Summary
אינטראקציות חלבון Transcellular הם גורמים חשובים של תפקוד תא בטא בלבלב. מפורט כאן היא שיטה מותאמת ממודל של coculture synaptogenesis-לחוקר כיצד חלבוני הטרנסממברני ספציפיים להשפיע הפרשת אינסולין. HEK293 תאי transfected לבטא חלבונים של עניין; תאים בטא לא צריכים להיות transfected או אחר ישירות מוטרד.
Abstract
אינטראקציות בין חלבונים על פני קרום התא לעזור לתאם את התפקוד של תאים שכנים. תאים בטא בלבלב מקובצים יחד באיי לבלב ולפעול באופן מתואם כדי לשמור על הומאוסטזיס גלוקוז. זה הופך להיות יותר ויותר ברור שאינטראקציות בין חלבוני הטרנסממברני על פני השטח של תאי הבטא סמוכים הן גורמים חשובים של תפקוד תא בטא.
הבהרת התפקידים של אינטראקציות transcellular מסוימות על ידי מחקרי מציאה, נוקאאוט או ביטוי יתר בתאים בטא בתרבית או in vivo מחייבת הפרעות הישירות של mRNA וביטוי חלבונים, שעלול להשפיע על בריאות ו / או בתפקוד תא בטא בדרכים שעלולות לבלבל ניתוחים של ההשפעות של אינטראקציות ספציפיות. גישות אלה גם לשנות רמות של תחומים תאיים של החלבונים הממוקדים ועשויות למנוע תופעות בשל אינטראקציות בין חלבונים בתוך אותו קרום התא להיות דיסtinguished מההשפעות של אינטראקציות transcellular.
הנה שיטה לקביעת ההשפעה של אינטראקציות transcellular ספציפיות ביכולת הפרשת האינסולין ויכולת התגובה של תאי הבטא מוצגת. שיטה זו ישימה לקווי תא בטא, כמו INS-1 תאים, ותאי בטא ראשוניים ניתק. היא מבוססת על מודלים שפותחו על ידי coculture neurobiologists, שמצאו כי חשיפה של נוירונים בתרבית לחלבונים עצביים ספציפיים לידי ביטוי בHEK293 (או COS) שכבות תאי חלבונים שזוהו חשובים לנהיגת היווצרות הסינפסה. בהתחשב בקבלות בין מכונות ההפרשה של סינפסות עצביות ושל תאים בטא, אנחנו מנומקים שהבשלה פונקציונלית תא בטא עשויה להיות מונעת על ידי אינטראקציות transcellular דומות. פיתחנו מערכת שבו תאים בטא בתרבית על שכבה של תאי HEK293 להביע חלבון של עניין. במודל זה, הציטופלסמה התא בטא ללא מגע תוך interactio חלבונים תאייםNS הוא מניפולציה. למרות שאנו מתמקדים כאן בעיקר על מחקרים של גלוקוז-מגורה הפרשת אינסולין, ניתן לנתח תהליכים אחרים, לדוגמה, שינויים בביטוי גנים, כפי שנקבעו על ידי immunoblotting או qPCR.
Introduction
אנו מתארים כאן שיטה כדי להקל על חקירות של כמה תחומים תאיים של חלבוני הטרנסממברני ספציפיים ישפיעו הפרשת אינסולין. בדיקות השיטה את ההשפעות של אינטראקציות של החלבון של עניין עם חלבונים (או אולי מולקולות אחרות) על פני התא בטא בלבלב. השיטה מאפשרת לחקירות של איך על פני קרום תא חלבונים המתבטאים על ידי תאי הבטא או על ידי תאי שכנים אחרים (למשל תאי אנדותל, נוירונים, תאי אלפא בלבלב) להשפיע על תפקוד תא בטא דרך אינטראקציות transcellular (כלומר דרך אינטראקציות עם שותפי אינטראקציה על פני צמוד תאי ביתא).
