Summary
Monosit türevli histiositlerinden doğuştan gelen bağışıklık sisteminin önemli bir hücrelerdir. Burada, kullanımı kolay tarif
Abstract
Monosit türevli histiositlerinden doğuştan gelen bağışıklık sisteminin önemli bir hücre tipi temsil etmektedir. Makrofaj biyoloji okuyan fare modellerinde sıçangil ve insan monosit türevli histiositlerinden arasındaki fenotipik ve fonksiyonel farklılıklar muzdarip. Bu nedenle, burada primer insan makrofaj oluşturmak ve okumak için bir in vitro model tarif eder. Kısaca, bir kol damarından çekilerek periferik kan yoğunluk gradyan santrifüj işleminden sonra, monositler negatif manyetik boncuk ayırma kullanılarak periferik kan mononükleer hücreler izole edilmiştir. Bu monositler sonra makrofaj değişimi ya da polarizasyon farklı indüklemek için özel koşullar altında altı gün boyunca kültüre edilmiştir. Model kullanımı kolaydır ve fare ve insan arasında türe özgü farklılıklardan kaynaklanan sorunlar circumvents. Ayrıca, ölümsüzleştirilmiş hücre çizgilerinin kullanımı daha in vivo koşullarda daha yakındır. Sonuç olarak, burada açıklanan model macrophag incelemek için uygun bire biyoloji, hastalık mekanizmaları ve yeni tedavi hedefleri belirlemek. Olsa da tamamen ölüm sonrası elde edilen hayvan veya insan dokularıyla çapraz olmayan değiştirme deneyleri, burada açıklanan model hastalık mekanizmalarını ve çeşitli insan hastalıkları için son derece uygun olabilir terapötik hedeflerin tanımlanması ve doğrulamasını sağlar.
Introduction
Monosit türevli histiositlerinden doğuştan gelen bağışıklık sisteminin önemli bir hücresel bileşeni temsil etmektedir ve birçok akut veya kronik enflamatuar süreçleri 1 katkıda bulunur. Makrofajlar, ateroskleroz ya da kanser 2 gibi birçok enflamatuar hastalıklarda önemli bir rol oynamaktadır. Makrofajlar plastisite yüksek derecede göstermek ve yerel micromilieu 3 bağlı olarak farklı fenotipleri kabul edebiliyoruz. Böylece, makrofaj farklılaşma ve heterojen okuyan birçok hastalığın patofizyolojisi bilgimizi artırmak için gerekli olan ve yeni tedavi hedefleri ve yeni tedavilerin geliştirilmesi tespitine imkan vermek.
Birçok durumda, kemirgen modelleri belirli hastalıkların patofizyolojisi araştırmak için kullanılır. Ancak, fare modelleri ile makrofaj biyoloji okuyan birçok eksiklikleri eşlik ediyor: (1) perip lökosit alt numaraları oranı (yani monosit ve granülosit)fare veya insanların Heral kan önemli ölçüde fare ve insan patofizyolojisinde monositlerin farklı roller düşündüren değişir. (2) sağlık ve hastalık 4 sırasında fonksiyonu önemli farklılıklar öne fare ve insan periferik kan monositler arasında gen önemli farklılıklar vardır. (3) insan duruma fare modellerinde bulguların transferi oldukça zor hale insan miyeloid hücrelerde yok fare monositler ve makrofajlar (F4/80, LYC, vb.) Tanımlamak için kullanılır işaretleri bir dizi.
Bu nedenle, insan hastalıklarında makrofaj farklılaşması ve heterojen anlaşılması artırmak amacıyla, insan makrofaj çalışma modelleri kullanmak gerekir. Dolayısıyla, burada kullanımı kolay ve farklı makrofaj po ile sonuçlanan, çeşitli koşullar altında in vitro olarak insana ait monositlerden türetilmiş makrofaj çalışma sağlar insan birincil makrofaj nesil bir modeli tanımlamaklarization türleri. Çeşitli çalışmalarda, böylece makrofaj biyoloji ve 5-7 insan ateroskleroz için potansiyel alaka analiz etmek için monosit türevli primer insan makrofajlarda in vitro modeli kullandık.
