Summary
Proteina transcellulare sono importanti determinanti della funzione delle cellule beta del pancreas. Dettagliata qui è un metodo adattato da un modello di co-coltura di sinaptogenesi, per indagare come proteine transmembrana specifici influenzano la secrezione di insulina. Trasfettate HEK293 cellule esprimono proteine di interesse; cellule beta non hanno bisogno di essere trasfettate o meno perturbato direttamente.
Abstract
Le interazioni tra le proteine di superficie cellulare aiutano a coordinare la funzione delle cellule vicine. Cellule beta del pancreas sono raggruppati insieme all'interno di isole pancreatiche e di agire in modo coordinato per mantenere l'omeostasi del glucosio. E 'sempre più evidente che le interazioni tra proteine transmembrana sulla superficie delle cellule beta adiacenti sono importanti determinanti della funzione beta-cellulare.
Chiarimento dei ruoli di particolari interazioni transcellulare di atterramento, knockout o sovraespressione studi in beta cellule in coltura o in vivo richiede perturbazione diretta di mRNA e l'espressione della proteina, con potenziali ripercussioni di salute delle cellule beta e / o la funzione in modi che potrebbero confondere analisi degli effetti di interazioni specifiche. Questi approcci alterano anche i livelli dei domini intracellulari delle proteine mirate e può prevenire effetti dovuti a interazioni tra proteine all'interno della stessa membrana cellulare per essere distinguished dagli effetti di interazioni transcellulare.
Qui viene presentato un metodo per determinare l'effetto di specifiche interazioni transcellulare sulla capacità secernere insulina e la reattività delle cellule beta. Questo metodo è applicabile alle linee di beta-cellule, come cellule INS-1, e di dissociate beta cellule primarie. Si basa su modelli di co-coltura sviluppate da neurobiologi, che hanno trovato che l'esposizione di neuroni coltivati a specifiche proteine neuronali espresse in HEK293 (o COS) strati di cellule identificate proteine importanti per la guida di formazione delle sinapsi. Date le analogie tra la macchina secretoria delle sinapsi neuronali e di cellule beta, abbiamo concluso che la maturazione funzionale delle cellule beta potrebbe essere guidato da interazioni simili transcellulare. Abbiamo sviluppato un sistema in cui le cellule beta sono coltivate su uno strato di cellule HEK293 che esprimono una proteina di interesse. In questo modello, il citoplasma delle cellule beta è toccato mentre extracellulare interactio proteina-proteinans sono manipolati. Anche se ci concentriamo qui principalmente su studi di glucosio-stimolata la secrezione di insulina, altri processi possono essere analizzati, ad esempio, i cambiamenti nell'espressione genica come determinate da immunoblotting o qPCR.
Introduction
Descriviamo qui un metodo per facilitare le indagini di come i domini extracellulari di proteine transmembrana specifici influenzano la secrezione di insulina. Le sonde metodo effetti delle interazioni della proteina di interesse con proteine (o eventualmente altre molecole) sulla superficie delle cellule beta pancreatiche. Il metodo permette ricerche di come le proteine di superficie cellulare espressi dalle cellule beta o da altre cellule vicine (ad esempio cellule endoteliali, neuroni, cellule pancreatiche alfa) che interessano la funzione beta-cellulare attraverso interazioni transcellulare (cioè attraverso le interazioni con partner di interazione sulla superficie adiacente cellule beta).
