Summary
跨细胞蛋白质的相互作用是胰岛β细胞功能的重要决定因素。这里是详细的方法改编自突触调查特定的跨膜蛋白如何影响胰岛素的分泌模式的共存。转染的HEK293细胞中表达蛋白质的利益;不需要beta细胞被转染的或以其他方式直接扰动。
Abstract
细胞表面蛋白之间的相互作用有助于协调相邻细胞的功能。胰岛β细胞胰岛细胞内聚集在一起，并以协调的方式采取行动，以维持血糖稳态。它正变得越来越清楚，相邻的β细胞表面的跨膜蛋白之间的相互作用是β细胞功能的重要决定因素。
阐明的角色击倒，击倒或过度表达β细胞培养或体内的研究，特别是跨细胞相互作用必须直接扰动mRNA和蛋白表达，可能会影响β-细胞的健康和/或功能的方式，可能混淆的影响分析具体的相互作用。这些方法还可以改变对象的蛋白质的细胞内结构域的水平，并可能防止蛋白质之间的相互作用的影响，由于在同一小区内的膜显示tinguished跨细胞的相互作用的影响。
这里，提出了一种用于确定特定的跨细胞的相互作用的效果的β细胞分泌胰岛素的能力和响应能力。此方法适用于β-细胞系，如INS-1细胞，并解离的主要beta细胞。共培养模型的基础上开发的神经生物学家，谁培养的神经元，以表达对HEK293细胞层（或COS）确定蛋白质的重要驱动突触形成的特定的神经元蛋白的发现，暴露。由于神经突触和β细胞分泌机械之间的相似之处，我们的理由是，类似的跨细胞相互作用，都可能被β-细胞功能成熟。我们开发了一种系统beta细胞上培养HEK293细胞中表达的蛋白质还一层。在这个模型中，β-细胞的细胞质，而细胞外的蛋白质 - 蛋白质interactio不变NS被操纵。虽然我们对葡萄糖刺激的胰岛素分泌的研究主要集中在这里，其他进程可以进行分析，例如，由免疫或定量PCR基因表达的变化。
Introduction
我们在这里描述的方法，以方便调查特定的跨膜蛋白的胞外结构域如何影响胰岛素的分泌。的方法探测感兴趣的蛋白质与蛋白质（或可能是其他分子）的胰腺β-细胞表面上的相互作用的影响。该方法允许调查的β细胞或其他邻近的细胞（ 如内皮细胞，神经细胞，胰腺α细胞）表达的细胞表面蛋白如何影响β细胞功能的通过跨细胞相互作用（ 即通过与相互作用伙伴的相互作用的表面上相邻的β细胞）。
的细胞的质膜中包含一系列复杂的结构和功能的蛋白质作为细胞外环境的桥梁。通过形成跨细胞连接或塑料信号事件开始，细胞表面蛋白之间的相互作用，可以帮助协调周边小区的功能。胰岛β细胞胰岛内聚集在一起，并以协调的方式采取行动，以维持葡萄糖稳 态1。所揭示的，例如，通过外EPHA ephrinA的neuroligin-2相互作用的葡萄糖刺激的胰岛素分泌的调节的重要性，它正成为越来越清晰的是，增加细胞外的蛋白质之间的相互作用的表面上相邻的知识β细胞，将是非常重要的胰岛素分泌，胰岛β细胞功能的成熟和维持血糖稳态1-3获得一个全面的了解。这里描述的方法的目标是使跨细胞的相互作用，涉及特定的跨膜区或其它细胞表面相关蛋白的β细胞功能的影响的调查。 β细胞共培养HEK293细胞转染不同的表达结构，对b的影响〔η细胞的功能不同的细胞表面蛋白或突变的变种，其可以有效地探测。这是完成，无需转染β细胞本身。
阐明的角色击倒，击倒或过度表达β细胞培养或体内的研究，特别是跨细胞相互作用，必须直接微扰β细胞的mRNA和蛋白表达，有可能影响β细胞的健康和/或功能的方式，可能会混淆分析特定的细胞外的相互作用的影响。这些方法也改变的细胞内结构域的目标蛋白的水平，还不允许或跨细胞的相互作用的影响，以区别于在同一单元中的蛋白质之间的相互作用的影响。在这里，一种方法，用于确定特定的跨细胞的相互作用的效果的β细胞分泌胰岛素的能力和响应能力是叙述的离子束辅助沉积。本方法适用分泌胰岛素的β-细胞系，如INS-1细胞4，并解离的主要啮齿动物或人类β细胞。它是基于共培养模型的神经生物学家，谁发现，暴露培养的神经细胞的特定的神经元蛋白表达对HEK293细胞层（或COS）开发可以识别该驱动器突触形成的蛋白质5,6。由于神经突触和β细胞分泌机械之间的相似之处，我们的理由是，β细胞功能和功能成熟，都可能被类似的跨细胞相互作用7-9。为了探测这些相互作用，我们开发了本文描述的系统，其中beta细胞层上的感兴趣的蛋白10表达的HEK293细胞共培养。这个系统允许的β-细胞的细胞质中保持不变，而细胞外的蛋白质 - 蛋白质相互作用被操纵。
