Summary
Transcellulär proteinväxelverkningar är viktiga faktorer för bukspottkörtel betacellfunktion. Detaljerad här är en metod anpassad från en samodling modell synaptogenesis-för att undersöka hur specifika transmembranproteiner påverkar insulinutsöndring. Transfekterade HEK293-celler uttrycka proteiner av intresse, beta celler behöver inte skall transfekteras eller på annat sätt direkt perturbed.
Abstract
Interaktioner mellan cellytproteiner hjälpa till att samordna funktionen av angränsande celler. Betaceller är grupperade tillsammans inom pankreascellöar och agera på ett samordnat sätt för att upprätthålla glukoshomeostas. Det blir alltmer tydligt att samspelet mellan transmembranproteiner på ytorna av intilliggande betaceller är viktiga faktorer för beta-cellernas funktion.
Klarläggande av rollerna av särskilda transcellulär interaktioner från knockdown, knockout eller överuttryck studier i odlade betaceller eller in vivo kräver direkt störning av mRNA och protein expression, potentiellt påverka beta-cell hälsa och / eller funktion på ett sätt som kunde förbrylla analyser av effekterna av specifika interaktioner. Dessa tillvägagångssätt också förändra nivåerna av de intracellulära domänerna av de riktade proteinerna och kan förhindra effekter på grund av interaktionen mellan proteiner inom samma cell membran skall kopplas bortpräglats från effekterna av transcellulär interaktioner.
Här är en metod för att bestämma effekten av specifika transcellulär interaktioner på insulinproducerande kapacitet och lyhördhet betaceller presenteras. Denna metod är tillämplig på beta-cellinjer, såsom INS-1-celler, och dissocierade primära betaceller. Den är baserad på samodling modeller som utvecklats av neurobiologists, som fann att exponering av odlade nervceller till specifika neuronala proteiner som uttrycks på HEK293 (eller COS) cellager identifierade proteiner som är viktiga för att driva synapsebildande. Med tanke på parallellerna mellan den sekretoriska maskineriet av neuronala synapser och betaceller, motiverade vi att beta-cell funktionell mognad kan drivas av liknande transcellulär interaktioner. Vi utvecklade ett system där betaceller odlas på ett skikt av HEK293-celler som uttrycker ett protein av intresse. I denna modell är den beta-cellens cytoplasma orörd medan extracellulärt protein-protein interactions manipuleras. Även om vi fokuserar här främst på studier av glukos-stimulerad insulinsekretion, kan andra processer analyseras, till exempel, som förändringar i genuttryck bestäms genom immunoblottning eller qPCR.
Introduction
Vi beskriver här en metod för att underlätta undersökningar av hur de extracellulära domänerna av specifika transmembranproteiner påverkar insulinsekretionen. Metoden sonder effekterna av interaktion mellan proteinet av intresse med proteiner (eller eventuellt andra molekyler) på pankreatisk beta-cellytan. Metoden möjliggör undersökningar av hur cellytproteiner uttrycks av betaceller eller av andra närliggande celler (t.ex. endotelceller, neuroner, pankreas alfaceller) påverkar betacellfunktionen genom transcellulär interaktioner (dvs. genom interaktioner med interaktionspartner på ytan av intilliggande betaceller).
Den cellulära plasmamembran innehåller en komplex samling av strukturella och funktionella proteiner som fungerar som broar till den extracellulära miljön. Genom bildandet av transcellulär anslutningar eller genom initiering av plast signalering händelser, kan interaktioner mellan cellytproteiner hjälpa till att samordnafunktion av angränsande celler. Betaceller är grupperade tillsammans inom pankreasöarna och agera på ett samordnat sätt för att upprätthålla glukoshomeostas 1. Som visat, exempelvis genom vikten av extracellulära EPHA-ephrinA och neuroligin-2 interaktioner i regleringen av glukos-stimulerad insulinsekretion, blir det allt mer tydligt att ökad kunskap om de extracellulära interaktioner som förekommer mellan proteiner på ytan av intilliggande betaceller kommer att vara av stor betydelse för att få en full förståelse av insulinutsöndring, beta cell funktionell mognad och underhåll av glukoshomeostasen 1-3. Målet med den här beskrivna metoden är att möjliggöra undersökningar av effekterna på betacellsfunktionen av transcellulär interaktioner med specifika trans eller annat-cell-ytan-associerade proteiner. Genom samodling betaceller med HEK293 celler transfekterade med olika uttryckskonstruktioner, effekterna på beta cellernas funktion av olika proteiner på cellernas ytor eller muterade varianter därav kan vara effektivt sonderade. Detta åstadkommes utan att behöva transfektera betacellerna själva.