קרום הפלזמה הסלולרי מכיל מערך מורכב של חלבונים מבניים ופונקציונליים המשמשים כגשרים לסביבה תאית. על ידי יצירה של קשרי transcellular או על ידי ייזום של אירועי איתות פלסטיק, אינטראקציות בין חלבונים על פני קרום התא יכולות לעזור לתאםתפקוד של תאים שכנים. תאים בטא בלבלב מקובצים יחד באיי הלבלב ולפעול באופן מתואם כדי לשמור על הומאוסטזיס 1 גלוקוז. כפי שנחשף, למשל, על ידי את החשיבות של תאי neuroligin-2 אינטראקציות ברגולציה של גלוקוז-מגורה הפרשת אינסולין EphA-ephrinA ו, זה הופך להיות יותר ויותר ברור שידע מוגבר של אינטראקציות בין חלבונים תאיים המתרחשות על פני השטח של צמוד תאי הבטא יהיו חשיבות רבה להשגת הבנה מלאה של הפרשת אינסולין, התבגרות של תאי הבטא תפקודי ותחזוקה של הומאוסטזיס הגלוקוז 1-3. המטרה של השיטה המתוארת כאן היא לאפשר חקירות של ההשפעות על תפקוד תאי הבטא של אינטראקציות transcellular מעורבות הטרנסממברני מסוים או חלבונים אחרים, על פני קרום תא, קשורים. על ידי תאי הבטא במשותף עם culturing HEK293 תאי transfected עם בונה ביטוי שונה, את ההשפעות על bתפקוד תא של ETA שונים על פני קרום תא חלבונים שעברו מוטציה או גרסותיהם יכול להיות יעיל נחקר. המטרה זו מושגת מבלי transfect התאים בטא את עצמם.
הבהרת התפקידים של אינטראקציות transcellular מסוימות על ידי מחקרי מציאה, נוקאאוט או ביטוי יתר בתאים בטא בתרבית או in vivo מחייבת הפרעות הישירות של ה-mRNA תא בטא וביטוי חלבון, שעלול להשפיע על בריאות תא בטא ו / או פונקציה בדרכים שעלולות לבלבל ניתוחים של את ההשפעות של אינטראקציות תאי ספציפיות. גישות אלה גם לשנות רמות של תחומים תאיים של החלבונים והממוקדים, בהמשך, אינה מאפשר אפקטים בשל אינטראקציות בין חלבונים באו באותו התא כדי להבחין בין ההשפעות של אינטראקציות transcellular. כאן, שיטה לקביעת ההשפעה של אינטראקציות transcellular ספציפיות על יכולת הפרשת האינסולין ויכולת התגובה של תאי הביתא היא described. שיטה זו ישימה לקווי אינסולין תא בטא, כמו INS-1 תאים 4, ומכרסם עיקרי ניתק או תאי ביתא אנושיים. היא מבוססת על מודלים שפותחו על ידי coculture neurobiologists, שמצאו כי חשיפה של נוירונים בתרבית לחלבונים עצביים ספציפיים לידי ביטוי בHEK293 (או COS) שכבות תאים יכולים לזהות חלבונים שכונן היווצרות הסינפסה 5,6. בהתחשב בקבלות בין מכונות ההפרשה של סינפסות עצביות ושל תאים בטא, אנחנו סברנו כי תפקוד תא בטא והתבגרות פונקציונלית עשויים להיות מונעים על ידי אינטראקציות 7-9 דומות transcellular. כדי לחקור אינטראקציות אלה, פיתחנו את המערכת המתוארת במסמך שבו תאים בטאו cocultured על שכבה של תאי HEK293 להביע חלבון של עניין 10. מערכת זו מאפשרת הציטופלסמה התא בטא להישאר ללא שינוי ואילו אינטראקציות בין חלבונים תאיים הן מניפולציה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Transfection של HEK293 Layer
- הכן את המדיום סלולרי HEK293 על ידי הוספת 500 מ"ל של DMEM בקבוקים (עם 4.5 גר '/ מיליליטר גלוקוז ופנול אדום וללא גלוטמין): פתרון 50 מ"ל FBS, 5 מיליליטר 100X פתרון סטרפטומיצין פניצילין /, 5 מ"ל 100x L-גלוטמין ו500 amphotericin μl ב '
- צלחת החוצה HEK293 תאים בצלחת 24 גם באמצעות 0.5 מ"ל של HEK293 תקשורת בכל טוב. ודא כי התאים מתחלקים באופן שווה על פני החלק התחתון של הצלחת.
