Summary
Derivate da monociti macrofagi sono cellule importanti del sistema immune innato. Qui, descriviamo un facile da usare
Abstract
Macrofagi derivate da monociti rappresentano un importante tipo di cellule del sistema immune innato. Modelli murini che studiano la biologia dei macrofagi soffrono delle differenze fenotipiche e funzionali tra murine e umane derivate da monociti macrofagi. Pertanto, noi descriviamo qui un modello in vitro per generare e studiare macrofagi umani primari. In breve, dopo la centrifugazione in gradiente di densità del sangue periferico prelevato da una vena dell'avambraccio, monociti sono isolati da cellule mononucleate del sangue periferico utilizzando negativo magnetico isolamento tallone. Questi monociti vengono poi coltivate per sei giorni in condizioni specifiche per indurre diversi tipi di differenziamento macrofagi o polarizzazione. Il modello è facile da usare e elude i problemi causati dalle differenze specie-specifiche tra topo e uomo. Inoltre, è più vicino alla condizioni in vivo che l'uso di linee cellulari immortalizzate. In conclusione, il modello qui descritto è adatto per studiare macrophage biologia, individuare meccanismi di malattia e nuovi target terapeutici. Anche se non sostituendo completamente gli esperimenti con gli animali o tessuti umani ottenuti post mortem, il modello qui descritto consente l'identificazione e la validazione dei meccanismi della malattia e bersagli terapeutici che possono essere molto importanti per diverse patologie umane.
Introduction
Macrofagi derivate da monociti rappresentano un importante componente cellulare del sistema immunitario innato e contribuiscono a molti processi infiammatori acuti o cronici 1. I macrofagi giocano un ruolo importante in molte malattie infiammatorie come l'aterosclerosi o il cancro 2. Macrofagi mostrano un elevato grado di plasticità e sono in grado di assumere differenti fenotipi seconda del micromilieu locale 3. Così, studiando la differenziazione dei macrofagi e l'eterogeneità è essenziale per aumentare la nostra conoscenza della fisiopatologia di molte malattie e per consentire l'identificazione di nuovi bersagli terapeutici e lo sviluppo di nuove terapie.
In molti casi, i modelli murini sono usati per studiare la fisiopatologia di malattie specifiche. Tuttavia, lo studio della biologia dei macrofagi utilizzando modelli murini è accompagnato da numerose carenze: (1) La percentuale dei numeri sottoinsieme di leucociti (ossia monociti e granulociti) in peripHeral sangue di topi o esseri umani differisce significativamente suggerendo diversi ruoli dei monociti in fisiopatologia murine e umane. (2) Non ci sono sostanziali differenze nell'espressione genica tra murine e umane monociti del sangue periferico che suggeriscono differenze sostanziali nella loro funzione durante la salute e la malattia 4. (3) Un numero di marcatori che vengono utilizzati per identificare i monociti e macrofagi murini (F4/80, LYC, ecc.) Non esiste in cellule mieloidi umane, rendendo il trasferimento dei risultati in modelli murini per la situazione umana piuttosto difficile.
Pertanto, al fine di aumentare la nostra comprensione della differenziazione dei macrofagi e l'eterogeneità nella malattia umana, abbiamo bisogno di fare uso di modelli di lavoro con i macrofagi umani. Pertanto, noi qui descriviamo un modello di generazione macrofagi primari umani che è facile da usare e permette studio dei macrofagi derivate da monociti umani in vitro in condizioni diverse conseguente diversa macrofagi PoTipi di vascolarizzazione. In diversi studi, abbiamo usato il modello in vitro di monociti derivati da macrofagi umani primari per analizzare la biologia dei macrofagi e la sua potenziale rilevanza per l'aterosclerosi umana 5-7.
Anche se non sostituendo completamente gli esperimenti con gli animali o tessuti umani ottenuti post mortem, il modello qui descritto consente l'identificazione e la validazione dei meccanismi della malattia e bersagli terapeutici che possono essere molto importanti per diverse patologie umane.
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Protocol
1. Protocollo
- Preparare Buffer come segue:
- Preparare tampone per l'isolamento PBMC: "Tampone di lavaggio" = 0,02% in PBS EDTA (uso 0.5 M EDTA).
- Preparare buffer per l'isolamento dei monociti: "MACS risciacquo cuscinetto" = 0,5% di BSA (250 mg) + 2 mM EDTA (200 microlitri) PBS + (50 ml). Degas il buffer.
- Preparare tampone per FACS colorazione e conservazione di cellule: "FACS tampone" = 10% FCS in PBS e "Tampone di fissaggio" = 1% in PBS PFA.
- Disegnare 30 ml di sangue intero da una vena dell'avambraccio. Utilizzare EDTA come anticoagulante.
