Summary
Macrófagos derivados de monocitos son células importantes del sistema inmune innato. A continuación, describimos un fácil de utilizar
Abstract
Macrófagos derivados de monocitos representan un tipo de célula importante del sistema inmune innato. Los modelos de ratón que estudian la biología de los macrófagos sufren de las diferencias fenotípicas y funcionales entre los macrófagos derivados de monocitos murinos y humanos. Por lo tanto, aquí describimos un modelo in vitro para generar y estudiar los macrófagos humanos primarios. En pocas palabras, después de centrifugación en gradiente de densidad de sangre periférica extraída de una vena del antebrazo, los monocitos se aíslan a partir de células mononucleares de sangre periférica mediante el aislamiento del grano magnético negativo. Estos monocitos se cultivaron a continuación durante seis días en condiciones específicas para inducir diferentes tipos de diferenciación de los macrófagos o de polarización. El modelo es fácil de usar y evita los problemas causados por las diferencias de cada especie, entre el ratón y el hombre. Por otra parte, está más cerca de las condiciones in vivo que el uso de líneas celulares inmortalizadas. En conclusión, el modelo descrito aquí es adecuado para estudiar macrófagos dee biología, identificar mecanismos de la enfermedad y nuevas dianas terapéuticas. A pesar de que no sustituir completamente a los experimentos con animales o tejidos humanos obtenidos post mortem, el modelo descrito aquí permite la identificación y validación de los mecanismos de la enfermedad y dianas terapéuticas que pueden ser altamente relevantes para diversas enfermedades humanas.
Introduction
Macrófagos derivados de monocitos representan un importante componente celular del sistema inmune innato y contribuyen a muchos procesos inflamatorios agudos o crónicos 1. Los macrófagos juegan un papel importante en muchas enfermedades inflamatorias como la aterosclerosis o el cáncer 2. Los macrófagos muestran un alto grado de plasticidad y son capaces de asumir diferentes fenotipos dependiendo de la micromilieu locales 3. Por lo tanto, el estudio de la diferenciación de los macrófagos y la heterogeneidad es esencial para aumentar nuestro conocimiento de la fisiopatología de muchas enfermedades y para permitir la identificación de nuevas dianas terapéuticas y el desarrollo de terapias novedosas.
En muchos casos, los modelos murinos se utilizan para investigar la fisiopatología de las enfermedades específicas. Sin embargo, el estudio de la biología de los macrófagos utilizando modelos de ratón se acompaña de varios defectos: (1) La proporción de los números de subconjuntos de leucocitos (por ejemplo, monocitos y granulocitos) en peripheral sangre de los ratones o seres humanos difiere significativamente sugiriendo diferentes funciones de los monocitos en la fisiopatología murino y humano. (2) Existen diferencias sustanciales en la expresión génica entre los monocitos de sangre periférica murinos y humanos sugieren diferencias sustanciales en su función durante la salud y la enfermedad 4. (3) Un número de marcadores que se utilizan para identificar los monocitos murinos y macrófagos (F4/80, LyC, etc.) No existe en las células mieloides humanas, por lo que la transferencia de los resultados en modelos de ratón a la situación humana bastante difícil.
Por lo tanto, con el fin de aumentar nuestra comprensión de la diferenciación de los macrófagos y la heterogeneidad en la enfermedad humana, tenemos que hacer uso de modelos de trabajo con los macrófagos humanos. Por lo tanto, aquí describimos un modelo de generación de macrófagos primaria humana que es fácil de usar y permite el estudio de los macrófagos derivados de los monocitos humanos in vitro en diversas condiciones resultantes en diferentes macrófagos potipos vascularización. En varios estudios, hemos utilizado el modelo in vitro de los macrófagos derivados de los monocitos humanos primarios para analizar la biología de los macrófagos y su potencial relevancia para la aterosclerosis humana 5-7.
A pesar de que no sustituir completamente a los experimentos con animales o tejidos humanos obtenidos post mortem, el modelo descrito aquí permite la identificación y validación de los mecanismos de la enfermedad y dianas terapéuticas que pueden ser altamente relevantes para diversas enfermedades humanas.
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Protocol
1. Protocolo
- Prepare Buffers la siguiente manera:
- Preparar tampón para aislar PBMC: "Tampón de lavado" = 0,02% de EDTA en PBS (uso 0,5 M EDTA).
- Preparar tampón para el aislamiento de monocitos: "tampón MACS aclarado" = 0,5% de BSA (250 mg) + 2 mM de EDTA (200 l) + PBS (50 ml). Desgasifica la memoria intermedia.
- Preparar tampón de tinción FACS y almacenamiento de las células: "tampón FACS" = 10% de FCS en PBS y "tampón de fijación" = 1% de PFA en PBS.