- כאשר תאי HEK293 להגיע ל -100% confluency, transfect עם 0.8 מיקרוגרם של פלסמיד קידוד החלבון של עניין (שמותקן בוקטור ביטוי יונקים) ו2 μl של Lipofectamine 2000 על פי פרוטוקול Lipofectamine. יש לנו שבחרנו להשתמש עמוד השדרה 3.3 pcDNA המיועדת לביטוי בתאי יונקים.
- לחלופין, אחרי 6 שעות של דגירה, חילופי בתקשורת transfection מתוארות בפרוטוקול Lipofectamine עם HEK293 תקשורת הרגילה.
- כדי להעריך את הביטוי של prote transfectedב, קבוצת משנה של בארות תרבית רקמת transfected יכול לשמש לזיהוי immunofluorescent של החלבון ביטא או לניתוח כתם המערבי של ביטוי חלבונים תוך שימוש בטכניקות סטנדרטיות.
2. קיבוע אופציונלי של HEK293 תאים לבטא חלבון transfected
HEK293 תאי transfected יכולים להיות קבועים בעדינות על מנת להקל coculture בתקשורת שעלולה להזיק לחיים HEK293 תאים (למשל צעד 3.9 להלן) או כדי לאפשר הכנה היעילה מראש של צלחות במשך כמה ניסויים בבת אחת (ראה גם דיון).
- לבצע מחקרי טייס לקבוע את מהלך הזמן של הביטוי של החלבון בתאי HEK293.
- לאחר transfecting שכבת התאים HEK293, לשאוב את התקשורת מהתאים בנקודת הזמן שלאחר transfection קשורה עם הרמה הגבוהה ביותר של ביטוי. אם זה מתרחש בתוך 24 שעות הראשונה, שלא תשאף עד 24 שעות לאחר transfection.
- שטוף HEK293 תאים בעדינות עם D-PBS לאחר מכן להוסיף 500 paraformaldehyde 4% μl (PFA) ולדגור על RT למשך 30 דקות. (כדי להפוך את פתרון PFA 4%, להתחיל עם פתרון של 16% ב1X PBS ולדלל 01:04 עם 1X PBS).
- באמצעות PBS סטרילי, לשטוף בעדינות את התאים 3 פעמים ודגירה בPBS O / N ב 4 ° C.
- שטוף תאים 3 פעמים עם PBS סטרילית, ולאחר מכן להוסיף PBS ולהשאיר על 4 מעלות צלזיוס עד צורך (זמן אחסון מרבי עשוי להשתנות בהתאם לחלבון ביטא. אנו מאחסנים HEK293 תאי transfected להביע isoforms neuroligin עד 2 שבועות ללא שינויים משמעותיים בתופעות שנצפו על הפרשת אינסולין).
3. שיתוף culturing של INS-1 תאים בטא עם HEK293 תאים
- הכן INS-1 תקשורת על ידי הוספת 500 מ"ל RPMI 1640 (עם גלוקוז ופנול אדום וללא גלוטמין): 50 מ"ל FBS, 5 מ"ל 100X פניצילין / סטרפטומיצין, פתרון 5 מ"ל 100X L-גלוטמין, 5 פירובט נתרן מ"ל, 500 amphotericin μl ב ', 500 בטא mercaptoethanol μl (זה כמעט זהה לMediאום משמש בדרך כלל לתרבות איון העיקרית, פרט לתוספת של בטא mercaptoethanol).
- שימוש בסלולרי, חשפנית (או מסיר תא אחר שאינם האנזימטית), INS-1 קציר תאים בכ 70-80% confluency את החלק התחתון של בקבוק תרבות T75. כל בקבוק יספק בערך מספיק תאים במשך 48 בארות.
- לאחר שצנח בתאי צנטריפוגות במשך 3 דקות ב -1,200 סל"ד, resuspend בתמהיל של 50/50 INS-1 ומדיה HEK. לבקבוק 70-80% ומחוברות של INS-1 תאים, resuspend בכ 25 מ"ל של טכניקה מעורבת.
- אם אתם משתמשים בHEK293 תאים שתוקנו בparaformaldehyde במקום HEK293 תאי חיים, resuspend תאי INS-1 ב 100% INS-1 תקשורת ולא בטכניקה מעורבת.