- Isolare PBMC (HISTOPAQUE) come segue:
- Preparare due provette sterili ml 50 (senza poli-stirene).
- Diluire il sangue dal punto 2 con PBS 1:1.
- Aggiungere 25 ml HISTOPAQUE + 25 ml di sangue intero / PBS per provetta. Assicurarsi che HISTOPAQUE e il sangue non si mescolano.
- Centrifugare a 400 xg per 30 min a TA, nessun freno.
- Aspirare al plasma e degli scarti.
- Aspirare interfaccia opaca e trasferirli in clean 50 ml vascae.
- Aggiungere 20 ml di 0,02% in PBS EDTA.
- Centrifugare a 250 xg per 5 minuti a 4 ° C.
- Scartare il surnatante.
- Aggiungere 10 ml di 0,02% in PBS EDTA.
- Contare le cellule come segue:
- Mescolare bene nel vortex per 10 sec.
- Prendete 200 microlitri di sospensione cellulare + 300 ml 0,02% in PBS EDTA + 500 ml di Trypan blu (200-500 cells/10 piazze, altrimenti cambiare fattore di diluizione).
- Procedere all'isolamento negativo di monociti come segue:
- Centrifugare cellule ottenute nel passo 3.10 per 10 min, 120 x g. Scartare il surnatante.
- Lavare pellet cellulare 2x aggiungendo 10 ml di PBS + 0,02% EDTA e centrifugare per 10 min, 120 x g.
- Aggiungere 9 ml di acqua sterile per 3 sec, aggiungere 1 ml di PBS 10X.
- Lavare nuovamente con PBS + 0,02% EDTA e centrifugare 10 min, 120 x g.
- Conte durante la centrifugazione.
- Diluire in tampone EasySep a 5 x 10 7 / ml.
- Aggiungere 50 cazzo arricchimento monociti microlitri / mlcoda.
- Incubare per 10 min a 4 ° C.
- Perline Vortex per 30 sec.
- Aggiungere 50 perle microlitri / ml.
- Incubare per 5 minuti a 4 ° C.
- Riempire con tampone EasySep per completare il volume di 2,5 ml. La soluzione appare ora brunastro.
- Metti nel magnete.
- Attendere 2,5 minuti a temperatura ambiente. Durante questo periodo cellule non monocitiche legati alla perla magnetica si muoveranno sulla parete del tubo e bastone lì.
- Versare il tampone con monociti non vincolanti in provetta sterile. Questa soluzione sembra biancastro.
- Lavare una volta con PBS + 0,02% EDTA e centrifugare per 10 minuti, 120 x g.
- Cellule piastra in un piatto di plastica o lamiera multiparete ad una densità di 0,5 x 10 6 / cm 2. Aggiungere 1 ml di mezzo di coltura / 1 x 10 6 cellule.
- Cellule di coltura in condizioni di interesse per 6-14 giorni.
- Cambiare i media dopo 3 giorni, sostituendo il 50% dei mezzi di comunicazione con mezzi freschi (vedi Tabella 1 per i dettagli).
- Sei giorni dopo, le cellule raccolto per l'isolamento di mRNA, citometria a flusso, Western blotting, ecc.
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Representative Results
Utilizzando il protocollo sopra descritto, abbiamo quotidianamente otteniamo 25,1 x 10 6 ± 2.2 x 10 6 monocytes/100 ml di sangue (± errore standard medio di 26 esperimenti indipendenti, Figura 1A). Purezza monociti come determinato dal flusso citometria colorazione per CD14 è ordinariamente maggiore del 95% (97,1 ± 0,4%, ± errore standard media di 3 esperimenti indipendenti, Figura 1B). La vitalità cellulare dei monociti appena isolate come determinato da trypan blu colorazione è normalmente maggiore del 95% (dati non mostrati). Mentre inizialmente le cellule sono di forma circolare e galleggiante, esse solitamente si aderisce entro poche ore. Aderenza è associato a un cambiamento di forma verso un "uovo fritto" o forma mandrino-simile (Figura 2). Dopo sei giorni di cultura con M-CSF (100 ng / ml), con o senza aggiunta di LDL ossidate (100 mcg / ml per l'ultimo 24 ore), circa il 80% delle cellule non esposte al oxLDL sono vitali, mentre treatment con oxLDL provocato circa 70% cellule vitali (Figura 3). Citofluorimetria dopo sei giorni di coltura con M-CSF dimostra che mentre le cellule mantengono esprimono il marcatore CD45RO leucocitaria, essi downregulate il marcatore monociti CD14 (Figura 4). Condizioni specifiche possono indurre la polarizzazione dei macrofagi - così macrofagi M1-M2 o polarizzati esprimono marcatori tipici come IL-6, TNF-alfa (M1) o CD36 e CD206 (M2) (Figura 5). I macrofagi possono ulteriormente essere studiati in esperimenti funzionali. Per esempio, l'assorbimento di LDL ossidata può essere studiata utilizzando fluorescente etichette LDL (Figura 6).