- Dibuja 30 ml de sangre entera de una vena del antebrazo. Usa EDTA como anticoagulante.
- Aislar PBMC (Histopaque) de la siguiente manera:
- Preparar dos tubos estériles de 50 ml (sin poli-estireno).
- Diluir la sangre desde el paso 2 con PBS 1:01.
- Añadir 25 ml Histopaque + 25 ml de sangre entera / PBS por tubo. Asegúrese de que Histopaque y la sangre no se mezclan.
- Centrifugar a 400 xg durante 30 min a TA, sin freno.
- Aspirar plasma y descarte.
- Aspirar interfaz opaca y pipeta en limpio 50 ml bañerae.
- Añadir 20 ml de 0,02% de EDTA en PBS.
- Centrifugar a 250 xg durante 5 min a 4 ° C.
- Desechar el sobrenadante.
- Añadir 10 ml de 0,02% de EDTA en PBS.
- Contar las células como sigue:
- Mezclar bien con un vórtex durante 10 s.
- Tomar 200 l de suspensión celular + 300 l 0,02% de EDTA en PBS + 500 l de azul de tripano (200-500 células/10 plazas, de lo contrario cambiar el factor de dilución).
- Realizar el aislamiento negativo de los monocitos de la siguiente manera:
- Centrifugar las células obtenidas en la etapa 3.10 durante 10 min, 120 x g. Desechar el sobrenadante.
- Lavar 2x sedimento celular mediante la adición de 10 ml de PBS + 0,02% de EDTA y se centrifuga durante 10 min, 120 x g.
- Añadir 9 ml de agua estéril durante 3 segundos, añadir 1 ml de PBS 10X.
- Lavar una vez más con PBS + 0,02% de EDTA y se centrifuga 10 min, 120 x g.
- Contar durante la centrifugación.
- Diluir en tampón EasySep a 5 x 10 7 / ml.
- Añadir 50 l / ml polla enriquecimiento de monocitoscola.
- Incubar durante 10 min a 4 ° C.
- Cuentas Vortex durante 30 segundos.
- Añadir 50 l / ml de perlas.
- Incubar durante 5 min a 4 ° C.
- Llenar con tampón EasySep para completar el volumen de 2,5 ml. La solución ahora aparece de color marrón.
- Poner en imán.
- Esperar 2,5 min a TA. Durante este tiempo, las células no monocıticas vinculados a la perla magnética se trasladarán a la pared del tubo y se adhieren allí.
- Vierta tampón con monocitos no vinculantes en el tubo estéril fresco. Esta solución parece blanquecino.
- Lavar una vez con PBS + 0,02% de EDTA y se centrifuga durante 10 min, 120 x g.
- Células de la placa en una placa de plástico o placa de paredes múltiples a una densidad de 0,5 x 10 6 / cm 2. Añadir 1 ml de medio de cultivo / x 10 6 células 1.
- Células de cultivo en condiciones de interés para 6-14 días.
- Cambie los medios después de 3 días, sustituyendo el 50% de los medios de comunicación por medio fresco (ver Tabla 1 para más detalles).
- Seis días después, las células de la cosecha para el aislamiento de ARNm, citometría de flujo, transferencia Western, etc.
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Representative Results
Utilizando el protocolo descrito anteriormente, que habitualmente obtenemos 25.1 sangre x 10 6 ± 2,2 x 10 6 monocytes/100 ml (media ± error estándar de 26 experimentos independientes, Figura 1A). Pureza de monocitos tal como se determina por tinción de citometría de flujo para CD14 es habitualmente mayor que 95% (97,1 ± 0,4%, media ± error estándar de 3 experimentos independientes, la Figura 1B). La viabilidad celular de los monocitos recién aislados como se determina por tinción con azul de tripano es habitualmente mayor que 95% (datos no mostrados). Mientras que las células inicialmente son de forma redonda y el flotador, que por lo general comienzan a adherirse a las pocas horas. La adhesión se asocia con un cambio de forma hacia un "huevo frito" o en forma de huso como (Figura 2). Después de seis días de cultivo con M-CSF (100 ng / ml) con o sin adición de LDL oxidada (100 g / ml para el último 24 horas), más o menos 80% de las células no expuestas a oxLDL son viables, mientras que Tretamiento con oxLDL resultó en aproximadamente 70% de células viables (Figura 3). La citometría de flujo después de seis días de cultivo con M-CSF demuestra que mientras que las células continúan expresando el marcador leucocitario CD45RO, que regulan negativamente el marcador de monocitos CD14 (Figura 4). Condiciones específicas pueden inducir la polarización de macrófagos - por lo tanto los macrófagos M1-M2-polarizada o expresan marcadores típicos como la IL-6, TNF-alfa (M1) o CD36 y CD206 (M2) (Figura 5). Los macrófagos pueden además ser estudiados en experimentos funcionales. Por ejemplo, la captación de LDL oxidada puede ser estudiada usando fluorescencia etiquetas LDL (Figura 6).