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Protocol
1。转HEK293层的
- 准备HEK293细胞培养基，加入至500ml的瓶的DMEM（4.5克/毫升的葡萄糖和酚红，无谷氨酰胺）：50毫升胎牛血清，5毫升100X青霉素/链霉素溶液，5毫升100倍的L-谷氨酰胺的溶液和500μl的两性霉素B.
- 板出在24孔板使用0.5毫升每口井的HEK293媒体的HEK293细胞。确保细胞均匀地分布在盘底。
- 当达到100％汇合的转染HEK293细胞，用0.8μg的质粒的编码所述感兴趣的蛋白质（插入哺乳动物表达载体）和2μl脂质体2000的脂质体转染的协议。我们选择使用设计用于在哺乳动物细胞中表达了pcDNA 3.3骨干。
- 或者，经过6小时的潜伏期，交流转媒体描述在脂质体转染协议正常HEK293媒体的。
- 为了评价表达的转染PROTE，转染组织培养井的一个子集可用于免疫荧光检测所表达的蛋白质或免疫印迹分析蛋白的表达，用标准技术。
2。可选固定HEK293细胞转染蛋白表达
转染HEK293细胞，可以轻轻地固定，以促进共培养介质中可能是有害的生活HEK293细胞中（ 如下面的步骤3.9），或者允许一次全部板前几个实验的高效制备（见讨论）。
- 进行试验研究，以确定在HEK293细胞中的蛋白质的表达的时间过程。
- 在转染的HEK293细胞层的，吸媒体从细胞转染后的时间点与最高的表达水平相关。如果发生这种情况的第一个24小时内，不转染后吸出，直到24小时。
- 洗净HE然后轻轻地用D-PBS K293细胞加入500微升4％多聚甲醛（PFA），并在室温下孵育30分钟。 （4％PFA的解决方案，16％的溶液在1X PBS开始用1X PBS稀释1:4）。
- 使用无菌PBS，轻轻洗细胞3次，并培育在PBS O / N在4°C。
- 洗涤细胞3次，用无菌PBS，再加入PBS和离开，在4°C，直到需要时（最大存储时间可能取决于对蛋白质的表达。存储HEK293细胞的转染表达的neuroligin亚型长达2周没有显着变化，观察效果胰岛素分泌）。
3。 INS-1β细胞共培养细胞系的
- 准备INS-1，加入到500毫升的RPMI 1640（葡萄糖和酚红，无谷氨酰胺）：媒体50 5毫升100X毫升胎牛血清，青霉素/链霉素，5毫升100X L-谷氨酰胺溶液，5毫升丙酮酸钠，500微升两性霉素B，500微升β-巯基乙醇（这是几乎相同的Medi这个通常用于除加入β-巯基乙醇）原代胰岛培养。
- 使用手机汽提塔（或其他的非酶细胞去除），收获INS-1细胞在约70-80％汇合的折扣的T75培养瓶的底部。 48口井，每个烧瓶中提供大致足够的细胞。
- 纺丝后，细胞在离心3分钟，在1200 rpm，重悬在50/50的组合，INS-1和HEK媒体。对于70-80％汇合烧瓶INS-1细胞，重悬在约25毫升混合介质。
- 如果使用HEK293细胞中已修复的多聚甲醛，而不是现场HEK293细胞，INS-1细胞悬浮在100％INS-1媒体而非混合介质。
- 用10毫升移液管，从撞出细胞沉淀，使均匀的细胞悬浮液。
- 吸移除媒体HEK293细胞。
- 使用P1000吸管，轻轻INS-1细胞悬液加500微升到HEK细胞层两旁Øf为好。每6口井后，用10毫升吸管再次悬浮INS-1细胞，以确保细胞悬液均匀。共培养整体方案中的设置在图1中示出。
- 细胞孵育24-48小时，取决于实验的协议。
- 如果超过48小时共培养需要花多长时间，使用可选的步骤，在上述第2 HEK293细胞来修复。