- בעזרת פיפטה 10 מ"ל, לסלק את התאים מהגלולה כדי להפוך את השעיה תא הומוגנית.
- לשאוב להסיר את המדיה על HEK293 תאים.
- בעזרת פיפטה P1000, בעדינות להוסיף 500 μl של אח"י-1 השעיה תא על גבי שכבת תאי HEK לאורך הצדדים of כן. אחרי כל 6 בארות, השתמש פיפטה 10 מ"ל לresuspend תאי INS-1 שוב כדי להבטיח השעיה תא הומוגנית. התכנית הכוללת של הגדרת coculture מתוארת באיור 1.
- דגירה התאים עבור 24-48 שעות, בהתאם לפרוטוקול הניסוי.
- אם נדרש יותר מ 48 שעות coculture תקופה, להשתמש בשלבים אופציונליים בסעיף 2 לעיל כדי לתקן את HEK293 תאים.
- אם אתם משתמשים במכרסם ניתק ראשוני או איונים אדם [ר 'לדוגמא פרוטוקולים קודמים ביופיטר 11-15], להבטיח שתקשורת מתאימה כגון RPMI עם 5 מיליליטר עט / סטרפטוקוקוס, 5 מיליליטר L-שפע, 0.5 מ"ל amphotericin-B משמשת במקום INS-1 תקשורת. למרות שניתן להשתמש בתאי איון ניתק בצלחת גם 24, בפועל, בגלל המספר הגדול של איונים פוטנציאל הדרושים, מומלץ שהתמורה תינתן לשינוי קנה מידה למטה לצלחת גם 48 (שחייב איון תאים פחות לכל טוב). על צלחת 48 היטב, להוסיף כ -100 איים בשווי של dissociaטד תאים לכל צלחת להתחיל. בהתאם ליעילות של ניתוק ושיטה, פחות איים ייתכן שיידרשו.
4. גלוקוז מגורה הפרשת אינסולין
- Preincubate תאים ב250 μl של גלוקוז 2.5 מ"מ בKRB (חיץ יקרבונט קרבס-רינגר) למינימום של שעה 1. לpreincubate, להסיר בינונית coculture ולהחליף באופן מיידי עם KRB. מטבע זה צריך להיעשות גם אחד בכל פעם, כדי לצמצם את החשיפה של תאי INS-1 לחמצן סביבתי. לשאוב עם יד אחת בזמן pipetting KRB הנמוך גלוקוז (2.5 מ"מ) עם האחר.
- KRB preincubation Exchange כדי μl 250 של או 2.5 מ"מ או 20 מ"מ גלוקוז בKRB חיץ אחד טוב בכל פעם.
- אם מתאים לניסוי הספציפי, secretagogues נוסף כגון IBMX מיקרומטר 100 ניתן להוסיף כדי לייצר תגובת הפרשת אינסולין חזקה יותר מגורה. תאים בטא איון עיקריים ניתקים בפרט הם גרועים מגיבים לגדלו אלון ריכוזי גלוקוזדואר, אז הנה במיוחד תוספת של IBMX או אחר secretagogues צריך להיחשב 16,17.
- לאחר שעה 1 של דגירה, להעביר תקשורת לmicrofuge צינורות וספין 1,500 XG במשך 5 דקות.
- הסר 200 μl של supernatant ולהשתמש בזה לניתוח על ידי אינסולין RIA או ELISA.
- כדי להכין lysate תא, להוסיף 100 μl של חיץ תמוגה תא Ripa (150 מ"מ NaCl, 1.0% IGEPALCA-630 או Nonidet P-40, deoxycholate נתרן 0.5%, 0.1% SDS, 50 מ"מ טריס, pH 8.0) עם מעכבי פרוטאז ל צלחת מייד לאחר הסרת תקשורת ודגירה על 4 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות.