Figura 1. (A) El número de monocitos periféricos obtenidos después del aislamiento del talón negativo. Números celulares son normalizard de 100 ml de sangre periférica. Los datos de 26 experimentos independientes. (B) La pureza de los monocitos obtenidos mediante el aislamiento del grano negativa determinada por citometría de flujo. Representante adelante parcela dispersión lateral y el histograma de CD14 tinción, control negativo se muestra como una línea punteada.
Figura 2. Las células después de 3 días de cultivo y 6 con M-CSF. Barra de escala = 50 micras.
Figura 3. La viabilidad de los macrófagos después de 6 días de cultivo con M-CSF o después de 6 días de cultivo con M-CSF y oxLDL (100 mg / ml) durante las últimas 24 horas según lo determinado por el yoduro de propidio (PI) tinción. Representante delantero lado scparcelas Atter e histogramas para la tinción PI.
La Figura 4. La citometría de flujo para el marcador de monocitos CD14 en los monocitos recién aislados o los macrófagos derivados de los monocitos después de seis días de cultivo con M-CSF (100 ng / ml).
Figura 5. La expresión génica de IL-6, TNF-alfa, CD36 y CD206 (receptor de manosa) en los macrófagos humanos primarios diferenciados con M-CSF (100 ng / ml, 6 días) y el polarizado hacia un fenotipo M1 (LPS, 100 ng / ml , y IFN-gamma, 20 ng / ml, para el último 18 horas) o M2 (IL-4, 20 ng / ml para el último 18 hr). La expresión génica semedido mediante PCR cuantitativa. * P <0,05, ** P <0,01.
La Figura 6. (A) Imagen de inmunofluorescencia de macrófagos M-CSF inducidas por macrófagos humanos. Las células se expusieron a 10 g / ml de Dil-oxLDL marcado durante 4 horas. Los núcleos se tiñeron con DAPI. Barra de escala = 50 m. (B) Representante histograma de citometría de flujo de la medición de la captación de Dil-oxLDL por los macrófagos humanos M-CSF-inducidos. Gris = testigo sin tratar, la línea de negro = macrófagos oxLDL tratados.
| Tipo | Condiciones | Refs |
| M0 |
| 7-8 | M1 |
| 8 |
| 9-10 | |
| 9 | |
| 10 | |
| 10 | |
| M2a |
| 9-10 |
| 8 | |
| 10 | |
| 8 | |
| M2b |
| 8 |
| M2c |
| 10 |
| M4 |
| 7 |
| M-Hb |
| 11 |
| M-buey | 12 | |
| Otros tipos de macrófagos |
| 13 |
Tabla 1. Ejemplo de condiciones y marcadores típicos de tipos de polarización de macrófagos M1 o M2 establecidos (consulte las referencias de procedimientos de aislamiento o de sus condiciones de cultivo celular).
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Discussion
Macrófagos derivados de monocitos representan el tipo de célula clave del sistema inmune innato. Juegan un papel importante en muchas enfermedades inflamatorias, incluyendo la aterosclerosis o el cáncer 2. Por lo tanto, el estudio de la biología de los macrófagos es esencial para aumentar nuestro conocimiento sobre la fisiopatología de muchas enfermedades y permitir el desarrollo de terapias novedosas.
Muchos estudios se aplican modelos de ratón que sobreexpresan o carecen de ciertos genes de interés. En el caso de los macrófagos derivados de los monocitos, esto no parece ser la mejor manera de estudiar los procesos relevantes para las enfermedades humanas, ya que hay diferencias sustanciales entre los monocitos murinos y humanos y las células derivadas de monocitos 4. Por lo tanto, los modelos válidos que hacen uso de células humanas primarias parecen una buena alternativa para estudiar los mecanismos de la enfermedad-pertinentes de diferenciación de los macrófagos.
Una clara ventaja del modelo in vitro que aquí se presenta es que no se basa en immortalilíneas celulares zed como THP-1 u otros 14-15. Mientras que las líneas de células pueden ser fácilmente obtenidos y evitar la necesidad de extracciones de sangre normal, líneas celulares son fenotípicamente y funcionalmente no idénticas a las células primarias. Por lo tanto, Cho et al. Han comparado los genes de las firmas de los macrófagos humanos primarios y los comparó con los datos publicados previamente obtenidos de THP-1 12,14. Se encontró una correlación significativa, pero moderada entre ambos tipos de células que sugieren que las células THP-1 no puede ser el modelo ideal para estudiar la diferenciación de los macrófagos y la heterogeneidad en muchos casos. Además, hay varios modelos de la forma de diferenciar los monocitos como células no adherentes THP-1 hacia los macrófagos. Incluso cuando se utiliza el protocolo probablemente más aplicable en el que las células THP-1 se tratan con PMA seguida de cinco días de descanso en la cultura sin PMA (pMAR), las células no enteramente se comportan como células primarias 16. Tomados en conjunto, estos hallazgos sugieren que para el estudio de enfermedades humanasmecanismos a nivel celular, los macrófagos primarios parecen más adecuados que las líneas celulares.