Olsa da tamamen ölüm sonrası elde edilen hayvan veya insan dokularıyla çapraz olmayan değiştirme deneyleri, burada açıklanan model hastalık mekanizmalarını ve çeşitli insan hastalıkları için son derece uygun olabilir terapötik hedeflerin tanımlanması ve doğrulamasını sağlar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Protokol
- Aşağıdaki gibi tamponlar hazırlamak:
- Hücre izolasyonu için tampon hazırlayın: "tampon yıkayın" PBS içinde =% 0.02 EDTA (kullanımı 0.5 M EDTA).
- Monosit izolasyonu için tamponu hazırlayın: "durulama MACS tamponu" =% 0.5 BSA (250 mg) + 2 mM EDTA (200 ul) + PBS (50 mL) eklenmiştir. Degas tampon.
- "FACS tampon" PBS =% 10 FCS ve "sabitleme tampon" PBS =% 1 PFA: hücrelerin FACS boyaması ve depolama tamponu hazırlayın.
- Bir kol damardan 30 ml tam kan çizin. Antikoagulan olarak EDTA kullanın.
- Aşağıdaki gibi hücre (Histopaque) izole:
- Iki steril 50 ml tüpler (no poli-stiren) hazırlayın.
- PBS 1.1 ile birlikte, adım 2 kan sulandırmak.
- + 25 ml tam kan / PBS tüp başına 25 ml histopaque ekleyin. Histopaque ve kan karışmaz emin olun.
- RT, hiçbir fren az 30 dakika 400 x g'de santrifüj.
- Plazma ve atın aspire.
- Temiz 50 ml küvetin içine opak arayüzü ve pipet aspiree.
- PBS içinde% 0,02 EDTA, 20 ml ilave edilir.
- 4 ° C'de 5 dakika boyunca 250 x g'de santrifüj
- Süpernatant atın.
- PBS içinde% 0,02 EDTA, 10 ml ilave edilir.
- Şöyle hücreleri hesaplama:
- 10 sn için vorteks ile iyice karıştırın.
- 200 ul hücre süspansiyonu + 300 ul PBS içinde% 0.02 EDTA + Tripan mavisi (200-500 cells/10 kareler, aksi seyreltme faktörü değiştirmek) 500 ul alın.
- Aşağıdaki gibi monosit olumsuz izolasyonu gerçekleştirin:
- 10 dakika, 120 x g için adım 3.10 'da elde edilen hücreler santrifüj. Süpernatant atın.
- 10 ml PBS +% 0.02 EDTA ve 10 dakika 120 x g'de santrifüj eklenerek hücre pelletini 2x yıkayın.
- 1 ml 10X PBS ekleyin, 3 saniye boyunca 9 ml steril su ekleyin.
- PBS +% 0.02 EDTA ile bir kez daha yıkanır ve 10 dakika 120 x g'de santrifüj edilir.
- Santrifüj sırasında sayın.
- 5 x 10 7 / ml 'de EasySep tamponu içinde seyreltilir.
- 50 ml / ul monosit zenginleştirme horoz eklekuyruk.
- 10 dakika 4 ° C'de inkübe edin
- 30 saniye vorteks boncuk.
- 50 ul / ml 'boncuk ekleyin.
- 5 dakika 4 ° C'de inkübe edin
- 2.5 ml'lik bir hacme tamamlamak için EasySep tamponu ile doldurun. Çözüm şimdi kahverengimsi görünür.
- Cazibe merkezi haline koymak.
- Oda sıcaklığında 2.5 dakika bekleyin. Bu süre boyunca, manyetik boncuk bağlı olmayan monositik hücreler tüp duvarı taşımak ve orada yapışır.
- Taze steril tüpe bağlayıcı olmayan monositler ile tampon dökün. Bu çözüm beyazımsı görünüyor.
- PBS +% 0.02 EDTA ile bir kez yıkayın ve 10 dakika, 120 x g santrifüj.
- 0.5 x 10 6 / cm 2 lik bir yoğunlukta bir plastik çanak ya da çok katlı plaka plaka hücreleri. Kültür ortamı / 1 x 10 6 hücre 1 ml ilave edilir.
