Summary
Interacciones proteína transcelular son determinantes importantes de la función de las células beta pancreáticas. Detalladas aquí es un método adaptado de un modelo de co-cultivo de sinaptogénesis-para investigar cómo las proteínas transmembrana específicos influyen en la secreción de insulina. Células HEK293 transfectadas expresan proteínas de interés; células beta no necesitan ser transfectadas o de otro modo perturbado directamente.
Abstract
Las interacciones entre las proteínas de la superficie celular ayudan a coordinar la función de las células vecinas. Las células beta pancreáticas se agrupan dentro de los islotes pancreáticos y actúan de forma coordinada para mantener la homeostasis de la glucosa. Cada vez es más claro que las interacciones entre las proteínas transmembrana en las superficies de las células beta adyacentes son determinantes importantes de la función de las células beta.
La elucidación de los papeles de las interacciones particulares transcelular por estudios de caída, knockout o la sobreexpresión en células beta en cultivo o in vivo requiere perturbación directa de ARNm y la expresión de la proteína, afectando potencialmente a la salud de las células beta y / o función en formas que podrían confundir los análisis de los efectos de interacciones específicas. Estos enfoques también alteran los niveles de los dominios intracelulares de las proteínas específicas y pueden prevenir los efectos debidos a las interacciones entre las proteínas dentro de la misma membrana celular para ser disdistinguirse de los efectos de las interacciones transcelular.
Aquí se presenta un método para determinar el efecto de las interacciones específicas transcelular en la capacidad de secreción de insulina y la capacidad de respuesta de las células beta. Este método es aplicable a las líneas de las células beta, como INS-1 en las células, y las células beta primarios disociados. Se basa en modelos desarrollados por cocultivo neurobiólogos, que encontraron que la exposición de las neuronas cultivadas a las proteínas neuronales específicas expresadas en células HEK293 (o COS) capas de células de proteínas identificadas importantes para la conducción de la formación de sinapsis. Dadas las similitudes entre el mecanismo de secreción de las sinapsis neuronales y de las células beta, que razonó que la maduración funcional de las células beta podría ser impulsada por las interacciones transcelulares similares. Hemos desarrollado un sistema en el que las células beta se cultivan sobre una capa de células HEK293 que expresan una proteína de interés. En este modelo, el citoplasma de las células beta está sin tocar mientras extracelular INTERACCIO proteína-proteínans son manipulados. Aunque aquí nos centraremos principalmente en los estudios de la glucosa estimulada por la secreción de insulina, otros procesos pueden ser analizados, por ejemplo, cambios en la expresión génica según lo determinado por inmunotransferencia o qPCR.
Introduction
Se describe aquí un método para facilitar las investigaciones de cómo los dominios extracelulares de proteínas de transmembrana específicos afectan a la secreción de insulina. Las sondas método de los efectos de las interacciones de la proteína de interés con las proteínas (o, posiblemente, otras moléculas) en la superficie de las células beta pancreáticas. El método permite la investigación de cómo las proteínas de la superficie celular expresadas por las células beta o por otras células vecinas (por ejemplo, células endoteliales, neuronas, células alfa pancreáticas) afectan a la función de las células beta a través de interacciones transcelular (es decir, a través de interacciones con los compañeros de interacción sobre la superficie adyacente de células beta).
La membrana plasmática celular contiene una serie compleja de proteínas estructurales y funcionales que sirven como puentes para el medio ambiente extracelular. Por formación de conexiones transcelulares o inicio de eventos de señalización de plástico, las interacciones entre las proteínas de la superficie celular puede ayudar a coordinar lala función de las células vecinas. Las células beta pancreáticas están agrupados juntos dentro de los islotes pancreáticos y actúan de forma coordinada para mantener la homeostasis de la glucosa 1. Como se reveló, por ejemplo, por la importancia de la extracelular EphA-ephrinA y neuroligina-2 interacciones en la regulación de la glucosa estimulada por la secreción de insulina, que se está convirtiendo cada vez más claro que el aumento de los conocimientos de las interacciones entre las proteínas extracelulares que se producen en las superficies adyacentes de células beta serán de gran importancia para obtener una comprensión completa de la secreción de insulina, beta maduración funcional celular y el mantenimiento de la homeostasis de la glucosa 1-3. El objetivo del método descrito aquí es permitir a las investigaciones de los efectos sobre la función de las células beta de las interacciones que implican transcelular transmembrana específico o proteínas de otra manera-de la superficie celular asociadas. Por células beta el co-cultivo con células HEK293 transfectadas con diferentes construcciones de expresión, los efectos sobre el bfunción de las células eta de diferentes proteínas de la superficie celular o variantes mutadas de los mismos puede ser eficiente sondeó. Esto se consigue sin tener que transfectar las células beta a sí mismos.