- ספין למטה lysate במשך 15 דקות ב10,000 XG ולהסיר 50 μl של supernatant לניתוח על ידי אינסולין RIA או ELISA.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
שימוש בשיטה המתוארת כאן, יש לנו בדקנו את ההשפעה של גרסאות של neuroligin החלבון על הפרשת אינסולין שונות. זה משלים את העבודה שלנו פרסמה חוקרת את ההשפעה של neuroligin-2 על תפקוד תא בטא 10. איור 2, למשל, מתאר את התוצאות שהתקבלו מINS-1 coculturing תאים בטא עם HEK293 תאי transfected להביע איזופורם neuroligin המכונה כאן NL- X. ניסוי זה נועד לבדוק את ההשערה כי NL-X עוסק באינטראקציות transcellular המגבירים את הפרשת אינסולין. באיור 2 א, ניתן לראות שביטוי של NL-X גדל בסיס ומגורה הפרשת אינסולין על ידי אח"י-1 תאי cocultured. הגישה של transfecting HEK293 תאים, כך שהם מביעים NL-X מאפשרת לנו לדעת שזה תחום ש- תאי הוא האזור מוצג על פני תא HEK293 וכך תוכל לבוא במגע עם cocultured INS-1-תאים שמביא על obseגידול בהפרשה rved. תחום NL-X תאי חייב להיות באינטראקציה עם חלבון אחר (או אולי איזה מולקולה אחרת) על תוספות 1 תא השטח כדי לגרום לתאי INS-1 להפריש יותר אינסולין. אם תרצה, אינסולין מופרש יכול גם לבוא לידי ביטוי כאחוז מתוכן אינסולין סלולרי, שניתן למדוד לאחר lysing התאים.
באיורים ו2B 2C, תוצאות מסוגים אחרים של ניתוחים באמצעות מערכת coculture מתוארות: באופן ספציפי, ניתוחים של ההשפעה של אינטראקציות transcellular מעורבות neuroligin גרסת NL-Y על תוכן סלולרי אינסולין ועל רמות ה-mRNA אינסולין PDX-1 ו. NL-Y גדל תוכן האינסולין של אח"י-1 תאי cocultured (איור 2). בדיקות נוספות תהיה נחוצות כדי לקבוע אם זה היה כתוצאה מגידול בכמות אינסולין לכל תא או בשל עליית התפשטות תאי INS-1. באיור 2 ג, RNA היה שנקטפו מהתאשכבה ונותח על ידי RT-qPCR. מאז HEK293 תאים ממקור אנושי, לתמלילים שעשויות להיות נוכחת בשניהם HEK293 וINS-1 תאים, שימוש בעכבר ספציפי PCR פריימרים (INS-1 תאים הם ממוצא חולדה) מבטיחה כי ה-mRNA רק של אח"י-1 מקור נמדד. כאן ניתן לראות שcoculture עם NL-Y גדל אינסולין וPDX-1 רמות ה-mRNA (נורמליזציה הייתה ל18S RNA). את פריימרים והשיטות המשמשות לניתוח RT-qPCR זה תוארו תוספת 10, באינטרנט בעבר.
איור 1. Coculture ההגדרה. HEK293 (HEK) תאים נוספים לצלחות תרבית רקמת 24 גם ולאחר מכן transfected. תמונה בשדה בהיר של שכבת נציג HEK293 תא מוצגת בחלקו העליון, מימין. תאי HEK הם transfected להביע חלבון הטרנסממברני epitope-מתויג. כאן, משמש immunofluorescent מכתים לחשוף transfectedתאים (ירוק). , INS-1 התאים הבאים הם הוסיפו. מכתים Immunofluorescent לאינסולין בוצע כדי לאפשר הדמיה של אח"י-1 תאי cocultured (אדום).
