Summary
Transcellular protein interaksjoner er viktige determinanter av pankreatisk p-celle-funksjon. Detaljert her er en metode tilpasset fra en coculture modell av synaptogenesis-for å undersøke hvordan spesifikke transmembrane proteiner påvirker insulin sekresjon. Transfekterte HEK293-celler uttrykker proteiner av interesse; beta celler trenger ikke å bli transfektert eller på annen måte direkte perturbert.
Abstract
Interaksjoner mellom celle-overflateproteiner å koordinere funksjon av nabocellene. Betaceller i bukspyttkjertelen er gruppert sammen i bukspyttkjertelen holmer og handle på en koordinert måte for å opprettholde glukose homeostase. Det blir stadig mer klart at samspillet mellom transmembrane proteiner på overflaten av tilstøtende betacellene er viktige faktorer som bestemmer beta-celle funksjon.
Klarlegging av rollene til bestemte transcellular interaksjon ved knockdown, knockout eller overexpression studier i dyrkede betacellene eller in vivo nødvendiggjør direkte forstyrrelse av mRNA og protein uttrykk, potensielt påvirker beta-celle helse og / eller funksjon på måter som kan forvirrer analyser av effektene av spesifikke interaksjoner. Disse tilnærminger også endre nivåene av de intracellulære domenene til de målrettede proteiner og kan hindre effekter på grunn av interaksjonen mellom proteinene i samme celle membran for å bli fortrengtskredtatte fra virkningene av transcellular interaksjoner.
Her er en fremgangsmåte for å bestemme virkningen av bestemte transcellular interaksjoner på insulin-utskillende kapasitet og responsen til beta-celler er presentert. Metoden kan anvendes til beta-cellelinjer, slik som INS-1 celler, og til dissosiert primære betaceller. Den er basert på coculture modeller utviklet av neurobiologists, som fant at eksponering av dyrkede nerveceller til spesifikke nevrale proteiner uttrykt på HEK293 (eller COS) cellelagene identifiserte proteiner viktige for kjøring synapse formasjon. Gitt parallellene mellom sekretoriske maskiner av nevrale synapser og av beta-cellene, resonnerte vi at beta-celle funksjonelle modning kan være drevet av lignende transcellular interaksjoner. Vi har utviklet et system hvor beta-celler dyrket på et sjikt av HEK293-celler som uttrykker et protein av interesse. I denne modellen er den beta-cellen cytoplasma urørt mens ekstracellulært protein-protein interactions er manipulert. Selv om vi her primært fokuserer på studier av glukose-stimulerte insulin sekresjon, kan andre prosesser som skal analyseres, for eksempel endringer i genekspresjon som bestemt ved immunoblotting eller qPCR.
Introduction
Vi beskriver her en metode for å legge til rette for undersøkelser av hvordan de ekstracellulære domener av spesifikke transmembrane proteiner påvirker insulin sekresjon. Fremgangsmåten omfatter påføring på prober virkningene av interaksjoner av proteinet av interesse med proteiner (eller eventuelle andre molekyler) på pankreatisk p-celle-overflate. Fremgangsmåten tillater undersøkelser av hvordan celle-overflateproteiner uttrykt av betaceller eller av andre nabocellene (f.eks endoteliale celler, nerveceller, pankreatiske alfa-celler) påvirker betacellefunksjonen gjennom transcellular interaksjoner (dvs. gjennom interaksjoner med interaksjonspartnere på overflaten av tilstøtende betacellene).
Den cellulære plasma membran inneholder en kompleks rekke strukturelle og funksjonelle proteiner som fungerer som broer til den ekstracellulære miljøet. Ved dannelsen av transcellular forbindelser eller ved oppstart av plast signalering hendelser, kan interaksjoner mellom celle-overflate proteiner hjelpe koordinerefunksjon av nabocellene. Betaceller i bukspyttkjertelen er gruppert sammen innenfor bukspyttkjertelen holmer og handle på en koordinert måte for å opprettholde glukose homeostase en. Som avslørt, for eksempel ved viktigheten av ekstracellulære EPHA-ephrinA og neuroligin-2 interaksjoner i reguleringen av glukose-stimulert insulin sekresjon, er det blitt stadig mer klart at økt kunnskap om de ekstracellulære interaksjoner oppstår mellom proteiner på overflaten av tilstøtende beta-celler vil være av stor betydning for å få en full forståelse av insulinsekresjon, beta-celle funksjonell modning og opprettholdelse av glukosehomeostase 1-3. Målet med metoden beskrevet her er at undersøkelser av effekter på beta celle funksjon av transcellular interaksjoner som involverer spesifikke transmembran eller på annen måte-celle-overflate-assosierte proteiner. Ved co-dyrking betacellene med HEK293 celler transfektert med forskjellige uttrykk konstruksjoner, effekter på beta celle funksjon av forskjellige celle-overflateproteiner eller muterte varianter derav, kan effektivt bli probet. Dette oppnås uten å transfektere betacellene selv.