La elucidación de los papeles de las interacciones particulares transcelular por estudios de caída, knockout o la sobreexpresión en células beta en cultivo o in vivo requiere perturbación directa de ARNm de las células beta y la expresión de la proteína, afectando potencialmente salud de las células beta y / o función en formas que podrían confundir los análisis de los efectos de las interacciones extracelulares específicas. Estos enfoques también altera los niveles de los dominios intracelulares de las proteínas específicas y, además, no permiten que los efectos debidos a las interacciones entre las proteínas sobre o dentro de la misma célula debe distinguirse de los efectos de las interacciones transcelular. Aquí, un método para determinar el efecto de las interacciones específicas transcelular en la capacidad de secreción de insulina y la capacidad de respuesta de las células beta es descrIbed. Este método es aplicable a líneas secretoras de insulina de las células beta, tales como las células INS-1, 4 y para primarias de roedor disociadas o células beta humanos. Se basa en modelos desarrollados por cocultivo neurobiólogos, que encontraron que la exposición de las neuronas cultivadas a proteínas neuronales específicas expresadas en células HEK293 (o COS) capas de células podría identificar las proteínas que la unidad de formación de sinapsis 5,6. Dadas las similitudes entre el mecanismo de secreción de las sinapsis neuronales y de las células beta, que razonó que la función de las células beta y la maduración funcional podrían ser impulsados por las interacciones transcelulares similares 7-9. Con el fin de sondear estas interacciones, hemos desarrollado el sistema descrito en este documento en el que las células beta se co-cultivaron sobre una capa de células HEK293 que expresan una proteína de interés 10. Este sistema permite que el citoplasma de las células beta de permanecer intacta mientras extracelulares interacciones proteína-proteína son manipulados.
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Protocol
1. Transfección de células HEK293 Capa
- Para preparar el medio celular HEK293 mediante la adición a las botellas de 500 ml de DMEM (con 4,5 g / ml de glucosa y rojo de fenol y sin glutamina): 50 ml de FBS, 5 ml de 100X penicilina / estreptomicina solución, 5 ml 100x solución de L-glutamina y 500 l anfotericina B.
- Placa cabo HEK293 células en una placa de 24 pocillos con 0,5 ml de HEK293 media por pozo. Asegúrese de que las células se distribuyen uniformemente a través de la parte inferior de la placa.
- Cuando las células HEK293 alcanzan el 100% de confluencia, transfectar con 0,8 g de plásmido que codifica la proteína de interés (insertado en un vector de expresión de mamífero) y 2 l de Lipofectamina 2000 de acuerdo con el protocolo de Lipofectamina. Hemos optado por utilizar el pcDNA 3.3 backbone diseñado para la expresión en células de mamífero.
- Opcionalmente, después de 6 horas de incubación, el intercambio de los medios de transfección se describe en el protocolo Lipofectamine HEK293 con medios normales.
- Para evaluar la expresión de la prot transfectadasen, un subconjunto de los pocillos de cultivo de tejidos transfectadas se puede utilizar para la detección de inmunofluorescencia de la proteína expresada o para el análisis de transferencia de Western de expresión de la proteína usando técnicas estándar.
2. Fijación opcional de células HEK293 que expresan la proteína Transfectados
Células HEK293 transfectadas se pueden fijar suavemente con el fin de facilitar el co-cultivo en medios que podrían ser perjudiciales para la vida (por ejemplo, células HEK293 paso 3.9 a continuación) o para permitir la eficiente preparación de antemano de las placas de varios experimentos a la vez (véase también la discusión).
- Llevar a cabo estudios piloto para determinar el curso temporal de la expresión de la proteína en las células HEK293.
- Después de la transfección de la capa de células HEK293, aspirar los medios de comunicación de las células en el punto de tiempo después de la transfección asociado con más alto nivel de expresión. Si esto ocurre dentro de las primeras 24 horas, no aspirar hasta 24 h después de la transfección.
- Lave HEK293 suavemente las células con D-PBS a continuación, añadir 500 l 4% de paraformaldehído (PFA) y se incuban a temperatura ambiente durante 30 min. (Para obtener la solución PFA 4%, comience con una solución de 16% en PBS 1X y se diluye 1:4 con 1X PBS.)