Klarläggande av rollerna av särskilda transcellulär interaktioner från knockdown, knockout eller överuttryck studier i odlade betaceller eller in vivo kräver direkt störning av beta-cellens mRNA och protein expression, potentiellt påverka beta cell hälsa och / eller funktion på ett sätt som kunde förbrylla analyser av effekterna av specifika extracellulära interaktioner. Dessa angreppssätt också förändra nivåerna av de intracellulära domänerna av de riktade proteiner och vidare inte tillåter effekter på grund av interaktioner mellan proteiner på eller i samma cell som ska särskiljas från effekterna av transcellulär interaktioner. Här är en metod för att bestämma effekten av specifika transcellulär interaktioner på insulinproducerande kapacitet och lyhördhet av betaceller described. Denna metod är tillämplig på insulinproducerande beta-cellinjer, såsom INS-1-celler 4, och dissocierade primära gnagare eller humana beta. Den är baserad på samodling modeller som utvecklats av neurobiologists, som fann att exponering av odlade nervceller till specifika neuronala proteiner som uttrycks på HEK293 (eller COS) cellager kunde identifiera proteiner som kör synapsebildande 5,6. Med tanke på parallellerna mellan den sekretoriska maskineriet av neuronala synapser och betaceller, motiverade vi att betacellfunktionen och funktionell mognad kan drivas av liknande transcellulär interaktioner 7-9. För att undersöka dessa interaktioner, utvecklade vi det här beskrivna systemet i vilket betaceller samodlades på ett lager av HEK293-celler som uttrycker ett protein av intresse 10. Detta system gör det beta-cellens cytoplasma att förbli orörda medan extracellulära protein-protein-interaktioner är manipulerade.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Ett. Transfektion av HEK293 Layer
- Förbered HEK293 cellmedium genom att lägga till 500 ml flaskor av DMEM (med 4,5 g / ml glukos och fenol rött och utan glutamin): 50 ml FBS, 5 ml 100X penicillin / streptomycin lösning, 5 ml 100x L-glutamin lösning och 500 ^ amfotericin B.
- Platta ut HEK293 celler i en 24-brunnars platta med användning av 0,5 ml av HEK293 medium per brunn. Kontrollera att cellerna är spridda jämnt över botten av plattan.
- När HEK293-celler når 100% konfluens, transfektera med 0,8 ^ g av plasmid som kodar för proteinet av intresse (införd i en expressionsvektor för däggdjur) och 2 pl av Lipofectamine 2000 enligt den Lipofectamine protokollet. Vi har valt att använda pcDNA 3.3 ryggraden utformad för uttryck i däggdjursceller.
- Eventuellt efter 6 h av inkubation, utbyta transfektion media beskrivs i Lipofectamine protokollet med normala HEK293 media.
- För att utvärdera uttrycket av den transfekterade protei, kan en delmängd av de transfekterade vävnadsodlingsbrunnar användas för immunofluorescens detektion av det uttryckta proteinet eller för western blot-analys av proteinuttryck med användning av standardtekniker.
2. Valfri Fixering av HEK293-celler transfekterade Protein
Transfekterade HEK293 celler kan lätt fastställas för att underlätta coculture i media som kan vara skadliga för levande HEK293 celler (t.ex. steg 3.9 nedan) eller för att möjliggöra en effektiv beredning i förväg av plattor för flera experiment på en gång (se även diskussion).
- Genomför pilotstudier för att bestämma tidsförloppet av expressionen av proteinet i HEK293-celler.