איור 2. תוצאות המתקבלות מINS-1 coculturing תאים בטא עם HEK293 תאי transfected להביע את גרסאות חלבון neuroligin NL-X או. בקרת HEK293 תאי NL-Y (מלא, ב, עמודות שחורות) היו transfected עם אותם בונה פלסמיד שינתה כדי שלא חלבון מפורש (עמודות לבנות). הפרשת אינסולין, על ידי אח"י-1 תאי cocultured בתנאי הגלוקוז נמוכים (2.5 ננומטר) וגבוהים (20 מ"מ) וגם לאחר גירוי על ידי גלוקוז הגבוה יחד עם IBMX. ב ', INS-1 תוכן אינסולין תא לאחר coculture עם HEK293 תאים לבטא NL-Y. C, analysהוא של האינסולין וPDX-1 רמות תמליל על ידי RT-qPCR באמצעות RNA שבודד מINS-1 תאי cocultured עם או HEK293 תאי transfected עם NL-Y או עם HEK293 תאי שליטה transfected. (*, P <0.05; **, P <0.01; ***, P <0.001).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
שיטת coculture המתוארת כאן מספקת דרך יעילה כדי לקבוע את החשיבות הפיזיולוגית של חלבונים בטא על פני קרום תא, הטרנסממברני ספציפיים, ובמיוחד של תחומים תאיים שלהם. על ידי תאי הבטא culturing או תאי insulinoma (כגון תאי INS-1 המועסקים כאן) במגע עם תאי HEK293 מוצגות חלבון של עניין על פני התא, יכולים להיות מתוכננים ניסויים כדי לקבוע את ההשפעות של אינטראקציות בין חלבונים תאיים בלי להפריע ישירות הסביבה תאית של התאים. מאחר שהחלבונים של העניין באים לידי ביטוי על ידי HEK293 תאים, כל השפעות על תפקוד β-תאים שיכולים להיות מתווכות על ידי התחומים תאיים של חלבוני transfected תהיה נעדרות, ולכן לא הייתי לסבך את הניתוח של ההשפעות של אינטראקציות תאית.
השפעות על הפרשת אינסולין ניתן לקבוע בקלות על ידי השוואת הפרשה מתאי הביתא cocultured עם HEK293 תאיםלהביע חלבון של עניין להפרשה מתאי הביתא cocultured במגע עם תאי בקרת HEK293. תאי בקרת HEK293 יכולים להיות מדומה transfected או, לחלופין, transfected עם גרסה של פלסמיד הניסויי לבנות מוטציה לייצר חלופה שאינה פונקציונלית של החלבון של עניין. בידיים שלנו, בשני הסוגים של פקדים הניבו תוצאות זהות. מאז פני תא HEK293 מיסודו מכיל מגוון גדול של חלבונים, או סוג של שליטה מאפשר את התפקוד של תאי הבטא במגע עם הרבה מולקולות על פני קרום התא שונים, כולל חלבון של עניין, כדי להיות בהשוואה לתפקוד של תאי הבטא במגע עם אותה הקבוצה של מולקולות על פני השטח של תאי הפרט לחלבון של עניין (או בכלל גרסת מוטציה של החלבון של עניין).
תאי INS-1 (או תאים בטא אחרים) מתווספים לHEK293 שכבות בצפיפות נמוכה, כך שיש קשר מינימאלי או ללא INS-1 תאים עם השני INS-1 celLS. זה מאפשר את ההשפעות של אינטראקציות transcellular בין החלבון של עניין מתבטא על פני השטח של התאים והחלבונים HEK293 על תוספות 1 תא השטח כדי לצפות בהעדר רעש רקע פוטנציאל שנגרם על ידי אינטראקציות transcellular מעורבות אותו החלבון הביעו endogenously על אח"י תא שטח -1.
לאחר transfection, שכבת התאים HEK293 ניתן לתקן בעדינות. יכול להיות מנוצל קיבוע אופציונלי זו כדי לאפשר למספר רב של צלחות coculture כדי להיות מוכנות מייד לתוספת הבאה של תאי הבטא במועד מאוחר יותר. תיקון את HEK293 התאים יהיה גם יתרון אם היו חששות שHEK293 חילוף חומרים או פונקצית הפרשה איכשהו מפריעים לניתוח של תפקוד תא בטא. לבסוף, יכול להיות מועסק בפרוטוקול הקיבוע כדי להקל על ניסויי coculture ממושכים. כאן, היתרון העיקרי של שימוש בתאי HEK293 קבועים הוא שמדיום התרבות האופטימלית לתאי הביתא יכול להיות מועסק במקום להשתמשטכניקה מעורבת (לדוגמה ראה שלב 3.3) הנדרש לשמירה על HEK293 cocultured ותאי בטא בו זמנית. בניסויי coculture ממושכים, שימוש המעורב מדיה אשר אינו אופטימלי עבור כל אחד התא מסוג יכול לפגוע ביכולת קיום של תאי הבטא.