La membrana plasmatica cellulare contiene una serie complessa di proteine strutturali e funzionali che servono come ponti verso l'ambiente extracellulare. Con la formazione di connessioni transcellulare o inizio di eventi di segnalazione in plastica, le interazioni tra le proteine della superficie cellulare può aiutare a coordinare lafunzione delle celle vicine. Cellule beta del pancreas sono raggruppati insieme all'interno delle isole pancreatiche e di agire in modo coordinato per mantenere l'omeostasi del glucosio 1. Come ha rivelato, ad esempio, dalla importanza di extracellulare EPHA-ephrinA e neuroligin-2 interazioni nella regolazione del glucosio-stimolata la secrezione di insulina, sta diventando sempre più chiaro che una maggiore conoscenza delle interazioni tra le proteine extracellulari che si verificano sulle superfici delle adiacenti cellule beta sarà di grande importanza per ottenere una piena comprensione della secrezione di insulina, la maturazione funzionale delle cellule beta e il mantenimento dell'omeostasi del glucosio 1-3. L'obiettivo del metodo qui descritto è quello di consentire le indagini sugli effetti sulla funzione delle cellule beta delle interazioni che coinvolgono transcellulare transmembrana specifico o proteine altrimenti-cellula-superficie-associate. Dalla co-coltura con cellule beta cellule HEK293 transfettate con diversi costrutti di espressione, gli effetti sul bla funzione delle cellule eta di diverse proteine di superficie cellulare o varianti mutate della stessa può essere efficacemente controllata. Questo si ottiene senza dover transfezione delle cellule beta stessi.
Chiarimento dei ruoli di particolari interazioni transcellulare di atterramento, knockout o sovraespressione studi in beta cellule in coltura o in vivo richiede perturbazione diretta di mRNA delle cellule beta e l'espressione della proteina, potenzialmente influenzare la salute delle cellule beta e / o la funzione in modi che potrebbero confondere le analisi di gli effetti di specifiche interazioni extracellulari. Questi approcci anche alterare i livelli dei domini intracellulari delle proteine mirate e, inoltre, non consentono effetti dovuti alle interazioni tra proteine sulla o nella stessa cella devono essere distinti dagli effetti di interazioni transcellulare. Qui, un metodo per determinare l'effetto di specifiche interazioni transcellulare sulla capacità di secernere insulina e la reattività delle cellule beta è described. Questo metodo è applicabile alle linee di beta-cellule che secernono insulina, come cellule INS-1 a 4, e di roditori primaria dissociato o cellule beta umane. Si basa su modelli di co-coltura sviluppate da neurobiologi, che hanno trovato che l'esposizione di colture di neuroni a specifiche proteine neuronali espresse in HEK293 (o COS) strati di cellule potrebbe identificare le proteine che guidano la formazione delle sinapsi 5,6. Date le analogie tra la macchina secretoria delle sinapsi neuronali e di cellule beta, abbiamo concluso che la funzione beta-cellulare e la maturazione funzionale potrebbero essere guidati da simili interazioni transcellulare 7-9. Al fine di sondare queste interazioni, abbiamo sviluppato il sistema qui descritto in cui le cellule beta sono messi in coltura su uno strato di cellule HEK293 che esprimono una proteina di interesse 10. Questo sistema permette al citoplasma delle cellule beta di rimanere intatto, mentre le interazioni proteina-proteina extracellulare sono manipolati.
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Protocol
1. Trasfezione di HEK293 Strato
- Preparare HEK293 medie cella aggiungendo per bottiglie da 500 ml di DMEM (con 4,5 g / ml di glucosio e di rosso fenolo e senza glutammina): 50 ml di FBS, 5 ml 100X penicillina / streptomicina soluzione, 5 ml di soluzione di L-glutammina 100x e 500 microlitri amfotericina B.
- Piastra su cellule HEK293 in una piastra a 24 pozzetti utilizzando 0,5 ml di HEK293 supporti per pozzetto. Assicurarsi che le cellule sono distribuite in modo uniforme in tutta la parte inferiore della piastra.
- Quando le cellule HEK293 raggiungere il 100% di confluenza, trasfezione con 0,8 pg di plasmide codificante la proteina di interesse (inserito in un vettore di espressione di mammifero) e 2 ml di Lipofectamine 2000 secondo il protocollo Lipofectamine. Noi abbiamo scelto di utilizzare il pcDNA 3.3 backbone progettato per l'espressione in cellule di mammifero.