Klarlegging av rollene til bestemte transcellular interaksjon ved knockdown, knockout eller overexpression studier i dyrkede betacellene eller in vivo nødvendiggjør direkte forstyrrelse av beta-celle mRNA og protein uttrykk, potensielt påvirker beta celle helse og / eller funksjon på måter som kan forvirrer analyser av virkningene av spesifikke ekstracellulære interaksjoner. Disse tilnærmingene også endre nivåene av de intracellulære domenene til de målrettede proteiner og, videre, tillater ikke effekter på grunn av interaksjonen mellom proteiner på eller i den samme celle som skal skilles fra virkningene av transcellular interaksjoner. Her er en fremgangsmåte for å bestemme virkningen av bestemte transcellular interaksjoner på insulin-utskillende kapasitet og responsen til betaceller beskrIBED. Metoden kan anvendes for insulin-sekresjon beta-cellelinjer, slik som INS-1 celler 4, og til dissosiert primære gnager eller humant beta-celler. Den er basert på coculture modeller utviklet av neurobiologists, som fant at eksponering av dyrkede nerveceller til spesifikke nevrale proteiner uttrykt på HEK293 (eller COS) cellelagene kunne identifisere proteiner som driver synapse formasjon 5,6. Gitt parallellene mellom sekretoriske maskiner av nevrale synapser og av beta-cellene, resonnerte vi at beta-celle funksjon og funksjonelle modning kan være drevet av lignende transcellular interaksjoner 7-9. For å undersøke disse interaksjoner, har vi utviklet system som er beskrevet heri i hvilke beta-celler er cocultured på et lag av HEK293-celler som uttrykker et protein av interesse 10.. Dette systemet gjør at beta-cellen cytoplasma å forbli urørt mens ekstracellulære protein-protein interaksjoner er manipulert.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
En. Transfeksjon av HEK293 Layer
- Forbered HEK293 celler medium ved å tilsette til 500 ml flasker med DMEM (med 4,5 g / ml glukose og fenolrødt og uten glutamin): 50 ml FBS, 5 ml 100X penicillin / streptomycin-løsning, 5 ml 100 x L-glutamin-løsning og 500 mL amphotericin B.
- Plate ut HEK293 celler i et 24-brønners plate med 0,5 ml HEK293 media per brønn. Sikre at cellene er jevnt fordelt over bunnen av platen.
- Når HEK293 celler når 100% konfluens, transfektere med 0,8 ug av plasmid kodende for proteinet av interesse (satt inn i en pattedyr-ekspresjonsvektor) og 2 pl av Lipofectamine 2000 i henhold til den protokoll Lipofectamine. Vi har valgt å bruke pcDNA 3,3 ryggraden utformet for uttrykk i celler hos pattedyr.
- Eventuelt, etter 6 timer med inkubasjon, utveksling transfeksjon media beskrevet i Lipofectamine protokoll med normale HEK293 media.
- Å evaluere uttrykk for transfekterte protei, kan et undersett av de transfekterte vevskultur-brønner brukes til immunofluorescerende påvisning av det uttrykte proteinet eller for Western blot-analyse av protein-ekspresjon ved bruk av standard teknikker.
2. Valgfri fiksering av HEK293 celler uttrykker tilført Protein
Transfekterte HEK293-celler kan være forsiktig festet for å lette coculture i medier som kan være skadelige for levende HEK293-celler (f.eks trinn 3.9 nedenfor), eller for å tillate effektiv fremstilling på forhånd av platene i flere eksperimenter på en gang (se også diskusjon).