Figura 1. (A) il numero di monociti periferici ottenuti dopo l'isolamento tallone negativo. Numeri di cellulari sono normalizzared per 100 ml di sangue periferico. Dati di 26 esperimenti indipendenti. (B) Purezza di monociti ottenuti utilizzando l'isolamento tallone negativo come determinato mediante citometria a flusso. Rappresentante forward scatter plot lato e istogramma di CD14 colorazione, controllo negativo mostrato come linea tratteggiata.
Figura 2. Le cellule, dopo 3 e 6 giorni di cultura con M-CSF. Barra di scala = 50 micron.
Figura 3. La vitalità dei macrofagi dopo 6 giorni di cultura con M-CSF o dopo 6 giorni di cultura con M-CSF e oxLDL (100 mcg / ml) ha aggiunto l'ultimo 24 ore, come determinato dal ioduro di propidio (PI) colorazione. Rappresentante in avanti lato sctrame Atter e istogrammi per PI colorazione.
Figura 4. Citometria a flusso per il marcatore monociti CD14 sui monociti appena isolati o macrofagi derivate da monociti dopo sei giorni di cultura con M-CSF (100 ng / ml).
Figura 5. Espressione genica di IL-6, TNF-alfa, CD36 e CD206 (recettore del mannosio) in macrofagi primari umani differenziati con M-CSF (100 ng / ml, 6 giorni) e la polarizzazione verso un fenotipo M1 (LPS, 100 ng / ml , espressione e IFN-gamma, 20 ng / ml, per l'ultimo 18 ore) e M2 (IL-4, 20 ng / ml per gli ultimi 18 hr). Gene eramisurati mediante PCR quantitativa. * P <0.05, ** P <0.01.
Figura 6. (A) Immunofluorescenza immagine di macrofagi M-CSF indotte macrofagi umani. Cellule sono state esposte a 10 mcg / ml DII marcato oxLDL per 4 ore. I nuclei sono stati colorati con DAPI. Barra di scala = 50 micron. (B) Rappresentante istogramma di misurazione del flusso citometria di captazione DII-oxLDL dai macrofagi umani M-CSF-indotti. Grigio = controllo non trattato, linea nera = macrofagi oxLDL-trattati.
| Tipo | Condizioni | Refs |
| M0 |
| 7-8 | M1 |
| 8 |
| 9-10 | |
| 9 | |
| 10 | |
| 10 | |
| M2A |
| 9-10 |
| 8 | |
| 10 | |
| 8 | |
| M2B |
| 8 |
| M2C |
| 10 |
| M4 |
| 7 |
| M-Hb |
| 11 |
| M-ox | 12 | |
| Altri tipi di macrofagi |
| 13 |
Tabella 1. Esempio di condizioni e marcatori tipici della stabiliti i tipi di polarizzazione dei macrofagi M1 o M2 (si prega di consultare i riferimenti per le procedure di isolamento specifiche o le condizioni di coltura cellulare).
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Discussion
Macrofagi derivate da monociti rappresentano il tipo cellula fondamentale del sistema immune innato. Essi svolgono un ruolo importante in molte malattie infiammatorie comprese aterosclerosi o cancro 2. Pertanto, lo studio della biologia dei macrofagi è essenziale per aumentare la nostra conoscenza sulla fisiopatologia di molte malattie e per consentire lo sviluppo di nuove terapie.
Molti studi si applicano modelli di topo iperespressione o privi alcuni geni di interesse. Nel caso dei macrofagi derivate da monociti, questo non sembra il modo migliore per studiare i processi rilevanti per la malattia umana, come ci sono differenze sostanziali tra monociti murini ed umani e cellule derivate da monociti 4. Così, i modelli validi che fanno uso di cellule umane primarie sembrano una buona alternativa per studiare i meccanismi di malattie rilevanti di differenziazione dei macrofagi.
Un chiaro vantaggio del modello in vitro presentato qui è che non si basa su immortalilinee cellulari zed come THP-1 o altri 14-15. Mentre le linee cellulari possono essere facilmente ottenuti ed eludere la necessità di regolare attira il sangue, linee cellulari sono fenotipicamente e funzionalmente non identico a cellule primarie. Così, Cho et al. Hanno confrontato le firme genetiche dei macrofagi umani primari e li hanno confrontati con i dati pubblicati in precedenza ottenuti dal THP-1 12,14. Hanno trovato una significativa, ma moderata correlazione tra i due tipi di cellule che suggeriscono che cellule THP-1 non può essere il modello ideale per studiare la differenziazione dei macrofagi e l'eterogeneità, in molti casi. Inoltre, ci sono vari modelli come differenziare non aderenti monocito-simili cellule THP-1 verso macrofagi. Anche quando si utilizza il protocollo probabilmente più applicabile, in cui cellule THP-1 sono trattate con PMA seguiti da cinque giorni di riposo in cultura senza PMA (PMAR), cellule non completamente si comportano come cellule primarie 16. Presi insieme, questi risultati suggeriscono che per lo studio delle malattie umanemeccanismi a livello cellulare, macrofagi primari sembrano più adatto di linee cellulari.