- 6-14 gün için ilgi çekici koşullar altında kültürü hücreleri.
- Taze medya (Ayrıntılar için bakınız Tablo 1) ile medyanın% 50 yerine 3 gün sonra medya değiştirin.
- MRNA izolasyon, akım sitometri, Batı blot, vb için altı gün hasat hücreleri sonra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Yukarıda açıklanan protokolü kullanarak, rutin 25.1 x 10 6 ± 2.2 x 10 6 monocytes/100 ml kan (26 bağımsız deneylerden ortalama ± standart hata, Şekil 1A) edinin. CD14 için akış sitometrisi ile boyama ile saptandığı gibi monosit saflık rutin olarak% 95'ten daha fazla (97.1 ± 0.4%, 3 bağımsız deney, Şekil 1B ortalama ± standart hata) 'dir. Tripan mavi boyama ile saptandığı haliyle taze izole edilmiş monositlerin, hücre canlılığını% 95 (veriler gösterilmemiştir) daha rutin olarak daha büyüktür. Ilk hücreleri yuvarlak şekilli ve şamandıra olsa da, genellikle birkaç saat içinde kalarak başlar. Bağlılık bir "kızarmış yumurta" veya iğ gibi şekil (Şekil 2) doğru bir şekil değişikliği ile ilişkilidir. Ya da oksitlenmiş LDL ek olarak (son 24 saat boyunca 100 mg / ml) olmadan M-CSF (100 ng / ml) ile kültür içinde altı gün sonra, oxLDL maruz kalmayan hücre yaklaşık% 80 tre ise, yaşayabiliroxLDL ile yaklaşık% 70, olgunun canlı hücreleri (Şekil 3) ile sonuçlanmıştır. M-CSF ile kültür altı gün sonra akış sitometrisi hücreleri lökosit işaretleyici CD45RO ifade devam ederken, bu monosit işaretleyici CD14 (Şekil 4) baskılanabileceği olduğunu göstermektedir. Özel koşullar makrofaj polarizasyon neden olabilir - böylece M1-veya M2-polarize makrofajlar IL-6 gibi tipik işaretleri, TNF-alfa (M1) veya CD36 ve CD206 (M2) (Şekil 5) ifade eder. Makrofajlar daha fonksiyonel deneylerde incelenebilir. Örneğin, oksitlenmiş LDL alımı floresan etiketler LDL (Şekil 6) kullanılarak incelenebilir.
Şekil 1. (A) negatif boncuk izolasyon sonunda periferik monosit sayıları. Hücre sayıları normale olanperiferik kan 100 ml d. 26 bağımsız deneyin verileridir. (B), monosit Saflık akış sitometrisi ile negatif olarak boncuk izolasyon kullanarak elde edilmektedir. CD14 boyama Temsilcisi ileri tarafında dağılım çizim ve histogram, noktalı çizgi olarak gösterilen negatif kontrol.
Şekil 2. M-CSF ile 3 ve 6 gün kültürlendikten sonra hücreler. Ölçek çubuğu = 50 mikron.
Şekil 3,. Propidium iyodür (PI), boyama ile saptandığı gibi M-CSF ve M-CSF ve oxLDL (100 ug / mi) ile kültürde 6 gün sonra kültürde 6 gün sonra makrofaj Canlılık son 24 saat boyunca eklenir. Ileri Örnek yan SCardıl araziler ve PI boyama için histogramlar.
Şekil 4. M-CSF (100 ng / ml) ile kültür içinde altı gün sonra taze izole edilmiş monositler veya monosit türevli, makrofajlar üzerindeki monosit işaretleyici CD14 için akış sitometrisi.
Şekil 5,. IL-6 ve gen ekspresyonu, TNF-a, M-CSF (100 ng / ml, 6 gün) ve (LPS, 100 ng / ml bir M1 fenotip doğru polarize ile ayrıştırılan primer insan makrofajlarda, CD36 ve CD206 (manoz reseptörü) ve IFN-gama, 20, son 18 saat için ng / ml) ya da M2 (IL-4, son olarak, 18 saat boyunca 20 ng / ml). gen ekspresyonu yapıldıkantitatif PCR vasıtasıyla ölçüldü. * P <0.05, ** p <0.01.