- Efter transfektion HEK293 cellagret, aspirera media från cellerna vid efter transfektion tidpunkt förknippas med högsta uttryck. Om detta inträffar under de första 24 tim, inte aspirera inte förrän 24 timmar efter transfektion.
- Tvätta HEK293 celler försiktigt med D-PBS och tillsätt sedan 500 | il 4% paraformaldehyd (PFA) och inkubera vid rumstemperatur under 30 minuter. (För att göra 4% PFA-lösning, börja med 16% lösning i 1X PBS och späd 1:04 med 1X PBS.)
- Använd steril PBS, försiktigt tvätta cellerna tre gånger och inkubera i PBS O / N vid 4 ° C.
- Tvätta cellerna tre gånger med sterilt PBS, tillsätt sedan PBS och lämna vid 4 ° C tills det behövs (maximal lagringstid kan variera beroende på uttryckt protein. Vi lagrar HEK293 celler transfekterade uttrycka neuroligin isoformer i upp till 2 veckor utan signifikanta förändringar i observerade effekter på insulinutsöndring).
Tre. Samtidig odling av INS-1 betacellerna med HEK293 Cells
- Förbered INS-1 medium genom att till 500 ml RPMI 1640 (med glukos och fenolrött och utan glutamin): 50 ml FBS, 5 ml 100X penicillin / streptomycin, 5 ml 100X L-glutamin-lösning, 5 ml natriumpyruvat, 500 | il amfotericin B, 500 | il beta-merkaptoetanol (detta är nästan identisk med den medium vanligtvis för primär holme kultur förutom tillägget av beta-merkaptoetanol).
- Använda Cell-stripper (eller annan icke-enzymatisk cell remover), skörd INS-1-celler vid ungefär 70-80% confluency av bottnen av en T75 kultur kolv. Varje flaska kommer att ge ungefär tillräckligt med celler för 48 brunnar.
- Efter spinning ned celler i centrifugen i 3 min vid 1200 rpm, återsuspendera i en 50/50 blandning av INS-1 och HEK media. För en 70-80% sammanflytande kolv av INS-1-celler, återsuspendera i ca 25 ml blandteknik.
- Om du använder HEK293 celler som har fastställts i paraformaldehyd snarare än levande HEK293 celler, resuspendera INS-1-celler i 100% INS-1 media snarare än blandteknik.
- Med hjälp av en 10 ml pipett, rubba cellerna från pelleten för att göra en homogen cellsuspension.
- Aspirera för att ta bort materialet på HEK293-celler.
- Använda en P1000 pipett försiktigt tillsätt 500 l av INS-1 cellsuspension på HEK cellagret längs sidorna of brunnen. Efter varje 6 brunnar, använd en 10 ml pipett för att resuspendera INS-1-celler igen för att säkerställa en homogen cellsuspension. Det övergripande syftet med samodling set-up visas i figur 1.
- Inkubera cellerna i 24 till 48 h beroende på det experimentella protokollet.
- Om mer än 48 timmar coculture period krävs, använda valfria stegen i avsnitt 2 ovan för att fixera HEK293-celler.
- Om du använder primära dissocierade gnagare eller humana öar [se t.ex. tidigare protokoll i JUPITER 11-15], se till att ett lämpligt medium såsom RPMI med 5 ml penna / streptokocker, 5 ml L-glut, 0,5 ml amfotericin-B används istället för INS-1 media. Även om man kan använda dissocierade cellöar i en platta med 24 brunnar, i praktiken på grund av det stora antalet öar potentiellt behövs, rekommenderas att man överväger att skala ner till en 48 brunnar (kräver färre cellöar per brunn). På en 48 brunnar, tillsätt ca 100 öar värda dissociated celler per platta att börja. Beroende på effekten av dissociation och den metod som används, kan färre holmar krävas.
4. Glukos insulinutsöndring
- Preinkubera celler i 250 | il av 2,5 mM glukos i KRB (Krebs-Ringer bikarbonatbuffert) i minst en timme. Att preinkubera, ta bort coculture medellång och omedelbart ersätta med KRB. Detta utbyte bör göras en brunn vid en tidpunkt för att minimera exponeringen av INS-1 celler till miljö syre. Sug med ena handen medan pipettering låg (2,5 mM) glukos KRB med andra.