- 如果使用主解离的啮齿动物或人类胰岛[ 例如，参见事先协议朱庇特11-15]，确保一个适当的介质，如RPMI用5ml笔/链球菌，5毫升L-过剩，0.5毫升两性霉素-B是用来代替INS-1媒体。虽然可以使用分离的胰岛细胞在24孔板，在实践中，因为潜在需要大量的胰岛，建议应考虑缩减到48孔板（每口井需要较少的胰岛细胞）。在48孔板，加入约100个小岛值得的解离泰德细胞每盘启动。根据对药效的离解，所使用的方法，可能需要较少的胰岛。
4。胰岛素分泌
- 垫上预温育细胞在250μl的2.5 mM葡萄糖的Krebs-林格碳酸氢盐缓冲液（KRB）最少1小时。要垫上预温育，删除共存培养基，并立即更换KRB。这种交流应该做了一个很好的时间，以尽量减低环境氧INS-1细胞。吸用一只手吹打低（2.5毫米）与其他葡萄糖KRB。
- 外汇预孵育的KRB到250μl的2.5毫米或20 mM葡萄糖的KRB缓冲液以及在一个时间。
- 如果适合于特定的实验中，可能会增加额外泌剂，如100μMIBMX，以产生一个更强大的刺激的胰岛素分泌反应。特别是游离主胰岛β细胞反应不佳的葡萄糖浓度增加ALONE，所以在这里特别IBMX或其他泌此外应考虑16,17。
- 经过1小时的潜伏期，媒体转移到离心管和旋转1500 XG 5分钟。
- 取出200μl的上清液，并使用该胰岛素RIA或ELISA法进行分析。
- 以制备细胞裂解液，将100μlRIPA细胞裂解缓冲液（150 mM氯化钠，1.0％IGEPALCA-630或诺乃P-40，0.5％脱氧胆酸钠，0.1％SDS的50mM Tris，pH 8.0）中与蛋白酶抑制剂的加板取出后，立即媒体和孵化，在4℃20分钟。
- 自旋向下的溶胞产物在10,000×g 15分钟，并取出50微升上清液胰岛素RIA或ELISA分析。
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Representative Results
使用这里介绍的方法，我们已经测试的效果不同的变种，对胰岛素分泌的蛋白质的neuroligin。这补充了我们的neuroligin-2 10β细胞功能的影响调查工作。例如， 图2中 ，示出从INS-1 beta细胞共培养的结果与转染的HEK293细胞来表达的neuroligin亚型这里称为NL十这个实验的目的是检验这一假设，NL-X从事跨细胞的相互作用，增加胰岛素的分泌。在图2A中可以看出，基底和NL-X的表达增加刺激的胰岛素分泌，INS-1细胞共培养。该方法转染HEK293细胞，以便它们反映NL-X，使我们能够知道，它是胞外结构域的HEK293细胞的表面上显示的区域，从而能够接触到的共培养的INS-1细胞，使关于OBSE分泌增加RVED。 NL-X的胞外结构域必须交互INS-1细胞表面上与另一种蛋白质（或者一些其他分子）造成的INS-1细胞分泌更多的胰岛素。如果需要的话，也可以分泌胰岛素，它可以溶解细胞后，测定细胞的胰岛素含量的百分比来表示。
在图2B和2C中，使用的共培养系统中的其他类型的分析的结果示出：具体而言，分析的跨细胞的相互作用涉及的neuroligin变种NL-Y细胞的胰岛素含量和PDX-1和胰岛素mRNA表达水平的影响。 NL-Y INS-1细胞共培养（ 图2B）的胰岛素含量增加。进一步的测试将是必要的，以确定这是否是由于每个细胞中的胰岛素的量的增加或由于增加了INS-1细胞的增殖。在图2C中 ，RNA从细胞收获层和RT-qPCR的分析。由于HEK293细胞是人源的，HEK293和INS-1细胞中可能存在的成绩单，使用鼠特异性PCR引物（INS-1细胞是鼠源性的）可确保只有mRNA的INS-1起源进行了测量。在这里可以看出，与NL-Y共培养，增加了胰岛素和PDX-1 mRNA表达水平（归一化是18S RNA）。用于RT-qPCR的分析方法的引物和前面描述10，在线补充剂。