- Opzionalmente, dopo 6 ore di incubazione, i mezzi di scambio di trasfezione descritto nel protocollo Lipofectamine con normali HEK293 media.
- Per valutare l'espressione della prote transfettatein, un sottoinsieme dei pozzetti di coltura tissutale trasfettate può essere utilizzato per il rilevamento immunofluorescenza della proteina espressa o per l'analisi western blot dell'espressione della proteina usando tecniche standard.
2. Fissazione opzionale di HEK293 cellule che esprimono proteine transfettati
Cellule HEK293 trasfettate possono essere fissati delicatamente per facilitare coculture in mezzi che potrebbero essere nocivi per vivere cellule HEK293 (es. passo 3.9 di seguito) o per consentire l'efficiente preparazione in anticipo di piastre per diversi esperimenti tutti in una volta (vedi anche la discussione).
- Condurre studi pilota per determinare l'andamento temporale dell'espressione della proteina nelle cellule HEK293.
- Dopo trasfettando lo strato di cellule HEK293, aspirare i media dalle cellule al punto di tempo di post-trasfezione associato con più alto livello di espressione. Se questo si verifica entro le prime 24 ore, non aspirare fino a 24 ore dopo la trasfezione.
- Lavare HEK293 cellule delicatamente con D-PBS poi aggiungere 500 microlitri 4% paraformaldeide (PFA) e incubare a temperatura ambiente per 30 min. (Per rendere soluzione 4% PFA, iniziare con una soluzione al 16% in PBS 1X e diluire 1:4 con PBS 1X.)
- Utilizzando PBS sterile, lavare delicatamente le cellule 3 volte in PBS e incubare O / N a 4 ° C.
- Lavare le cellule 3 volte con PBS sterile, quindi aggiungere PBS e lasciare a 4 ° C fino al momento (tempo massimo di conservazione può variare a seconda della proteina espressa. Conserviamo cellule HEK293 trasfettate per esprimere neuroligin isoforme per un massimo di 2 settimane senza cambiamenti significativi effetti osservati sulla secrezione di insulina).
3. Co-coltura di INS-1 beta cellule con cellule HEK293
- Preparare INS-1 media aggiungendo a 500 ml di RPMI 1640 (con glucosio e rosso fenolo e senza glutammina): 50 ml FBS, 5 ml 100X penicillina / streptomicina, 5 ml di soluzione di L-glutammina 100X, 5 ml di piruvato di sodio, 500 microlitri amfotericina B, 500 microlitri beta-mercaptoetanolo (questo è quasi identico al medium tipicamente utilizzato per la cultura isolotto primaria tranne per l'aggiunta di beta-mercaptoetanolo).
- Utilizzando Cell-spogliarellista (o di un altro dispositivo di rimozione delle cellule non enzimatica), INS-1 raccogliere le cellule a circa il 70-80% di confluenza dal fondo di un pallone T75 cultura. Ogni pallone fornirà abbastanza grosso modo le cellule per 48 pozzetti.
- Dopo la filatura giù cellule nella centrifuga per 3 minuti a 1200 rpm, risospendere in un mix di INS-1 e supporti HEK 50/50. Per un pallone 70-80% confluenti di cellule INS-1, risospendere in circa 25 ml di tecniche miste.
- Se si utilizza cellule HEK293 che sono stati fissati in paraformaldeide piuttosto che HEK293 cellule vive, risospendere le cellule INS-1 in 100% INS-1 media, piuttosto che tecnica mista.
- Usando una pipetta 10 ml, staccare le cellule dal pellet per fare una sospensione cellulare omogenea.
- Aspirare a rimuovere il supporto sulle cellule HEK293.