- Conduct pilotforsøk for å bestemme tidsforløpet av ekspresjonen av proteinet i HEK293-celler.
- Etter transfektere den HEK293 celle laget, aspirer media fra cellene ved post-transfeksjon tidspunkt forbundet med høyeste grad av uttrykk. Hvis dette skjer innen de første 24 timer, ikke aspirere inntil 24 timer etter transfeksjon.
- Vask HEK293 celler forsiktig med D-PBS deretter legge 500 mL 4% paraformaldehyde (PFA) og ruge på RT i 30 min. (For å gjøre 4% PFA løsning, start med 16% løsning i 1X PBS og fortynne 01:04 med 1X PBS.)
- Ved hjelp av sterilt PBS, forsiktig vask cellene tre ganger i PBS og inkuberes O / N ved 4 ° C.
- Vask cellene tre ganger med sterilt PBS, deretter legge PBS og la ved 4 ° C inntil nødvendig (maksimal oppbevaringstid kan variere avhengig av protein uttrykt. Vi lagrer HEK293 celler transfektert å uttrykke neuroligin isoforms i opptil to uker uten vesentlige endringer i observerte effekter på insulinsekresjon).
3. Co-dyrking av INS-en beta-cellene med HEK293 Cells
- Forbered INS-1 media ved å tilsette til 500 ml RPMI 1640 (med glukose og fenolrødt og uten glutamin): 50 ml FBS, 5 ml 100X penicillin / streptomycin, 5 ml 100X L-glutamin-løsning, 5 ml natrium-pyruvat, 500 mL amphotericin B, 500 ul p-merkaptoetanol (dette er nesten identisk med den medium typisk brukt for primær holme kultur med unntak av tilsetning av beta-merkaptoetanol).
- Ved hjelp av Cell-stripper (eller et annet ikke-enzymatisk celle remover), innhøsting Ins-1 celler ved omtrent 70-80% konfluens av bunnen av en T75 kultur kolbe. Hver kolbe vil gi omtrent nok celler for 48 brønner.
- Etter å spinne ned cellene i sentrifugen i 3 min ved 1200 rpm, resuspender i en 50/50 blanding av INS-1 og HEK-mediet. For en 70-80% konfluent kolbe INS-1 celler, resuspender i ca 25 ml av mixed media.
- Hvis du bruker HEK293 celler som har blitt løst i paraformaldehyde snarere enn levende HEK293 celler, resuspender INS-1 celler i 100% INS-1 media snarere enn mixed media.
- Ved hjelp av en 10 ml pipette, løsne cellene fra bunnfallet til å lage en homogen cellesuspensjon.
- Sug å fjerne mediet på HEK293 celler.
- Ved hjelp av en P1000 pipette, tilsett 500 mL av INS-en celle suspensjon på HEK celle laget langs sidene of brønnen. Etter hver 6 brønner, bruk en 10 ml pipette for å resuspendere INS-1 celler igjen for å sikre en homogen celle suspensjon. Den generelle ordningen med coculture set-up er avbildet i figur 1..
- Inkuber cellene i 24-48 timer avhengig av den eksperimentelle protokollen.
- Hvis mer enn 48 timers coculture periode er nødvendig, bruke valgfrie trinnene i pkt. 2 ovenfor for å fikse HEK293 celler.
- Hvis du bruker primære dissociated gnager eller menneskelige holmer [f.eks se tidligere protokoller i Jove 11-15], sørge for at en passende medier som RPMI med 5 ml penn / strep, 5 ml L-Glut, 0,5 ml amfotericin-B brukes i stedet for INS-1 media. Selv om man kan bruke dissosiert øyceller i en 24 brønns plate, i praksis på grunn av det store antall av holmer potensielt behov for, er det anbefalt at det overveies å skalere ned til en 48 brønn plate (nødvendiggjør færre øyceller pr brønn). På en 48 brønners plate, tilsett ca 100 holmer verdt av dissociaterte celler per plate å starte. Avhengig av effektiviteten av dissosiasjon og hvilken metode som brukes, kan færre holmer være nødvendig.