图1。共培养设置。 HEK293细胞（HEK）加入24孔培养板中，然后转染 HEK293细胞层的代表甲亮场图像显示在顶部，右侧。转染的HEK细胞表达的表位标记的跨膜蛋白。在这里，使用免疫荧光染色显示转染细胞（绿色）。接着，INS-1细胞中加入。对胰岛素的免疫荧光染色进行共培养INS-1细胞（红色），以允许可视化。
图2。转染从共培养INS-1 beta细胞与转染的HEK293细胞中表达的neuroligin蛋白变体：NL-X或NL-Y（填充，黑色列），控制 HEK293细胞获得的结果具有相同的质粒构建体，以便不改变快递蛋白（白柱），低（2.5海里）和高（20毫米）的葡萄糖条件下也一起IBMX高糖刺激后共培养INS-1细胞的胰岛素分泌，B，INS-1细胞胰岛素含量C，分析人员共培养后HEK293细胞表达NL-Y。是胰岛素和PDX-1转录水平通过RT-qPCR中使用INS-1细胞共培养与任何与NL-Y或与对照转染的HEK293细胞的转染的HEK293细胞中分离出的RNA。 （*，P <0.05，**，P <0.01; ***，P <0.001）。
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Discussion
在共存这里描述的方法提供了一种有效的方法，以确定特定的β-细胞表面的跨膜蛋白的生理重要性，特别是其胞外结构域。通过培养beta细胞或胰岛素瘤细胞（如这里的INS-1细胞）的HEK293细胞的接触显示感兴趣的在细胞表面上的蛋白质，可设计实验，以确定影响细胞外的蛋白质 - 蛋白质相互作用，而无需直接扰乱的细胞的细胞内环境。由于感兴趣的蛋白质表达的HEK293细胞，可以介导的转染的细胞内结构域的蛋白，β细胞功能的任何影响将是不存在的，因此将不会复杂细胞外的相互作用的影响的分析。
对胰岛素分泌的影响HEK293细胞共培养的β细胞分泌的比较，可以很容易地确定表达的蛋白质接触控制HEK293细胞共培养从β细胞分泌的兴趣。的控制HEK293细胞可以是转染，或可替代地，转染实验的质粒构建生产感兴趣的蛋白质的非功能性变体，突变的变体。在我们的手中，这两种类型的控制已经取得了相同的结果。由于在HEK293细胞表面本身含有种类繁多的蛋白质，这两种类型的控制允许接触许多不同的细胞表面分子，其中感兴趣的蛋白，β细胞的功能进行比较，以接触的β细胞的功能相同的一组感兴趣的（或包括感兴趣的蛋白质的突变版本）的蛋白质与异常的细胞表面分子的。
INS-1细胞（或其他β细胞）添加的HEK293层的密度低，以便有很少或没有接触INS-1细胞与其他INS-1大公LS。这允许的跨细胞之间的相互作用的蛋白质表达在HEK293细胞表面蛋白的INS-1细胞表面上可观察到潜在的背景噪声造成的跨细胞的相互作用涉及相同的蛋白质的情况下感兴趣的内源性表达的影响上的INS -1细胞表面。
转染后，的HEK293细胞层的可轻轻固定。可以利用这个可选的固定，以允许多个共同培养板，一次在稍后的日期为后续添加的β细胞来制备。修复HEK293细胞也将是有利的，如果有关注HEK293代谢或分泌功能会以某种方式干扰β细胞功能的分析。最后，可以采用固定协议，以便长时间的共培养实验。在这里，使用固定的HEK293细胞的主要优点是可以采用，而不是使用的β细胞的最佳培养基混合介质（ 例如，见第3.3步）同时保持共培养HEK293细胞和β细胞，必要的。在长期共同培养实验，使用的混合媒体，这是不是最佳的两种细胞类型可损害胰岛β细胞的生存能力。
采用，因为它们是高度适合转染HEK293细胞，它们可以被转染效率高，使用各种不同的转染试剂18,19。 HEK293是两种类型的细胞一起COS细胞-这是经常采用类似的神经细胞共培养系统之一。脂质体转染HEK293细胞和常规实现的转染效率（％，转染的细胞）大于95％的已发表 的研究18-20很常用的，是一个成熟的转染试剂。其他试剂，可以实现类似的转染效率19,20。随着我们的neuroligin-2质粒的构建，转染效率一般〜80％。 Alt键砍断，在这里我们重点研究的葡萄糖刺激的胰岛素分泌，其他的分析模式是可能的，例如，通过流式细胞仪，免疫组化，免疫印迹和/或图2C，定量PCR，。