- Usando una pipetta p1000, delicatamente aggiungere 500 microlitri di INS-1 sospensione cellulare su strato di cellule HEK lungo i lati of il pozzo. Dopo ogni 6 pozzi, utilizzare una pipetta da 10 ml per risospendere nuovamente le cellule INS-1 per garantire una sospensione cellulare omogenea. Lo schema complessivo del coculture set-up è raffigurato in Figura 1.
- Incubare le cellule per 24-48 ore a seconda del protocollo sperimentale.
- Se è necessaria più di 48 ore periodo di co-coltura, utilizzare i passaggi opzionali nella sezione 2 sopra per fissare le cellule HEK293.
- Se si utilizza roditore dissociato primaria o isole umane [per esempio vedere Protocolli precedenti in JoVE 11-15], affinché un supporto appropriato, come RPMI con 5 ml pen / strep, 5 ml L-Glut, 0,5 ml di amfotericina-B viene utilizzato al posto di INS-1 media. Anche se si può usare cellule insulari dissociate in una piastra a 24, in pratica, a causa del gran numero di isolotti potenzialmente necessari, si raccomanda che si prenda in considerazione ridimensionamento di una piastra a 48 (che richiede un minor numero di cellule insulari per pozzetto). Su un piatto ben 48, aggiungere circa 100 isolotti valore di dissociazioneted cellule per piastra per iniziare. A seconda dell'efficacia della dissociazione e del metodo utilizzato, può essere richiesto un minor numero di isolotti.
4. Glucosio Stimolato secrezione di insulina
- Preincubare cellule in 250 microlitri di 2.5 mM di glucosio nel KRB (tampone bicarbonato di Krebs-Ringer) per un minimo di 1 ora. Per Preincubare, rimuovere medio co-coltura e sostituire immediatamente con KRB. Questo scambio dovrebbe essere fatto un bene alla volta a ridurre al minimo l'esposizione di cellule INS-1 a ossigeno ambientale. Aspirare con una mano mentre pipettaggio il basso (2,5 mm) KRB glucosio con l'altra.
- Scambio KRB preincubazione a 250 pl di 2,5 mM sia o 20 mM glucosio in KRB buffer di un pozzetto per volta.
- Se appropriato per l'esperimento specifico, secretagoghi aggiuntivi come 100 pM IBMX possono essere aggiunti per produrre una più robusta insulina stimolata risposta secretoria. Isolotto primarie dissociate cellule beta in particolare, sono scarsamente sensibili ad un aumento delle concentrazioni di glucosio Alone, ecco specialmente aggiunta di IBMX o altri secretagoghi dovrebbe essere considerato 16,17.
- Dopo 1 ora di incubazione, trasferire mezzi di comunicazione per microcentrifuga tubi e spin 1.500 xg per 5 min.
- Rimuovere 200 pl del supernatante e di utilizzare per l'analisi da insulina RIA o ELISA.
- Per preparare lisato cellulare, aggiungere 100 microlitri di tampone RIPA lisi cellulare (150 mM NaCl, 1,0% IGEPALCA-630 o Nonidet P-40, 0,5% sodio desossicolato, 0,1% SDS, 50 mM Tris, pH 8,0) con inibitori della proteasi per l' piastra immediatamente dopo aver rimosso media e incubare a 4 ° C per 20 min.
- Spin down lisato per 15 min a 10.000 xg ed eliminare 50 ml di surnatante per l'analisi da insulina RIA o ELISA.
