 조직 만 부상 뉴런에 이름표를 형광 염료를 사용합니다. GFAP에 대한 표시입니다 다른 얼룩이 microglia를 착색 할 필요가 것입니다. 만 플루오로 - 비취 스테인드 하나 neuronal 몸을 수집 19 뉴런의보다 동질적인 인구를 보장합니다. 문제 해결 필요할 수 있습니다 또 다른 일반적인 문제는 원이 더 있다는 것입니다 없음레이저가 발사 될 때 t는 정의. 이 문제가 발생하면 레이저 설정을 확인하고 필요에 따라 힘과 시간을 조정할 필요가 있습니다. 또한 캡이 조직에 평면 배치하고 팔에 제대로 장착되어 있는지 확인하는 것이 중요합니다. LCM 기술 설명서를 참조하거나 기술 지원을 호출하는 것은 때때로 필요합니다. LCM 및 RNA 격리 후, RNA의 품질은 항상 이전의 유전자 발현 분석에 bioanalyzer을 사용하여 평가해야한다.
레이저 절단 (생명 기술, Leica 마이크로 시스템즈) 및 (Zeiss) 악기를 catapulting 레이저를 포함한 현재 시장에서 레이저 캡처 장비의 여러 종류가 있습니다. 우리 LCM 시스템은 세포의 작은 숫자를 캡처에 적합합니다. 기타 높은 처리량 및 더 많은 자동화 된 시스템은 게놈 특히 proteomic 분석을위한 세포의 큰 숫자를 얻기위한 더 적당 할 수 있습니다. 사실, 이러한 자동화 된 시스템을 사용하여 LCM은 PR의 분석을위한 큰 잠재력을 가지고식별 셀 또는 셀의 풍부한 인구의 otein 표현. 20 또한, LCM은 우리가 가장 이질적인 조직의 복잡성에 관계없이 정의 된 셀 유형의 유전자 발현을 조사 할 수 있도록 immunolabeled 세포, 21 유전자 발현 분석을 용이하게 할 수 있습니다. 따라서, LCM은 세포의 단일 또는 풍부한 인구의 첨단 분자 연구를위한 훌륭한 도구입니다.
Disclosures
저자는 사람들이 관심 충돌이 없다는 점 선언합니다.
Acknowledgments
이 작품은 R01 NS052532 (HLH에), 무디스 재단, 그리고 마취과학과의 지원을 받고 있습니다. 우리는 로리 굵은 글꼴, 그들의 편집 지원 크리스틴 Courteau 집사와 크리스티 페리, 그리고 레이아웃 및 모든 그림, 테이블과 작품의 훌륭한 생산 크리스티 페리 감사드립니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PixCell IIe Laser Capture Microscope | Life Technologies (Arcturus) | ||
| Agilent 2100 Bioanalyzer | Agilent Technologies | ||
| RNAqueous Micro- Kit | Life Technologies (Ambion) | AM1931 | |
| Agilent 6000 Pico Kit | Agilent Technologies | 5067-1513 | |
| Capsure LCM caps | Applied Biosystems | LCM0211/LCM0214 | |
| Fluoro-Jade | Histo-chem Inc. | #1FJ | |
| Cresyl Violet Acetate | Sigma-aldrich | C5042-10G | |
| Xylene (Histological grade) | Fisher Scientific | X3P-1GAL | |
| Ethanol 200 proof (Histological grade) | UTMB pharmacy | ||
| RNase free barrier pipette tips | Fisher Scientific | 2123635, 212364, 212361, 21-236-2A | |
| Arcturus Laser Capture Microdissection system (Life Technologies) Zeiss Laser Microdissection The PALM family Leica Microsystems |
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References
- Squire, L. R., Stark, C. E., Clark, R. E.
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