尽管是非常有用的工具帮助发现的功能，特别是细胞外蛋白质相互作用，这里描述的方法也不是没有它的极限。由于β细胞HEK293细胞层直接接触，胰岛素瘤细胞系，例如INS-1细胞，特别是非常适合于该共培养系统4。翻译的结果，初级胰岛细胞需要的分散孤立的小岛。由于胰岛结构本身集成到适当的信令和对葡萄糖的反应，刺激胰岛素的响应迟钝分散在主β细胞相对完整的胰岛1,3,17。此外，由于瞬时转染不统一表达TH E蛋白横跨的HEK草坪，执行基于成像（免疫组化）实验时，蛋白的表达水平的方法正常化可能需要解释的结果。在Suckow 等人 ，2012年10在图3中示出的实验方法，它利用了这种非均匀的表达，分析转染蛋白的效果，在共培养INS-1细胞分泌机械。
还应当指出的是，在本系统中，在任何给定的β细胞和邻近的细胞，表达感兴趣的蛋白质之间的接触程度很可能比在完整的胰岛细胞在体内 ，其中beta细胞可能由细胞四面包围表达的蛋白质。这种相对降低的细胞 - 细胞接触，可以减少胰岛素分泌的变化，下面将观察到什么程度，如果有关的跨细胞的相互作用以某种方式从本地胰岛销。
“>使用无性系种群稳定转染HEK293细胞，而不是瞬时转染e_content会导致更均匀的表达，并可能简化实验设置，但需要大幅度增加前期的时间和精力，以产生稳定表达细胞。未来的研究将确定是否转两个或两个以上的跨膜蛋白的HEK293细胞层的，可能的协同作用，可以观察到。Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
我们什么都没有透露。
Acknowledgments
这项工作得到国家卫生部授予的R01DK080971和青少年糖尿病研究基金会的资助37-2009-44研究院。我们也感谢来自加州大学圣地亚哥分校儿科糖尿病研究中心（PDRC）的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| pcDNA 3.3 vector/backbone | Invitrogen | K830001 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 18324012 | |
| DMEM | Mediatech | 45001-312 | |
| Pen/strep solution | Mediatech | 45001-652-1 | |
| Amphotericin B | Mediatech | 45001-808-1/30 | |
| RPMI-1640 | Mediatech | 45001-404 | |
| D-PBS | Mediatech | 45001-434 | |
| Sodium Pyruvate | Mediatech | 45001-710-1 | |
| 2-Mercapt–thanol | Invitrogen | 21985023 | |
| Cell stripper | Mediatech | 45000-668 | |
| T75 Flask | BD | 1368065 | |
| 16% Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 50980487 | |
| 10x PBS | Mediatech | 45001-130 | |
| Fetal bovine serum | Mediatech | MT35010CV | |
| IBMX | Sigma | I5879-100MG | |
| RIPA lysis buffer | Sigma | R0278 |
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