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Representative Results
Utilizzando il metodo descritto qui, è stato testato l'effetto delle diverse varianti del neuroligin proteina sulla secrezione di insulina. Questo completa la nostra opera pubblicata indagare l'effetto di neuroligin-2 sulla funzione delle cellule beta 10. Figura 2, per esempio, descrive i risultati ottenuti da INS-1 coculturing beta cellule con cellule HEK293 transfettate per esprimere un neuroligin isoforma di cui qui come NL- X. Questo esperimento è stato progettato per verificare l'ipotesi che NL-X impegna in interazioni transcellulare che aumentano la secrezione di insulina. Nella Figura 2A, si può osservare che l'espressione di NL-X aumentato basale e stimolata la secrezione di insulina co-coltivate cellule INS-1. L'approccio di trasfezione delle cellule HEK293 modo che essi esprimono NL-X ci permette di sapere che è il dominio extracellulare, che è la regione visualizzata sulla superficie cellulare HEK293 e quindi in grado di entrare in contatto con co-coltivate cellule INS-1-quello porta sulla obseaumento rved della secrezione. Il dominio extracellulare NL-X Deve interagire con un'altra proteina (o forse qualche altra molecola) sul INS-1 superficie cellulare a causare le cellule INS-1 a secernere più insulina. Se desiderato, l'insulina secreta potrebbe anche essere espresso come percentuale di contenuto di insulina cellulare, che può essere misurata dopo lisi delle cellule.
Nelle figure 2B e 2C, i risultati di altri tipi di analisi utilizzando il sistema coculture sono rappresentati: specificamente, le analisi degli effetti delle interazioni transcellulare coinvolgono neuroligin variante NL-Y sul contenuto insulinico cellulare e sui livelli di mRNA di insulina PDX-1 e. NL-Y aumentato il contenuto di insulina dei co-coltivate cellule INS-1 (Figura 2B). Ulteriori test sarebbe necessario determinare se questo è dovuto ad un aumento della quantità di insulina per cella o causa di aumento INS-1 proliferazione cellulare. Nella Figura 2C, RNA è stato raccolto dalla cellulastrato e analizzati mediante RT-qPCR. Dal momento che le cellule HEK293 sono di origine umana, per le trascrizioni che potrebbero essere presenti in entrambi HEK293 e cellule INS-1, l'uso di topo specifico primer PCR (cellule INS-1 sono di origine ratto) assicura l'mRNA di INS-1 origine viene misurata. Qui si può vedere che co-coltura con NL-Y aumentata insulina e PDX-1 livelli di mRNA (normalizzazione doveva 18S RNA). I primer e le metodologie utilizzate per questa analisi RT-qPCR sono stati descritti in precedenza 10, supplemento on-line.
Figura 1. Co-coltura di set-up. HEK293 (HEK), le cellule sono aggiunti alle piastre di coltura tissutale a 24 pozzetti e quindi transfettate. Un'immagine in campo chiaro di una strato di cellule HEK293 rappresentante è indicato in alto, a destra. Le cellule HEK sono transfettate per esprimere una proteina transmembrana epitopo-tag. Qui, immunofluorescenza colorazione è usato per rivelare il transfettatecellule (verde). Vengono aggiunti Avanti, INS-1 le cellule. Immunofluorescenza per l'insulina è stata eseguita per permettere la visualizzazione dei co-coltivate cellule INS-1 (rosso).
Figura 2. I risultati ottenuti da INS-1 coculturing cellule beta con cellule HEK293 transfettate per esprimere le varianti proteiche neuroligin NL-X o NL-Y (compilata, colonne nere). Controllo HEK293 sono state trasfettate con gli stessi costrutti plasmidici per non alterato in modo esprimono proteine (colonne bianche). A, la secrezione di insulina da co-coltivate INS-1 le cellule in condizioni di bassa (2,5 nm) e alto (20 mm) di glucosio e anche dopo la stimolazione con alte concentrazioni di glucosio insieme a IBMX. B, INS-1 contenuto di insulina delle cellule dopo co-coltura con cellule HEK293 che esprimono NL-Y. C, analysè di insulina e PDX-1 livelli di trascrizione mediante RT-qPCR utilizzando RNA isolati da cellule INS-1 co-coltivate sia con cellule HEK293 trasfettate con NL-Y o con cellule HEK293 controllo transfettate. (*, P <0.05; **, p <0.01; ***, P <0.001).