- Usando PBS estéril, lavar suavemente las células 3 veces con PBS y se incuban O / N a 4 ° C.
- Lavar las células 3 veces con PBS estéril y añadiendo PBS y dejar a 4 ° C hasta que se necesite (tiempo máximo de almacenamiento puede variar en función de la proteína expresada. Almacenamos células HEK293 transfectadas para expresar isoformas neuroligin hasta 2 semanas sin cambios significativos en los efectos observados sobre la secreción de la insulina).
3. Co-cultivo de INS-1 las células beta con células HEK293
- Preparar INS-1 mediante la adición de medios de comunicación a 500 ml de RPMI 1640 (con glucosa y rojo de fenol y sin glutamina): 50 ml de FBS, 5 ml de 100X penicilina / estreptomicina, 5 ml de 100X solución de L-glutamina, 5 ml de piruvato de sodio, 500 l anfotericina B, 500 l de beta-mercaptoetanol (esto es casi idéntica a la medicinaum usado típicamente para el cultivo de islote primaria a excepción de la adición de beta-mercaptoetanol).
- Uso de la célula-separador (u otro removedor de células no enzimático), INS-1 cosecha de células en aproximadamente el 70-80% de confluencia de la parte inferior de un matraz de cultivo T75. Cada matraz proporcionará suficientes células más o menos de 48 pozos.
- Después de centrifugar las células en la centrifugadora durante 3 min a 1200 rpm, volver a suspender en una mezcla de medios de comunicación HEK INS-1 y 50/50. En un matraz confluente 70-80% de las células INS-1, volver a suspender en aproximadamente 25 ml de técnica mixta.
- Si el uso de células HEK293 que han sido fijados en paraformaldehído en lugar de células vivas HEK293, volver a suspender las células INS-1 en 100% INS-1 media en lugar de técnica mixta.
- Usando una pipeta de 10 ml, desprender las células de la pastilla para hacer una suspensión celular homogénea.
- Aspire para eliminar los medios de comunicación sobre las células HEK293.
- Usando una pipeta P1000, añadir con cuidado 500 l de SIN-1 suspensión celular en la capa de células HEK a lo largo de los lados of pozo. Después de cada 6 pozos, utilizar una pipeta de 10 ml para resuspender las células INS-1 de nuevo para asegurar una suspensión celular homogénea. El esquema general de la co-cultivo de configuración se muestra en la Figura 1.
- Se incuban las células durante 24-48 horas, dependiendo del protocolo experimental.
- Si se requiere período de co-cultivo de más de 48 horas, utilice los pasos opcionales en la sección 2 anterior para fijar las células HEK293.
- Si el uso de roedor disociadas primaria o islotes humanos [por ejemplo, ver los protocolos anteriores en JoVe 11-15], asegurar que un medio apropiado tal como medio RPMI con 5 ml de penicilina / estreptomicina, 5 ml de L-GLUT, 0,5 ml de anfotericina-B se utilizan en lugar de INS-1 media. Aunque se pueden usar células de los islotes disociados en una placa de 24 pocillos, en la práctica, debido a la gran cantidad de islotes potencialmente necesarios, se recomienda que se considere la posibilidad de ampliación a una placa de 48 (que requiere un menor número de células de los islotes por pocillo). En una placa de 48 pocillos, agregar aproximadamente 100 islotes valor de disociaciónted células por placa para empezar. Dependiendo de la eficacia de la disociación y el método utilizado, puede ser necesario un menor número de islotes.
4. La glucosa secreción de insulina estimulada
- Preincubación de células en 250 l de 2,5 mM de glucosa en KRB (tampón de bicarbonato de Krebs-Ringer) durante un mínimo de 1 hora. Para preincubar, quite medio de cocultivo y reemplazar inmediatamente con KRB. Este intercambio se debe hacer un pozo a la vez para minimizar la exposición de las células INS-1 a oxígeno ambiental. Aspirar con una mano mientras pipetear la baja (2,5 mM) KRB glucosa con el otro.
- Tipo de KRB preincubación a 250 l de o bien 2,5 mM o 20 mM de glucosa en tampón KRB un pozo a la vez.
- Si es apropiado para el experimento específico, se pueden añadir secretagogos adicionales tales como IBMX 100 mM para producir una respuesta secretora de insulina estimulada más robusto. Las células beta de los islotes principales disociadas en particular, son poco sensibles a un aumento de las concentraciones de glucosa alone, por lo que aquí especialmente adición de IBMX o secretagogos de otra debe ser considerada 16,17.