Bisogna essere a conoscenza di altri metodi che permettono l'isolamento di monociti umani primari: l'adesione alla plastica, isolamento tallone positivo, o controcorrente centrifugazione elutriazione 17. Il cocktail di arricchimento monociti qui utilizzato contiene anticorpi contro il CD2, CD3, CD16, CD19, CD20, CD56, CD66b, CD123, glicoforina A e particelle magnetiche rivestite di destrano. Questi anticorpi si legano a epitopi sui leucociti diversi da monociti che possono poi legare le particelle magnetiche e si svolgono nel tubo dal campo magnetico mentre tutto non legato monociti può essere trasferito in una seconda provetta. Inoltre, il cocktail arricchimento contiene anticorpi ai recettori Fc umani (che sono altamente espresso da monociti) che impediscono il legame non specifico ai monociti. Di conseguenza, il metodo presentato qui produce "untouched" monociti non attivati con un alto grado di purezza.
Ci sono alcuni punti che devono essere tenuti a mente quando si applica questo modello. Ficoll / Histopaque centrifugazione deve essere eseguita a temperatura ambiente. EDTA nel tampone di lavaggio is necessaria per inibire il legame integrina-dipendenti di piastrine da monociti. È importante seme monociti alla giusta densità in modo da ottenere la differenziazione ottimale. Troppo Entrambi monociti semina senza bloccare o troppo densamente risultati in crescita non ottimale e differenziazione. Opzioni per modifiche includono la semina delle cellule su substrati specifici o utilizzando diversi fattori di crescita (ad esempio GM-CSF 18) o aggiunta di attivatori cellulari specifici (ad esempio, citochine o LPS 8, tabella 1).
Utilizzando cellule ottenute da individui diversi può comportare un maggior grado di variazione riguardo specifiche funzioni cellulari. Così, Martín-Fuentes et al. Hanno dimostrato che i macrofagi monociti derivati da individui diversi mostrano diverse capacità di assorbimento di colesterolo LDL 19. È interessante notare che queste differenze rimangono stabili nel tempo, suggerendo che la variazione tra le cellule provenienti da donatori diversi non sonoa causa delle diverse condizioni sperimentali, ma piuttosto riflettono differenze genetiche individuali o epigenetica. Da un lato, tale variazione maggiore richiede numeri più grandi per ottenere risultati significativi in esperimenti specifici come uptake oxLDL. Al contrario, queste differenze permettono anche ai ricercatori di studiare le differenze tra gli individui sani e malati a livello cellulare con ciò rivelando nuovi meccanismi di malattia.
Nel complesso, il protocollo descritto qui è facile da usare, riproducibile, e utile per ottenere popolazioni di monociti estremamente puri che possono poi essere differenziati verso macrofagi. A seconda delle condizioni di coltura, vari tipi di macrofagi derivate da monociti possono essere studiate consentano di identificare specifici processi fisiologici o patofisiologici pertinenti alla malattia umana.
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Disclosures
Gli autori non hanno di rivelare qualsiasi conflitto di interesse.
Acknowledgments
Ringraziamo Nadine Wambsganss per l'eccellente supporto tecnico. Questo lavoro è stato sostenuto da un finanziamento della Deutsche Forschungsgemeinschaft (GL599/1-1) e in parte da una sovvenzione da parte del Fondo Innovazione FRONTIER (Università di Heidelberg) a CAG
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 50 ml centrifuge tube (sterile) | Fisher | 055398 | |
| D-PBS (1X), liquid (no calcium or magnesium) | Invitrogen | 14190-250 | |
| EDTA | Sigma | T9285 | |
| BSA | Sigma | A-8806 | |
| FCS | Invitrogen | ||
| EasySep Human Monocyte Enrichment Kit | StemCell Technologies | 19059 | |
| EasySep Magnet | StemCell Technologies | 18000 | |
| FACS tubes | Fisher | 352008 | |
| Macrophage-SFM (1X) | Invitrogen | 12065-074 | |
| Penicillin-streptomycin | Sigma | P-4458 | |
| Nutridoma-SP | Roche | 11011375001 | |
| human M-CSF 10 μg | Peprotech | 300-25 | |
| Cell Culture Plates 6-well | Fisher | 07-200-80 |
References
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