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Discussion
Il metodo qui descritto coculture fornisce un modo efficace per determinare l'importanza fisiologica delle proteine beta-superficie cellulare, transmembrana specifici, e specificatamente di loro domini extracellulari. Coltivando le cellule beta o cellule insulinoma (come gli INS-1 le cellule impiegate qui) a contatto con cellule HEK293 visualizzazione di una proteina di interesse sulla superficie delle cellule, esperimenti possono essere progettati per determinare gli effetti di interazioni proteina-proteina extracellulare senza disturbare direttamente l'ambiente intracellulare delle cellule. Poiché le proteine di interesse sono espresse dalle cellule HEK293, qualsiasi effetto sulla funzione β-cellulare che potrebbe essere mediato dai domini intracellulari delle proteine transfettate sarebbero assenti e quindi non complicherebbero analisi degli effetti delle interazioni extracellulari.
Effetti sulla secrezione di insulina possono essere prontamente determinati confrontando secrezione dalle cellule beta co-coltivate con cellule HEK293esprimendo una proteina di interesse per secrezione dalle cellule beta co-coltivate in contatto con controllo HEK293. Le cellule HEK293 controllo possono essere mock-transfettate o, in alternativa, trasfettate con una variante del costrutto di plasmide mutato sperimentale per produrre una variante non funzionale della proteina di interesse. Nelle nostre mani, entrambi i tipi di controlli hanno dato risultati identici. Poiché la superficie cellulare HEK293 contiene intrinsecamente una grande varietà di proteine, entrambi i tipi di controllo permette la funzione delle cellule beta in contatto con molti differenti molecole di superficie cellulare, compresa la proteina di interesse, da confrontare con la funzione delle cellule beta a contatto con la stessa serie di molecole di superficie cellulare, con l'eccezione della proteina di interesse (o comprendente una versione mutata della proteina di interesse).
INS-1 le cellule (o di altre cellule beta), sono aggiunte le HEK293 strati a bassa densità in modo che ci sia un minimo contatto o nessuna delle cellule INS-1 con altri INS-1 cells. Questo permette effetti delle interazioni tra transcellulare la proteina di interesse espresso sulla superficie delle cellule HEK293 e proteine sulla INS-1 superficie cellulare da osservare in assenza di potenziale rumore causato dalle interazioni transcellulare coinvolgono la stessa proteina espressi endogenamente sulla INS superficie cellulare -1.
Dopo la trasfezione, lo strato di cellule HEK293 può essere fissato con delicatezza. Questa fissazione opzionale può essere utilizzata per consentire co-coltura piastre multiple per essere preparati immediatamente per successiva aggiunta di cellule beta in una data successiva. Fissa le cellule HEK293 sarebbe anche vantaggioso se è la preoccupazione che HEK293 metabolismo o funzione secretoria avrebbero in qualche modo interferire con l'analisi della funzione delle cellule beta. Infine, il protocollo di fissaggio può essere impiegato per facilitare esperimenti co-coltura prolungati. Qui, il principale vantaggio di utilizzare cellule fissate HEK293 è che il mezzo di coltura ottimale per le cellule beta può essere impiegato invece di usare unatecnica mista (ad esempio vedi passo 3.3) necessari per mantenere HEK293 co-coltivate e cellule beta contemporaneamente. In esperimenti di co-coltura prolungata, l'uso del mixed media-che non è ottimale sia per tipo cellulare può compromettere la vitalità delle cellule beta.
Cellule HEK293 sono impiegati qui, perché sono altamente suscettibili di trasfezione: possono essere trasfettate con alta efficienza utilizzando una varietà di differenti reagenti di trasfezione 18,19. HEK293 è uno dei due tipi di cellule, insieme a cellule COS - che vengono abitualmente impiegato in simili sistemi di co-coltura neuronali 5. Lipofectamine 2000 è un reagente di trasfezione provata molto comunemente usato con cellule HEK293 e ordinariamente ottenere l'efficienza di transfezione (percentuale di cellule trasfettate) superiori al 95% in studi pubblicati 18-20. Altri reagenti possono raggiungere simili efficienze di trasfezione 19,20. Con la nostra costrutto neuroligin-2 plasmide, l'efficienza di trasfezione è generalmente ~ 80%. Although ci concentriamo qui su studi di glucosio secrezione di insulina stimolata, sono possibili altre modalità di analisi, ad esempio mediante FACS, immunoistochimica, western blotting e / o, come nella Figura 2C, qPCR.