- Exchange förinkubering KRB till 250 | il av antingen 2,5 mM eller 20 mM glukos i KRB-buffert en väl i taget.
- Om det är lämpligt för det specifika experimentet, kan ytterligare sekretagoger såsom 100 iM IBMX tillsättas för att ge en mer robust stimulerad respons insulinsekretoriska. Dissocierade primära ö betacellerna i synnerhet är dåligt lyhörda för ökad glukos koncentrationer Alone, så här speciellt tillägg av IBMX eller andra antidiabetika bör övervägas 16,17.
- Efter 1 timme inkubation, överföra media till mikrofugrör och snurra 1500 xg under 5 minuter.
- Ta 200 pl av supernatanten och använda detta för analys av insulin RIA eller ELISA.
- För att framställa cellysat, tillsätt 100 | il av RIPA cellys buffert (150 mM NaCl, 1,0% IGEPALCA-630 eller Nonidet P-40, 0,5% natriumdeoxikolat, 0,1% SDS, 50 mM Tris, pH 8,0) med proteashämmare till plattan omedelbart efter avlägsnande media och inkubera vid 4 ° C i 20 min.
- Centrifugera ner lysatet i 15 min vid 10000 xg och ta bort 50 | il av supernatant för analys genom insulin RIA eller ELISA.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Med användning av metoden som beskrivs här, har vi testat effekten av olika varianter av proteinet neuroligin på insulinutsöndring. Detta kompletterar vårt publicerade arbete undersöker effekten av neuroligin-2 på betacellsfunktionen 10. Figur 2, till exempel, visar resultat som erhållits från samodling INS-1 beta celler med HEK293 celler transfekterade för att uttrycka en neuroligin isoform som här kallas NL- X. Detta experiment utformades för att testa hypotesen att NL-X bedriver transcellulär interaktioner som ökar insulinutsöndringen. I figur 2A kan det ses att uttryck av NL-X ökade basal och stimulerad insulinutsöndring genom samodlades INS-1-celler. Tillvägagångssättet för transfektering HEK293-celler så att de uttrycker NL-X ger oss möjlighet att veta att det är den extracellulära domänen-som är regionen som visas på HEK293 cellytan och sålunda i stånd att komma i kontakt med samodlades INS-1-celler-som ger om observed ökning av sekretion. Den NL-X extracellulära domänen måste interagera med ett annat protein (eller kanske någon annan molekyl) på INS-1 cellytan för att orsaka INS-1-celler att utsöndra mer insulin. Om så önskas kunde insulin som utsöndras också uttryckas som en procent av cellulärt insulininnehåll, som kan mätas efter lys av cellerna.
I figurerna 2B och 2C, är resultat från andra typer av analyser som använder coculture avbildat: specifikt, analyser av effekten av transcellulär interaktioner mellan neuroligin variant NL-Y på cellulär insulin innehåll och på PDX-1 och insulinnivåer mRNA. NL-Y ökade insulin innehållet i de samodlades INS-1-celler (Figur 2B). Ytterligare tester skulle vara nödvändigt att avgöra huruvida detta berodde på en ökning av mängden insulin per cell eller på grund av ökad INS-1 celltillväxt. I figur 2C, RNA skördades från cellenskiktet och analyserades genom RT-qPCR. Eftersom de HEK293 celler av mänskligt ursprung, för transkript som kan förekomma i både HEK293 och INS-1-celler, användning av råtta-specifik PCR primers (INS-1-celler är av råttursprung) säkerställer att endast mRNA av INS-1 ursprung mäts. Här kan man se att samodling med NL-Y ökade insulin och PDX-1 mRNA-nivåer (normalisering var att 18S RNA). De primers och metoder som används för denna RT-qPCR analys har tidigare beskrivits 10, online-tillägg.