HEK293 תאים מועסקים כאן משום שהם נוחים מאוד לtransfection: הם יכולים להיות transfected עם יעילות גבוהה תוך שימוש במגוון של חומרים כימיים שונים transfection 18,19. HEK293 הוא אחד משני סוגים של תאים, יחד עם תאי COS - שמועסקים באופן שגרתי במערכות coculture עצביות דומות 5. Lipofectamine 2000 הוא מגיב transfection מוכח בשימוש נפוץ מאוד עם HEK293 תאים ויעילים transfection באופן שגרתי להשגת (אחוזים מתאי transfected) של יותר מ -95% במחקרים שפורסמו 18-20. ריאגנטים אחרים יכולים להגיע ליעילות דומה של transfection 19,20. עם מבנה neuroligin פלסמיד-2 שלנו, יעילות transfection היא בדרך כלל ~ 80%. Altהאף אנו מתמקדים כאן במחקרים של גלוקוז-מגורה הפרשת אינסולין, מצבים אחרים של ניתוח הם אפשרי, למשל על ידי FACS, אימונוהיסטוכימיה, סופג מערבי ו / או, כפי שניתן לראות באיור 2 ג, qPCR.
למרות היותו כלי שימושי מאוד עוזר לחשוף את הפונקציה של אינטראקציות חלבון תאיים מסוימות, בשיטה המתוארת כאן היא לא בלי הגבולות. מכיוון שתאי הביתא צריכים להיות בקשר ישיר עם שכבת התאים HEK293, שורות תאי insulinoma כגון INS-1 תאים במיוחד הן מתאימות היטב למערכת coculture זה 4. תרגום התוצאות לתאי איון עיקריים דורש פיזור של איים מבודדים. מכיוון שהמבנה עצמו הוא חלק בלתי נפרד איון לאיתות והתגובה לגלוקוז התקין, תגובת אינסולין מגורה הוא הקהה בתאי הבטא ראשוניים מפוזרים יחסית לאיים שלמים 1,3,17. יתר על כן, בגלל transfection חולף אינו תוצאה של ביטוי אחיד של ה חלבון דואר פני מדשאת HEK, בעת ביצוע ניסויים מבוססי הדמיה (immunohistochemical), שיטה לנרמל לרמות ביטוי החלבון עשוי להידרש כדי לפרש את התוצאות. גישה ניסויית שמנצלת ביטוי לא אחיד זה כדי לנתח את ההשפעה של חלבון transfected על מנגנון ההפרשה של אח"י-1 תאי cocultured מתוארת באיור 3 בSuckow et al., 2012 10.
צריך גם לציין כי את מידת קשר שבין כל תא בטא נתון ותאים שכנים להביע את החלבון של עניין עשויה להיות פחות במערכת זו מאשר באיים שלמים in vivo, שבו תאים בטא עלולים להיות מוקפים מכל עבריו על ידי תאים המבטא את החלבון. זה קשר תא אל תא מופחת יחסית יכול להפחית את היקף שינויים בהפרשת אינסולין להמשך מה יהיה אם ציין את יחסי גומלין transcellular הרלוונטיים בוטלו איכשהו מאיי ילידים.
e_content "> שימוש באוכלוסייה משובט של HEK293 תאים ביציבות-transfected ולא transfection חולף תביא לביטוי אחיד יותר ואולי לפשט ניסיוני ההגדרה, אבל היה דורשת זמן ומאמץ באופן משמעותי יותר מעלה מול על מנת ליצור יציבות- לבטא בתאים. מחקרים עתידיים יקבעו אם, על ידי שניים או יותר transfecting חלבוני הטרנסממברני לתוך שכבת התאים HEK293, יכולה להיבחן השפעה סינרגיסטית אפשרית.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
יש לנו מה למסור.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי המכונים הלאומי לבריאות מענק R01DK080971 וJuvenile Diabetes Research Foundation מענק 37-2009-44. כמו כן, אנו מעריכים את התמיכה שקיבל ממרכז מחקר UCSD הילדים הסוכרת (PDRC).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| pcDNA 3.3 vector/backbone | Invitrogen | K830001 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 18324012 | |
| DMEM | Mediatech | 45001-312 | |
| Pen/strep solution | Mediatech | 45001-652-1 | |
| Amphotericin B | Mediatech | 45001-808-1/30 | |
| RPMI-1640 | Mediatech | 45001-404 | |
| D-PBS | Mediatech | 45001-434 | |
| Sodium Pyruvate | Mediatech | 45001-710-1 | |
| 2-Mercapt–thanol | Invitrogen | 21985023 | |
| Cell stripper | Mediatech | 45000-668 | |
| T75 Flask | BD | 1368065 | |
| 16% Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 50980487 | |
| 10x PBS | Mediatech | 45001-130 | |
| Fetal bovine serum | Mediatech | MT35010CV | |
| IBMX | Sigma | I5879-100MG | |
| RIPA lysis buffer | Sigma | R0278 |
References
- Kelly, C., McClenaghan, N. H., Flatt, P. R. Role of islet structure and cellular interactions in the control of insulin secretion. Islets. 3, 41-47 (2011).