6 Şekil. M-CSF-kaynaklı makrofaj insan makrofaj bölgesinin (A), immünofloresan görüntüsü. Hücreler 10 ug / ml, 4 saat boyunca DiI-etiketli oxLDL maruz bırakıldı. Çekirdekler DAPI ile boyandı. Ölçek çubuğu = 50 mikron. M-CSF kaynaklı insan makrofajlar tarafından DII-oxLDL alımını akım sitometrik ölçüm (B) Temsilcisi histogram. Gri = tedavi edilmemiş kontrolü, siyah çizgi = oxLDL ile tedavi edilen makrofajlar.
| Tip | Koşullar | Refs |
| M0 |
| 7-8 | M1 |
| 8 |
| 9-10 | |
| 9 | |
| 10 | |
| 10 | |
| M2a |
| 9-10 |
| 8 | |
| 10 | |
| 8 | |
| M2b |
| 8 |
| M2C |
| 10 |
| M4 |
| 7 |
| M-Hb |
| 11 |
| M-öküz | 12 | |
| Diğer makrofaj türleri |
| 13 |
Tablo 1. Koşulları ve kurulan M1 veya M2 makrofaj polarizasyon türleri tipik işaretleri için Örnek (özel izolasyon prosedürleri veya hücre kültürü koşulları için referanslar bakın).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Monosit türevli histiositlerinden doğuştan gelen bağışıklık sisteminin temel hücre tipini temsil etmektedir. Ateroskleroz veya kanser 2 de dahil olmak üzere, pek çok enflamasyonlu hastalıkların önemli bir rol oynamaktadır. Böylece, makrofaj biyoloji okuyan birçok hastalığın patofizyolojisi üzerinde bilgilerimizi artırmak için gerekli olan ve yeni tedavilerin geliştirilmesi izin vermek.
Birçok çalışma, fare modelleri eksprese uygulamak veya ilgi bazı genlerin eksik. Monosit türevli histiositlerinden durumunda, bu kemirgen ve insan monosit ve monosit türevli hücreler, 4 arasında önemli farklar olduğu gibi, insan hastalığı ile ilgili süreçler çalışma için en iyi yol olarak görünmemektedir. Böylece, birincil insan hücrelerinin yararlanarak geçerli modellerinin makrofaj farklılaşma hastalık ilgili mekanizmaları incelemek için iyi bir alternatif gibi görünüyor.
Burada sunulan in vitro model açık bir avantajı immortali dayanmaz olduğunuTHP-1 ya da başkaları gibi 14-15 Zed hücre çizgileri dahildir. Hücre hatları kolayca elde olması ve düzenli kan çekiyor ihtiyacını aşmak mümkün olmakla birlikte, hücre hatları fenotipik ve birincil hücreler işlevsel olarak aynı değildir. Bu nedenle, Cho ve ark. Primer insan makrofaj gen imza karşılaştırılır ve THP-1 12,14 elde edilen daha önce yayınlanmış veriler ile karşılaştırdık. Bunlar THP-1 hücreleri, bir çok durumda, makrofaj farklılaşması ve heterojen incelemek için ideal bir model olmayabileceğini öne hem de hücre tipleri arasında önemli bir, fakat orta korelasyon bulunmuştur. Ayrıca, nasıl makrofajlar doğru yapışmayan monosit benzeri THP-1 hücreleri ayırt etmek için çeşitli modeller vardır. THP-1 hücreleri PMA ile tedavi PMA (PMAr) olmadan kültürde dinlenme beş gün takip edildiği muhtemelen en uygun protokolü kullanarak bile, hücreler tamamen birincil hücreler gibi 16 davranmazlar. Birlikte alındığında, bu bulgular, insan hastalığının çalışma için düşündürmektedirBir hücresel düzeyde mekanizmaları, primer makrofajlar hücre hatları daha uygun görünüyor.