4. Glukose Stimulert insulinutskillelse
- Preincubate celler i 250 ul av 2,5 mM glukose i KRB (Krebs-Ringer bikarbonat-buffer) i minst 1 time. Å preincubate, fjerne coculture medium og umiddelbart erstatte med KRB. Denne utvekslingen bør gjøres en brønn om gangen for å minimalisere eksponering av Ins-1 celler til miljømessig oksygen. Aspirer med en hånd mens den lave pipettering (2,5 mM) glukose KRB med den andre.
- Utveksling preinkubering KRB til 250 pl av enten 2,5 mM eller 20 mM glukose i KRB-buffer en brønn om gangen.
- Dersom det er hensiktsmessig for den spesifikke eksperiment kan ytterligere secretagogues eksempel 100 uM IBMX bli tilsatt for å gi en mer robust stimulerte insulin sekretoriske respons. Dissosiert primære holmen beta-cellene i særdeleshet er dårlig respons til økt glukose konsentrasjoner Alone, så her spesielt tillegg av IBMX eller annen secretagogues bør vurderes 16,17.
- Etter 1 time med inkubering, overføres til medier mikrofugerør og spinne 1500 xg i 5 min.
- Fjerne 200 pl av supernatanten og bruker dette for analyse av insulin RIA eller ELISA.
- For å fremstille celle-lysat, tilsett 100 pl av cellelyse RIPA-buffer (150 mM NaCl, 1,0% IGEPALCA-630 eller Nonidet P-40, 0,5% natriumdeoksykolat, 0,1% SDS, 50 mM Tris, pH 8,0) med proteaseinhibitorer til plate umiddelbart etter fjerning av media og inkuber ved 4 ° C i 20 min.
- Spinn ned lysat i 15 min ved 10 000 xg og fjerne 50 pl av supernatanten for analyse av insulin RIA eller ELISA.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ved å anvende fremgangsmåten beskrevet her, har vi testet effekten av forskjellige varianter av proteinet neuroligin på insulinsekresjon. Dette utfyller vår publiserte arbeider undersøker effekten av neuroligin-2 på beta-celle funksjon 10. Figur 2, for eksempel, viser resultatene fra coculturing INS-1 beta celler med HEK293 celler transfektert å uttrykke en neuroligin isoform referert til her som NL- X. Dette eksperimentet er designet for å teste hypotesen om at NL-X engasjerer seg i transcellular interaksjoner som øker insulin sekresjon. I figur 2A, hvor det kan sees at ekspresjon av NL-X økt basale og stimulerte insulinsekresjon ved cocultured Ins-1-celler. Tilnærmingen av transfektere HEK293 cellene slik at de uttrykker NL-X tillater oss å vite at det er den ekstracellulære domene som er den regionen som vises på HEK293 celleoverflaten og dermed i stand til å komme i kontakt med cocultured INS-1 celler-som bringer om observed økning i utskillelsen. NL-X ekstracellulære domenet må være i samspill med et annet protein (eller kanskje noen andre molekyl) på INS-en celleoverflaten å føre til INS-1 celler til å skille ut mer insulin. Hvis ønskelig, kan utskilles insulin også uttrykkes som en prosent av cellulær insulin-innhold, som kan måles etter lysering av cellene.
I figur 2B og 2C, er resultater fra andre typer analyser med coculture system avbildet: spesifikt, analyser av effekten av transcellular interaksjoner som involverer neuroligin variant NL-Y på mobilnettet insulin innhold og på PDX-1 og insulin mRNA nivåer. NL-Y økt insulin innholdet i cocultured Ins-1-celler (figur 2B). Ytterligere testing ville være nødvendig for å bestemme om dette var på grunn av en økning i mengden av insulin pr celle eller på grunn av økt Ins-1-celle spredning. På figur 2C ble RNA høstet fra cellenlaget og analysert ved RT-qPCR. Siden HEK293 cellene er av human opprinnelse, for utskrifter som kan være tilstede i både HEK293 og INS-1 celler, bruk av rotte-spesifikk PCR primere (INS-1 cellene er av rotte opprinnelse) sikrer at bare mRNA av INS-en opprinnelse måles. Her kan det ses at med coculture NL-Y forøket insulin og PDX-1 mRNA-nivåer (normalisering var til 18S RNA). Primere og metodikk som benyttes for denne RT-qPCR analyser ble tidligere beskrevet 10, online supplement.