Figur 1. Coculture ställa upp. HEK293 (HEK) celler tillsätts till 24-brunnars vävnadsodlingsplattor och sedan transfekteras. Ett ljust fält bild av en representant HEK293 cellskikt visas överst, till höger. De HEK celler transfekteras för att uttrycka en epitopmärkt transmembranprotein. Här är immunfluorescensfärgning användas för att avslöja den transfekteradeceller (grön). Next, INS-1-celler tillsätts. Immunfluorescensfärgning för insulin utfördes för att möjliggöra visualisering av samodlades INS-1-celler (röd).
Figur 2. Resultat erhållna från samodling INS-1 beta celler med HEK293-celler transfekterade för att uttrycka de neuroligin proteinvarianter NL-X eller NL-Y (ifyllda, svarta staplar). Kontroll HEK293-celler transfekterades med samma plasmidkonstruktioner förändrade för att inte uttryckliga protein (vita staplar). A, insulinutsöndring genom samodlades INS-1-celler under lågt (2,5 nM) och hög (20 mM) glukos förhållanden och även efter stimulering med hög glukos tillsammans med IBMX. B, INS-1-cell insulin innehåll efter samodling med HEK293 celler som uttrycker NL-Y. C, analysär av insulin och PDX-1 nivåer avskrift av RT-qPCR använda RNA isolerat från INS-1-celler samodlades med antingen HEK293 celler transfekterade med NL-Y eller med kontroll-transfekterade HEK293-celler. (*, P <0,05; **, P <0,01, ***, P <0,001).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den coculture här beskrivna metoden ger ett effektivt sätt att bestämma den fysiologiska betydelsen av specifika beta-cell-ytan, transmembranproteiner, och specifikt om deras extracellulära domäner. Genom odling av beta eller celler insulinomceller (såsom INS-1 celler som används här) i kontakt med HEK293 celler som uppvisar ett intressant protein på cellytan, kan experiment utformas för att bestämma effekterna av extracellulära protein-protein-interaktioner utan att direkt störa den intracellulära miljön i cellerna. Eftersom proteinerna av intresse uttrycks av HEK293 celler, skulle eventuella effekter på β-cell funktion som kan förmedlas av de intracellulära domänerna av de transfekterade proteiner vara frånvarande och därför inte skulle komplicera analysen av effekterna av extracellulära interaktioner.
Effekter på insulinsekretion kan lätt bestämmas genom att jämföra sekretion från betaceller samodlades med HEK293-celleruttrycka ett protein av intresse för utsöndring från betaceller samodlades i kontakt med styr HEK293-celler. Kontrollorganen HEK293-celler kan vara mock-transfekterade eller, alternativt, transfekterad med en variant av den experimentella plasmidkonstruktion muteras för att producera en icke-funktionell variant av proteinet av intresse. I våra händer, har båda typerna av kontroller gav identiska resultat. Sedan HEK293 cellytan i sig innehåller en stor mängd proteiner, att vardera typ av styrning funktionen av betaceller i kontakt med många olika cellyte-molekyler inkluderande proteinet av intresse, som skall jämföras med funktionen av betaceller i kontakt med samma uppsättning av molekyler på cellytan, med undantag av proteinet av intresse (eller som innehåller en muterad version av proteinet av intresse).
INS-1-celler (eller andra beta-celler) sättes till HEK293-skikten vid låg densitet så att det finns minimal eller ingen kontakt av INS-1-celler med andra INS-1 cells. Detta tillåter effekterna av transcellulär interaktioner mellan proteinet av intresse uttrycks på HEK293 cellytan och proteiner på INS-1 cellytan som skall iakttas i frånvaro av potentiella bakgrundsbrus orsakas av transcellulär interaktioner som involverar samma protein uttrycks endogent på INS -1 cellytan.
Efter transfektion kan HEK293 cellskiktet försiktigt fast. Detta tillval fixering kan användas för att tillåta flera coculture plattor att vara förberedd på en gång för efterföljande tillsats av betaceller vid en senare tidpunkt. Fastställande av HEK293-celler skulle också vara fördelaktigt om det fanns farhågor om att HEK293 metabolism eller sekretoriska funktion på något sätt skulle störa analysen av betacellsfunktionen. Slutligen kan fixeringen protokollet användas för att underlätta längre samodling experiment. Här, är den huvudsakliga fördelen med att använda fixerade HEK293-celler att den optimala odlingsmediet för betaceller kan användas snarare än att använda enmixed media (t.ex. se steg 3.3) behövs för att bibehålla samodlades HEK293 och beta celler samtidigt. I långvariga coculture experiment, användning av mixed media-vilket inte är optimalt för antingen celltyp-kan försämra beta cellernas livskraft.