Plastik, pozitif boncuk izolasyon, ya da karşı akış santrifüj elutrasyon 17 bağlılık: Bir birincil insan monosit izolasyon sağlayan diğer yöntemler farkında olmak zorundadır. Burada kullanılan monosit zenginleştirme kokteyl CD2, CD3, CD16, CD19, CD20, CD56, CD66b, CD123, glycophorin A ve dekstran kaplı manyetik partiküllere karşı antikorları içerir. Bu antikorlar daha sonra manyetik parçacıkların bağlamak monositler başka lökositlerin üzerindeki epitoplara bağlanan ve tüm bağlanmamış monosit, ikinci bir tüp içine transfer edilebilir ise manyetik alan tarafından tüp içinde düzenlenmektedir. Ayrıca, zenginleştirme kokteyl monositlere non-spesifik bağlanmayı önleyen insan Fc reseptörleri (yüksek monositleri tarafından ifade edildiği) bir antikor içerir. Buna uygun olarak, burada sunulan yöntem, yüksek bir saflık derecesi ile "dokunulmamış" aktif olmayan monositler verir.
Bu modeli uygularken akılda tutulması gereken bazı noktalar vardır. Ficoll / Histopaque santrifüj oda sıcaklığında yapılmalıdır. Yıkama tamponu EDTA is gerekli monositlere platelet integrin bağımlı bağlanmasını inhibe etme. Tohum doğru yoğunlukta monositler uygun farklılaşma elde etmek için önemlidir. Optimal büyüme ve farklılaşma hem ekim monositler çok gevşek veya çok yoğun sonuçları. Değişikliği için seçenekler belirli alt tabakalar üzerinde hücrelerin ekim veya farklı büyüme faktörlerinin (örneğin, GM-CSF, 18) ya da belirli bir hücre aktivatörleri (örneğin, sitokinler ya da LPS 8, Tablo 1) kullanarak ilave yer alır.
Farklı bireylerden alınan hücreler kullanılarak, spesifik hücresel fonksiyonları ile ilgili daha yüksek derecede bir varyasyon ile sonuçlanabilir. Bu nedenle, Martin-Fuentes et al. Farklı bireylerden monosit türevli histiositlerinden LDL alımı 19 farklı kapasitelerde gösterdiğini göstermiştir. İlginç bir şekilde, bu farklılıklar farklı donörlerden hücreleri arasındaki varyasyon değildir düşündüren zaman içinde sabit kalmasıfarklı deneysel koşullar nedeniyle değil, bireysel genetik veya epigenetik farklılıkları yansıtmaktadır. Bir yandan, bu daha geniş varyasyon oxLDL alımını gibi özel deneylerde belirgin sonuçlar elde etmek için daha fazla sayıda gerektirir. Buna karşılık, bu farklılıklar da araştırmacılar böylece yeni hastalık mekanizmaları ortaya bir hücresel düzeyde sağlıklı ve hastalıklı bireyler arasındaki farklılıkları incelemek sağlar.
Genel olarak, burada açıklanan protokol daha sonra makrofajlar doğru ayırt edilebilir son derece saf monosit nüfus elde etmek için, kullanımı kolay tekrarlanabilir ve yararlıdır. Kültür koşullarına bağlı olarak, monosit türevli histiositlerinden çeşitli insan hastalığı ile ilgili özel bir fizyolojik veya patofizyolojik süreçlerin tespitine imkan veren incelenebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar herhangi bir çıkar çatışması ifşa etmek zorunda değilsiniz.
Acknowledgments
Biz mükemmel teknik yardım için Nadine Wambsganss teşekkür ederim. Bu çalışma CAG İnovasyon Fonu FRONTIER (Heidelberg Üniversitesi) bir hibe ile Deutsche Forschungsgemeinschaft (GL599/1-1) bir hibe ile ve kısmen desteklenmiştir
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 50 ml centrifuge tube (sterile) | Fisher | 055398 | |
| D-PBS (1X), liquid (no calcium or magnesium) | Invitrogen | 14190-250 | |
| EDTA | Sigma | T9285 | |
| BSA | Sigma | A-8806 | |
| FCS | Invitrogen | ||
| EasySep Human Monocyte Enrichment Kit | StemCell Technologies | 19059 | |
| EasySep Magnet | StemCell Technologies | 18000 | |
| FACS tubes | Fisher | 352008 | |
| Macrophage-SFM (1X) | Invitrogen | 12065-074 | |
| Penicillin-streptomycin | Sigma | P-4458 | |
| Nutridoma-SP | Roche | 11011375001 | |
| human M-CSF 10 μg | Peprotech | 300-25 | |
| Cell Culture Plates 6-well | Fisher | 07-200-80 |
References
- Gordon, S., Taylor, P. R.