- Konstantinova, I., et al. EphA-Ephrin-A-mediated beta cell communication regulates insulin secretion from pancreatic islets. Cell. 129, 359-370 (2007).
- Jain, R., Lammert, E.
- Poitout, V., Olson, L. K., Robertson, R. P. Insulin-secreting cell lines: classification, characteristics and potential applications. Diabetes Metab. 22, 7-14 (1996).
- Craig, A. M., Graf, E. R., Linhoff, M. W. How to build a central synapse: clues from cell culture. Trends in Neurosciences. 29, 8-20 (2006).
- Scheiffele, P., Fan, J., Choih, J., Fetter, R., Serafini, T. Neuroligin expressed in nonneuronal cells triggers presynaptic development in contacting axons. Cell. 101, 657-669 (2000).
- Abderrahmani, A., et al. Neuronal traits are required for glucose-induced insulin secretion. FEBS Lett. 565, 133-138 (2004).
- Lowe, A. W., Madeddu, L., Kelly, R. B. Endocrine secretory granules and neuronal synaptic vesicles have three integral membrane proteins in common. The Journal of Cell Biology. 106, 51-59 (1988).
- Suckow, A. T., et al. Expression of neurexin, neuroligin, and their cytoplasmic binding partners in the pancreatic beta-cells and the involvement of neuroligin in insulin secretion. Endocrinology. 149, 6006-6017 (2008).
- Suckow, A. T., et al. Transcellular neuroligin-2 interactions enhance insulin secretion and are integral to pancreatic beta cell function. The Journal of Biological Chemistry. 287, 19816-19826 (2012).
- Kohnert, K. D., Hehmke, B. Preparation of suspensions of pancreatic islet cells: a comparison of methods. J. Biochem. Biophys. Methods. 12, 81-88 (1986).
- Qi, M., et al. Human pancreatic islet isolation: Part I: digestion and collection of pancreatic tissue. J. Vis. Exp. (27), e1125 (2009).
- Qi, M., et al. Human pancreatic islet isolation: Part II: purification and culture of human islets. J. Vis. Exp. (27), e1343 (2009).
- Szot, G. L., Koudria, P., Bluestone, J. A.
- Zmuda, E. J., Powell, C. A., Hai, T. A method for murine islet isolation and subcapsular kidney transplantation. J. Vis. Exp. (50), e2096 (2011).
- Hauge-Evans, A. C., Squires, P. E., Persaud, S. J., Jones, P. M. Pancreatic beta-cell-to-beta-cell interactions are required for integrated responses to nutrient stimuli: enhanced Ca2+ and insulin secretory responses of MIN6 pseudoislets. Diabetes. 48, 1402-1408 (1999).
- Spiess, Y., Smith, M. A., Vale, W. Superfusion of dissociated pancreatic islet cells attached to Cytodex beads. Diabetes. 31, 189-193 (1982).
- Pham, P. L., et al. Transient gene expression in HEK293 cells: peptone addition posttransfection improves recombinant protein synthesis. Biotechnol. Bioeng. 90, 332-344 (2005).
- Thomas, P., Smart, T. G. HEK293 cell line: a vehicle for the expression of recombinant proteins. J. Pharmacol. Toxicol. Methods. 51, 187-200 (2005).
- Maurisse, R., et al. Comparative transfection of DNA into primary and transformed mammalian cells from different lineages. BMC Biotechnol. 10, 9 (2010).