Pur essendo uno strumento molto utile per aiutare scoprire la funzione di particolari interazioni proteina extracellulare, il metodo qui descritto non è senza i suoi limiti. Poiché le cellule beta devono essere in contatto diretto con lo strato di cellule HEK293, linee cellulari di insulinoma quali cellule INS-1 sono particolarmente adatti per questo sistema coculture 4. Tradurre i risultati a cellule insulari primarie richiede la dispersione delle isole isolate. Poiché la struttura isolotto stessa è inerente al buon segnalazione e risposta al glucosio, la risposta insulinica stimolata è smussata in disperse beta cellule primarie relativi isolotti intatte 1,3,17. Inoltre, poiché trasfezione transiente non consenta di espressione uniforme dei th e proteine attraverso il prato HEK, durante l'esecuzione di esperimenti di imaging-based (immunoistochimica), un metodo per normalizzare i livelli di espressione della proteina può essere richiesto di interpretare i risultati. Un approccio sperimentale che sfrutta questa espressione non uniforme per analizzare l'effetto della proteina transfettate sul macchinario secretoria di co-coltivate cellule INS-1 è descritta nella figura 3 in Suckow et al., 2012 10.
Va inoltre notato che il grado di contatto tra un dato cellule beta e cellule vicine esprimono la proteina di interesse è probabilmente meno in questo sistema rispetto isolotti intatti in vivo, in cui le cellule beta potrebbero essere circondati da tutti i lati da cellule esprimente la proteina. Questo relativamente ridotto contatto cellula-cellula potrebbe ridurre l'entità dei cambiamenti nella secrezione di insulina per sotto di quanto si osserverebbe se le relative interazioni transcellulare erano in qualche modo eliminati dal isolotti native.
e_content "> Uso di una popolazione clonale delle cellule HEK293 stabilmente transfettate anziché trasfezione transiente comporterebbe espressione più uniforme e possibilmente semplificare la configurazione sperimentale, ma richiederebbe sostanzialmente più up-front tempo e sforzo per generare l'stabilmente- cellule che esprimono. Studi futuri determineranno se, transfettando due o più proteine transmembrana nello strato delle cellule HEK293, si potrebbero osservare i possibili effetti sinergici.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Non abbiamo nulla da rivelare.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto dal National Institutes of Health di sovvenzione R01DK080971 e la Juvenile Diabetes Research Foundation concessione 37-2009-44. Apprezziamo anche il supporto ricevuto dal UCSD Pediatric Diabetes Research Center (PDRC).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| pcDNA 3.3 vector/backbone | Invitrogen | K830001 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 18324012 | |
| DMEM | Mediatech | 45001-312 | |
| Pen/strep solution | Mediatech | 45001-652-1 | |
| Amphotericin B | Mediatech | 45001-808-1/30 | |
| RPMI-1640 | Mediatech | 45001-404 | |
| D-PBS | Mediatech | 45001-434 | |
| Sodium Pyruvate | Mediatech | 45001-710-1 | |
| 2-Mercapt–thanol | Invitrogen | 21985023 | |
| Cell stripper | Mediatech | 45000-668 | |
| T75 Flask | BD | 1368065 | |
| 16% Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 50980487 | |
| 10x PBS | Mediatech | 45001-130 | |
| Fetal bovine serum | Mediatech | MT35010CV | |
| IBMX | Sigma | I5879-100MG | |
| RIPA lysis buffer | Sigma | R0278 |
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