- Gordon, S., Mantovani, A. Diversity and plasticity of mononuclear phagocytes. European Journal of Immunology. 41, 2470-2472 (2011).
- Martinez, F. O., Sica, A., Mantovani, A., Locati, M.
- Ingersoll, M. A., et al. Comparison of gene expression profiles between human and mouse monocyte subsets. Blood. 115, 10-19 (2010).
- Gleissner, C. A., Sanders, J. M., Nadler, J., Ley, K. Upregulation of aldose reductase during foam cell formation as possible link among diabetes, hyperlipidemia, and atherosclerosis. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 28, 1137-1143 (2008).
- Gleissner, C. A., et al. CXCL4 downregulates the atheroprotective hemoglobin receptor CD163 in human macrophages. Circ. Res. , (2009).
- Gleissner, C. A., Shaked, I., Little, K. M., Ley, K. CXC chemokine ligand 4 induces a unique transcriptome in monocyte-derived macrophages. J. Immunol. 184, 4810-4818 (2010).
- Martinez, F. O., Gordon, S., Locati, M., Mantovani, A. Transcriptional profiling of the human monocyte-to-macrophage differentiation and polarization: New molecules and patterns of gene expression. J. Immunol. 177, 7303-7311 (2006).
- Verreck, F. A. W., et al. Human il-23-producing type 1 macrophages promote but il-10-producing type 2 macrophages subvert immunity to (myco)bacteria. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 4560-4565 (2004).
- Rey-Giraud, F., Hafner, M., Ries, C. H. In vitro generation of monocyte-derived macrophages under serum-free conditions improves their tumor promoting functions. PLoS One. 7, e42656 (2012).
- Boyle, J. J., et al. Coronary intraplaque hemorrhage evokes a novel atheroprotective macrophage phenotype. American Journal of Pathology. 174, 1097-1108 (2009).
- Cho, H. J., et al. Induction of dendritic cell-like phenotype in macrophages during foam cell formation. Physiol Genomics. 29, 149-160 (2007).
- Vogt, G., Nathan, C. In vitro differentiation of human macrophages with enhanced antimycobacterial activity. The Journal of Clinical Investigation. 121, 3889-3901 (2011).
- Mikita, T., Porter, G., Lawn, R. M., Shiffman, D. Oxidized low density lipoprotein exposure alters the transcriptional response of macrophages to inflammatory stimulus. Journal of Biological Chemistry. 276, 45729-45739 (2001).
- Qin, Z. Y. The use of THP-1 cells as a model for mimicking the function and regulation of monocytes and macrophages in the vasculature. Atherosclerosis. 221, 2-11 (2012).
- Daigneault, M., Preston, J. A., Marriott, H. M., Whyte, M. K. B., Dockrell, D. H. The identification of markers of macrophage differentiation in pma-stimulated THP-1 cells and monocyte-derived macrophages. PLoS One. 5, e8668 (2010).
- Wahl, L. M., Wahl, S. M., Smythies, L. E., Smith, P. D. Isolation of human monocyte populations. Current Protocols in Immunology. , John Wiley & Sons, Inc. (2001).
- Waldo, S. W., et al. Heterogeneity of human macrophages in culture and in atherosclerotic plaques. Am. J. Pathol. 172, 1112-1126 (2008).
- Martín-Fuentes, P., et al. Individual variation of scavenger receptor expression in human macrophages with oxidized low-density lipoprotein is associated with a differential inflammatory response. The Journal of Immunology. 179, 3242-3248 (2007).