Figur 1. Coculture oppsett. HEK293 (HEK) celler tilsettes til 24-brØnns vevskulturplater og deretter transfektert. Et lyst felt-bilde av en representativ HEK293 celle laget er vist på topp, høyre. De HEK cellene er tilført for å uttrykke en epitope-merket transmembran protein. Her blir immunofluorescerende farging anvendes til å avsløre den transfekterteceller (grønn). Deretter Ins-1 celler tilsettes. Immunofluorescent farging for insulin ble utført for å tillate visualisering av cocultured INS-1 celler (rød).
Figur 2. Resultatene fra coculturing INS-1 beta celler med HEK293 celler transfektert å uttrykke neuroligin protein varianter NL-X eller NL-Y (utfylt, svarte søyler). Kontroll HEK293 celler ble tilført med de samme plasmidkonstruksjoner endret slik at det ikke uttrykke protein (hvite søyler). A, insulin sekresjon av cocultured INS-1 celler ved lave (2,5 nM) og høy (20 mm) glukose forhold og også etter stimulering av høy glukose sammen med IBMX. B, INS-en celle insulin innhold etter coculture med HEK293 celler uttrykker NL-Y. C, analyser av insulin og PDX-en transkripsjon nivåer ved RT-qPCR bruker RNA isolert fra INS-1 celler cocultured med enten HEK293 celler transfektert med NL-Y eller med kontroll-transfekterte HEK293 celler. (* P <0,05; ** p <0.01; ***, p <0,001).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den coculture metoden beskrevet her gir en effektiv måte for å bestemme den fysiologiske betydningen av bestemte beta-celle-overflate, transmembrane proteiner, og spesielt av deres ekstracellulære domener. Ved dyrking av betaceller eller insulinoma celler (slik som de Ins-1 celler anvendt her) som er i kontakt med HEK293-celler som viser et protein av interesse på celleoverflaten, kan eksperimenter være utformet for å fastslå effekten av ekstracellulære protein-protein interaksjoner direkte uten å forstyrre den intracellulære miljøet i cellene. Ettersom proteiner av interesse er uttrykt ved HEK293-celler, ville noen påvirkning på β-celle funksjon som kunne bli formidlet av de intracellulære domenene av de transfekterte proteinene være fraværende, og derfor ikke ville komplisere analyse av virkningene av ekstracellulær interaksjon.
Effekter på insulinsekresjon kan lett bestemmes ved å sammenligne sekresjon fra betaceller cocultured med HEK293 celleruttrykker et protein av interesse til sekresjon fra betaceller cocultured i kontakt med kontroll-HEK293-celler. Styre-HEK293-celler kan være mock-transfekterte eller, alternativt, transfektert med en variant av den eksperimentelle plasmidkonstruksjonen mutert for å produsere en ikke-funksjonell variant av proteinet av interesse. I våre hender, har begge typer kontroller ga identiske resultater. Siden HEK293 celleoverflaten iboende inneholder en stor variasjon av proteiner, gir begge typer styring av funksjonen av beta-cellene i kontakt med mange forskjellige celle-overflatemolekyler, inkludert for proteinet av interesse, for å være i forhold til funksjonen av beta-cellene i kontakt med det samme settet av celleoverflatemolekyler med unntak av proteinet av interesse (eller som omfatter en mutert versjon av proteinet av interesse).
INS-1 celler (eller andre beta-celler) er lagt til HEK293 lag ved lav tetthet slik at det er minimal eller ingen kontakt med INS-1 celler med andre INS-en cells. Dette tillater effekten av transcellular interaksjoner mellom proteinet av interesse uttrykkes på celleoverflaten HEK293 og proteiner på ins-1 celle-overflate som skal observeres i fravær av potensielle bakgrunnsstøy som skyldes transcellular interaksjoner som involverer det samme proteinet uttrykt endogent på ins -1 celleoverflate.