HEK293 celler används här eftersom de är mycket mottagliga för transfektion: de kan transfekteras med hög effektivitet med användning av en mängd olika transfektionsreagens 18,19. HEK293 är en av två celltyperna-tillsammans med COS-celler - som rutinmässigt används i liknande neuronala samodling system 5. Lipofectamine 2000 är en beprövad transfektionsreagens mycket vanligt med HEK293 celler och rutinmässigt uppnå effektivitet transfektion (procent av celler transfekterade) av mer än 95% i publicerade studier 18-20. Andra reagens kan uppnå liknande effektivitetsvinster av transfektion 19,20. Med vår neuroligin-2 plasmidkonstruktion är transfektionseffektiviteten allmänhet ~ 80%. AltHough fokuserar vi här på studier av glukos-stimulerad insulinsekretion, andra typer av analyser är möjliga, exempelvis genom FACS, immunhistokemi, western blotting och / eller, som visas i figur 2C, qPCR.
Trots att ett mycket användbart verktyg för att hjälpa avslöja funktionen av specifika extracellulära protein interaktioner, beskrivs metoden här är inte utan gränser. Eftersom betacellerna måste vara i direkt kontakt med den HEK293 cellagret, insulinomceller cellinjer såsom INS-1-celler är särskilt väl lämpad för denna samodling systemet 4. Omräkning av resultat till primära cellöar kräver spridningen av isolerade öar. Eftersom den lilla ön strukturen i sig är viktig för korrekt signalering och svar på glukos, är den stimulerade insulinsvar trubbiga i spridda primära betaceller relativt intakta öar 1,3,17. Dessutom, eftersom övergående transfektion inte resulterar i enhetligt uttryck av th e protein över HEK gräsmattan, vid bildåtergivning-baserade (immunhistokemisk) experiment, ett sätt att normalisera till proteinuttrycksnivåer kan krävas för att tolka resultaten. En experimentell metod som utnyttjar denna icke-enhetligt uttryck för att analysera effekten av den transfekterade proteinet på den sekretoriska maskineri samodlades INS-1-celler visas i figur 3 i Suckow et al., 2012 10.
Det bör också noteras att omfattningen av kontakten mellan varje given betaceller och närbelägna celler som uttrycker proteinet av intresse är troligen mindre i detta system än i intakta cellöar in vivo, i vilka beta-celler skulle kunna vara omgiven på alla sidor av celler uttrycka proteinet. Denna relativt reducerad cell-till-cell-kontakt kan minska omfattningen av förändringar i insulinsekretion till under vad som skulle observeras om de relevanta transcellulär interaktioner något sätt elimineras från infödda holmar.
e_content "> Användning av en klonal population av stabilt transfekterad HEK293 celler istället transient transfektion skulle resultera i mer enhetligt uttryck och eventuellt förenkla experimentella set-up, men skulle kräva betydligt mer up-front tid och ansträngning för att generera stabilt- uttryckande celler. Framtida studier kommer att avgöra om, genom transfektion två eller flera transmembranproteiner i HEK293 cellagret, kan eventuella synergistiska effekter observeras.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Vi har inget att lämna ut.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av National Institutes of Health bidrag R01DK080971 och Juvenile Diabetes Research Foundation 37-2009-44. Vi uppskattar även stödet från UCSD Pediatric Diabetes Research Center (PDRC).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| pcDNA 3.3 vector/backbone | Invitrogen | K830001 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 18324012 | |
| DMEM | Mediatech | 45001-312 | |
| Pen/strep solution | Mediatech | 45001-652-1 | |
| Amphotericin B | Mediatech | 45001-808-1/30 | |
| RPMI-1640 | Mediatech | 45001-404 | |
| D-PBS | Mediatech | 45001-434 | |
| Sodium Pyruvate | Mediatech | 45001-710-1 | |
| 2-Mercapt–thanol | Invitrogen | 21985023 | |
| Cell stripper | Mediatech | 45000-668 | |
| T75 Flask | BD | 1368065 | |
| 16% Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 50980487 | |
| 10x PBS | Mediatech | 45001-130 | |
| Fetal bovine serum | Mediatech | MT35010CV | |
| IBMX | Sigma | I5879-100MG | |
| RIPA lysis buffer | Sigma | R0278 |
References
- Kelly, C., McClenaghan, N. H., Flatt, P. R. Role of islet structure and cellular interactions in the control of insulin secretion. Islets. 3, 41-47 (2011).