Uno tiene que ser consciente de otros métodos que permiten el aislamiento de los monocitos humanos primarios: la adhesión a plástico, aislamiento positiva de la microesfera, o contador de flujo de centrifugación elutriación 17. El cóctel de enriquecimiento de monocitos utilizado aquí contiene anticuerpos contra CD2, CD3, CD16, CD19, CD20, CD56, CD66b, CD123, glicoforina A y partículas magnéticas recubiertas de dextrano. Estos anticuerpos se unen a epítopos en los leucocitos distintos de los monocitos que se puede posteriormente unir las partículas magnéticas y se llevan a cabo en el tubo por el campo magnético, mientras que todos los monocitos no unido puede ser transferido a un segundo tubo. Por otra parte, el cóctel de enriquecimiento contiene anticuerpos a los receptores Fc humanos (que son altamente expresado por los monocitos) que impiden la unión no específicos a los monocitos. En consecuencia, el método presentado aquí proporciona "vírgenes" monocitos no activados con un alto grado de pureza.
Hay algunos puntos que deben tenerse en cuenta al aplicar este modelo. Ficoll / Histopaque centrifugación debe llevarse a cabo a temperatura ambiente. EDTA en el tampón de lavado is necesaria para inhibir la unión de la integrina-dependientes de las plaquetas a los monocitos. Es importante a las semillas de los monocitos en la densidad de la derecha con el fin de lograr una diferenciación óptima. Tanto los monocitos siembra demasiado flojo o demasiado denso provoca crecimiento subóptimo y diferenciación. Opciones para cambios incluyen la siembra de las células sobre sustratos específicos o el uso de diferentes factores de crecimiento (por ejemplo, GM-CSF 18) o la adición de activadores de células específicas (por ejemplo, citoquinas o LPS 8, Tabla 1).
El uso de células obtenidas a partir de diferentes individuos puede resultar en un mayor grado de variación respecto a las funciones celulares específicas. Por lo tanto, Martín-Fuentes et al. Han demostrado que los macrófagos derivados de los monocitos de diferentes individuos presentan diferentes capacidades de absorción de LDL 19. Curiosamente, estas diferencias siguen siendo estables en el tiempo lo que sugiere que la variación entre células de diferentes donantes no estándebido a las diferentes condiciones experimentales, sino más bien reflejar diferencias genéticas o epigenéticas individuales. Por un lado, esta variación más grande requiere grandes cantidades para obtener resultados significativos en experimentos específicos, como la captación de oxLDL. Por el contrario, estas diferencias también permiten a los investigadores a estudiar las diferencias entre individuos sanos y enfermos a nivel celular, lo que revela nuevos mecanismos de la enfermedad.
En general, el protocolo descrito aquí es fácil de usar, reproducibles, y útil para obtener poblaciones de monocitos extremadamente puros que pueden entonces ser diferenciados hacia los macrófagos. Dependiendo de las condiciones de cultivo, varios tipos de macrófagos derivados de los monocitos pueden ser estudiados permitiendo la identificación de los procesos fisiológicos y fisiopatológicos específicos relacionados con las enfermedades humanas.
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Disclosures
Los autores no tienen que revelar cualquier conflicto de intereses.
Acknowledgments
Agradecemos Wambsganss Nadine por su excelente asistencia técnica. Este trabajo fue apoyado por una beca de la Deutsche Forschungsgemeinschaft (GL599/1-1) y en parte por una subvención del Fondo de Innovación FRONTIER (Universidad de Heidelberg) al CAG
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 50 ml centrifuge tube (sterile) | Fisher | 055398 | |
| D-PBS (1X), liquid (no calcium or magnesium) | Invitrogen | 14190-250 | |
| EDTA | Sigma | T9285 | |
| BSA | Sigma | A-8806 | |
| FCS | Invitrogen | ||
| EasySep Human Monocyte Enrichment Kit | StemCell Technologies | 19059 | |
| EasySep Magnet | StemCell Technologies | 18000 | |
| FACS tubes | Fisher | 352008 | |
| Macrophage-SFM (1X) | Invitrogen | 12065-074 | |
| Penicillin-streptomycin | Sigma | P-4458 | |
| Nutridoma-SP | Roche | 11011375001 | |
| human M-CSF 10 μg | Peprotech | 300-25 | |
| Cell Culture Plates 6-well | Fisher | 07-200-80 |
References
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