Etter transfeksjon, kan HEK293 celle laget være forsiktig fast. Denne valgfrie fiksering kan utnyttes til å tillate flere coculture plater som skal fremstilles på en gang for etterfølgende tilsetning av beta-cellene ved et senere tidspunkt. Festing av HEK293 celler vil også være en fordel om det var bekymring for at HEK293 metabolisme eller sekretoriske funksjon ville liksom forstyrre analyse av beta cellefunksjon. Endelig kan fiksering protokoll anvendes for å lette langvarig coculture eksperimenter. Her er den viktigste fordelen med å bruke faste HEK293 celler som den optimale kulturmediet for beta-celler kan anvendes i stedet for ved hjelp av enmixed media (f.eks se trinn 3.3) som er nødvendige for å opprettholde cocultured HEK293 og beta celler samtidig. I lengre coculture eksperimenter, bruk av mixed media-som ikke er optimal for enten celletype-kan svekke beta celle levedyktighet.
HEK293 celler er ansatt her fordi de er svært mottagelig for transfeksjon: de kan bli tilført med høy effektivitet ved hjelp av en rekke forskjellige transfeksjon reagenser 18,19. HEK293 er en av to celletypene, sammen med COS celler - som rutinemessig ansatt i lignende nevrale coculture systemer fem. Lipofectamine 2000 er en velprøvd transfeksjon reagens svært vanlig med HEK293 celler og rutinemessig oppnå transfeksjon effektivitet (prosent av cellene tilført) på mer enn 95% i publiserte studier 18-20. Andre reagenser kan oppnå lignende effektiviteten av transfeksjon 19,20. Med vår neuroligin-2 plasmidkonstruksjonen, er transfeksjon effektivitet generelt ~ 80%. AltHough vi her konsentrere på studier av glukose-stimulerte insulin sekresjon, andre former for analyse er mulig, for eksempel ved FACS, immunohistokjemi, western blotting og / eller, som vist på fig 2C, qPCR.
Til tross for å være en svært nyttig verktøy i å hjelpe avdekke funksjon av bestemte ekstracellulære protein interaksjoner, beskrev metoden her er ikke uten sine grenser. Fordi beta-celler trenger å være i direkte kontakt med HEK293 celle laget, insulinoma cellelinjer som INS-1 celler er spesielt godt egnet for dette coculture systemet 4. Oversette resultatene til primære øyen celler krever spredning av isolerte småøyer. Siden holme strukturen selv er integrert i riktig signal og respons på glukose, blir stimulert insulin responsen avstumpet i spredt primære betacellene i forhold til intakte holmer 1,3,17. Videre, fordi forbigående transfeksjon ikke resulterer i uniform ekspresjon av th e protein over HEK plenen, når du utfører bildebehandling-baserte (immunhistokjemisk) eksperimenter, en metode for å normalisere til protein uttrykk nivåer kan være nødvendig å tolke resultatene. En eksperimentell tilnærming som tar fordel av dette ikke-uniform uttrykk for å analysere effekten av den transfekterte protein på sekretoriske maskiner av cocultured Ins-1-celler er vist i figur 3 i Suckow et al. 2012 10.
Det bør også legges merke til at graden av kontakt mellom en gitt beta-celle og de tilgrensende celler som uttrykker proteinet av interesse er sannsynlig å være mindre i dette system enn hos intakte øyer in vivo, hvor beta-cellene kan være omgitt på alle sider av cellene uttrykker proteinet. Denne relativt redusert celle-til-celle kontakt kan redusere omfanget av endringer i insulin sekresjon til under hva som ville bli observert dersom de relevante transcellular interaksjoner ble liksom eliminert fra innfødte holmer.
e_content "> Bruk av en klonal befolkningen i stabilt-transfekterte HEK293 celler snarere enn forbigående transfeksjon vil resultere i mer enhetlig uttrykk og eventuelt forenkle eksperimentelle oppsett, men ville kreve vesentlig mer up-front tid og krefter for å generere stabilt- uttrykke celler. Fremtidige studier vil avgjøre om, ved transfektere to eller flere transmembrane proteiner i HEK293 celle laget, kunne mulige synergieffekter overholdes.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Vi har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av National Institutes of Health tilskudd R01DK080971 og Juvenile Diabetes Research Foundation stipend 37-2009-44. Vi setter også pris støtte mottatt fra UCSD Pediatric Diabetes Research Center (PDRC).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| pcDNA 3.3 vector/backbone | Invitrogen | K830001 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 18324012 | |
| DMEM | Mediatech | 45001-312 | |
| Pen/strep solution | Mediatech | 45001-652-1 | |
| Amphotericin B | Mediatech | 45001-808-1/30 | |
| RPMI-1640 | Mediatech | 45001-404 | |
| D-PBS | Mediatech | 45001-434 | |
| Sodium Pyruvate | Mediatech | 45001-710-1 | |
| 2-Mercapt–thanol | Invitrogen | 21985023 | |
| Cell stripper | Mediatech | 45000-668 | |
| T75 Flask | BD | 1368065 | |
| 16% Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 50980487 | |
| 10x PBS | Mediatech | 45001-130 | |
| Fetal bovine serum | Mediatech | MT35010CV | |
| IBMX | Sigma | I5879-100MG | |
| RIPA lysis buffer | Sigma | R0278 |
References
- Kelly, C., McClenaghan, N. H., Flatt, P. R. Role of islet structure and cellular interactions in the control of insulin secretion. Islets. 3, 41-47 (2011).