- Konstantinova, I., et al. EphA-Ephrin-A-mediated beta cell communication regulates insulin secretion from pancreatic islets. Cell. 129, 359-370 (2007).
- Jain, R., Lammert, E.
- Poitout, V., Olson, L. K., Robertson, R. P. Insulin-secreting cell lines: classification, characteristics and potential applications. Diabetes Metab. 22, 7-14 (1996).
- Craig, A. M., Graf, E. R., Linhoff, M. W. How to build a central synapse: clues from cell culture. Trends in Neurosciences. 29, 8-20 (2006).
- Scheiffele, P., Fan, J., Choih, J., Fetter, R., Serafini, T. Neuroligin expressed in nonneuronal cells triggers presynaptic development in contacting axons. Cell. 101, 657-669 (2000).
- Abderrahmani, A., et al. Neuronal traits are required for glucose-induced insulin secretion. FEBS Lett. 565, 133-138 (2004).
- Lowe, A. W., Madeddu, L., Kelly, R. B. Endocrine secretory granules and neuronal synaptic vesicles have three integral membrane proteins in common. The Journal of Cell Biology. 106, 51-59 (1988).
- Suckow, A. T., et al. Expression of neurexin, neuroligin, and their cytoplasmic binding partners in the pancreatic beta-cells and the involvement of neuroligin in insulin secretion. Endocrinology. 149, 6006-6017 (2008).
- Suckow, A. T., et al. Transcellular neuroligin-2 interactions enhance insulin secretion and are integral to pancreatic beta cell function. The Journal of Biological Chemistry. 287, 19816-19826 (2012).
- Kohnert, K. D., Hehmke, B. Preparation of suspensions of pancreatic islet cells: a comparison of methods. J. Biochem. Biophys. Methods. 12, 81-88 (1986).
- Qi, M., et al. Human pancreatic islet isolation: Part I: digestion and collection of pancreatic tissue. J. Vis. Exp. (27), e1125 (2009).
- Qi, M., et al. Human pancreatic islet isolation: Part II: purification and culture of human islets. J. Vis. Exp. (27), e1343 (2009).
- Szot, G. L., Koudria, P., Bluestone, J. A.
- Zmuda, E. J., Powell, C. A., Hai, T. A method for murine islet isolation and subcapsular kidney transplantation. J. Vis. Exp. (50), e2096 (2011).
- Hauge-Evans, A. C., Squires, P. E., Persaud, S. J., Jones, P. M. Pancreatic beta-cell-to-beta-cell interactions are required for integrated responses to nutrient stimuli: enhanced Ca2+ and insulin secretory responses of MIN6 pseudoislets. Diabetes. 48, 1402-1408 (1999).
- Spiess, Y., Smith, M. A., Vale, W. Superfusion of dissociated pancreatic islet cells attached to Cytodex beads. Diabetes. 31, 189-193 (1982).
- Pham, P. L., et al. Transient gene expression in HEK293 cells: peptone addition posttransfection improves recombinant protein synthesis. Biotechnol. Bioeng. 90, 332-344 (2005).
- Thomas, P., Smart, T. G. HEK293 cell line: a vehicle for the expression of recombinant proteins. J. Pharmacol. Toxicol. Methods. 51, 187-200 (2005).
- Maurisse, R., et al. Comparative transfection of DNA into primary and transformed mammalian cells from different lineages. BMC Biotechnol. 10, 9 (2010).