- Konstantinova, I., et al. EphA-Ephrin-A-mediated beta cell communication regulates insulin secretion from pancreatic islets. Cell. 129, 359-370 (2007).
- Jain, R., Lammert, E.
- Poitout, V., Olson, L. K., Robertson, R. P. Insulin-secreting cell lines: classification, characteristics and potential applications. Diabetes Metab. 22, 7-14 (1996).
- Craig, A. M., Graf, E. R., Linhoff, M. W. How to build a central synapse: clues from cell culture. Trends in Neurosciences. 29, 8-20 (2006).
- Scheiffele, P., Fan, J., Choih, J., Fetter, R., Serafini, T. Neuroligin expressed in nonneuronal cells triggers presynaptic development in contacting axons. Cell. 101, 657-669 (2000).
- Abderrahmani, A., et al. Neuronal traits are required for glucose-induced insulin secretion. FEBS Lett. 565, 133-138 (2004).
- Lowe, A. W., Madeddu, L., Kelly, R. B. Endocrine secretory granules and neuronal synaptic vesicles have three integral membrane proteins in common. The Journal of Cell Biology. 106, 51-59 (1988).
- Suckow, A. T., et al. Expression of neurexin, neuroligin, and their cytoplasmic binding partners in the pancreatic beta-cells and the involvement of neuroligin in insulin secretion. Endocrinology. 149, 6006-6017 (2008).
- Suckow, A. T., et al. Transcellular neuroligin-2 interactions enhance insulin secretion and are integral to pancreatic beta cell function. The Journal of Biological Chemistry. 287, 19816-19826 (2012).
- Kohnert, K. D., Hehmke, B. Preparation of suspensions of pancreatic islet cells: a comparison of methods. J. Biochem. Biophys. Methods. 12, 81-88 (1986).
- Qi, M., et al. Human pancreatic islet isolation: Part I: digestion and collection of pancreatic tissue. J. Vis. Exp. (27), e1125 (2009).
- Qi, M., et al. Human pancreatic islet isolation: Part II: purification and culture of human islets. J. Vis. Exp. (27), e1343 (2009).
- Szot, G. L., Koudria, P., Bluestone, J. A.
- Zmuda, E. J., Powell, C. A., Hai, T. A method for murine islet isolation and subcapsular kidney transplantation. J. Vis. Exp. (50), e2096 (2011).
- Hauge-Evans, A. C., Squires, P. E., Persaud, S. J., Jones, P. M. Pancreatic beta-cell-to-beta-cell interactions are required for integrated responses to nutrient stimuli: enhanced Ca2+ and insulin secretory responses of MIN6 pseudoislets. Diabetes. 48, 1402-1408 (1999).
- Spiess, Y., Smith, M. A., Vale, W. Superfusion of dissociated pancreatic islet cells attached to Cytodex beads. Diabetes. 31, 189-193 (1982).
- Pham, P. L., et al. Transient gene expression in HEK293 cells: peptone addition posttransfection improves recombinant protein synthesis. Biotechnol. Bioeng. 90, 332-344 (2005).
- Thomas, P., Smart, T. G. HEK293 cell line: a vehicle for the expression of recombinant proteins. J. Pharmacol. Toxicol. Methods. 51, 187-200 (2005).
- Maurisse, R., et al. Comparative transfection of DNA into primary and transformed mammalian cells from different lineages. BMC Biotechnol. 10, 9 (2010).