- Después de 1 h de incubación, la transferencia de los medios de comunicación para tubos de microcentrífuga y giran 1.500 g durante 5 min.
- Retire 200 l del sobrenadante y utilizar este para el análisis de insulina por RIA o ELISA.
- Para preparar el lisado de células, añadir 100 ml de RIPA buffer de lisis celular (150 mM de NaCl, 1,0% IGEPALCA-630 o Nonidet P-40, 0,5% de desoxicolato de sodio, 0,1% de SDS, 50 mM de Tris, pH 8,0) con inhibidores de la proteasa a la placa inmediatamente después de la eliminación de los medios de comunicación y se incuba a 4 ° C durante 20 min.
- Centrifugar lisado durante 15 min a 10.000 xg y eliminar 50 l de sobrenadante para el análisis de la insulina por RIA o ELISA.
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Representative Results
Usando el método descrito aquí, se ha probado el efecto de diferentes variantes de la proteína neuroligina sobre la secreción de insulina. Esto complementa nuestro trabajo publicado investigar el efecto de neuroligina-2 en la función de las células beta 10. Figura 2, por ejemplo, representa los resultados obtenidos a partir de INS-1 cocultivo de las células beta con células HEK293 transfectadas para expresar una isoforma neuroligina se hace referencia aquí como NL- X. Este experimento fue diseñado para probar la hipótesis de que la NL-X participa en interacciones transcelular que aumentan la secreción de insulina. En la Figura 2A, se puede observar que la expresión de NL-X aumentó basal y estimulada la secreción de insulina por las células cocultivadas INS-1. El enfoque de la transfección de células HEK293 para que expresen NL-X nos permite saber que es el dominio extracelular, que es la región que aparece en la superficie de las células HEK293 y así poder entrar en contacto con cocultured INS-1 células-que trae sobre la ELOBSErved aumento en la secreción. El dominio extracelular NL-X debe estar interactuando con otra proteína (o tal vez alguna otra molécula) en la superficie de células INS-1 para provocar que las células INS-1 para secretar más insulina. Si se desea, la insulina secretada podría también ser expresado como un por ciento de contenido de insulina celular, que se puede medir después de lisar las células.
En las figuras 2B y 2C, los resultados de otros tipos de análisis utilizando el sistema de cocultivo se representan: específicamente, los análisis del efecto de las interacciones que implican transcelular neuroligina variante NL-Y sobre el contenido de insulina celular y en PDX-1 y los niveles de ARNm de insulina. NL-Y aumentó el contenido de insulina de las células cocultivadas INS-1 (Figura 2B). Sería necesario para determinar si esto era debido a un aumento en la cantidad de insulina por célula o debido a una mayor proliferación de las células INS-1 La prueba adicional. En la Figura 2C, el ARN se extrae de la célulacapa y se analizaron por RT-qPCR. Dado que las células HEK293 son de origen humano, para las transcripciones que pueden estar presentes tanto en células HEK293 y células INS-1, el uso de cebadores de PCR específico de las ratas (células INS-1 son de origen de rata) se asegura de que sólo ARNm de INS-1 origen se mide. Aquí se puede ver que cocultivo con NL-Y aumentó la insulina y PDX-1 los niveles de mRNA (normalización fue 18S ARN). Los cebadores y la metodología utilizada para este análisis RT-qPCR fueron descritos anteriormente 10 suplemento, en línea.
Figura 1. Coculture configuración. Células HEK293 (HEK) se añaden a las placas de cultivo de tejidos de 24 pocillos y transfectadas. Una imagen de campo claro de una capa de células HEK293 representativa se muestra en la parte superior, a la derecha. Las células HEK se transfectan para expresar una proteína de transmembrana epítopo de etiquetado. Aquí, la tinción de inmunofluorescencia se utiliza para revelar la transfectadocélulas (verde). A continuación, se añaden las células INS-1. La tinción por inmunofluorescencia para la insulina se llevó a cabo para permitir la visualización de las células cocultivadas INS-1 (rojo).
Figura 2. Resultados obtenidos a partir de INS-1 cocultivo de las células beta con células HEK293 transfectadas para expresar las variantes de la proteína neuroligin NL-X o NL-Y (rellenado, columnas negras). Células HEK293 de control fueron transfectadas con las mismas construcciones de plásmidos que no alterados por lo Protein Express (columnas blancas). Una, la secreción de insulina por las células cocultivadas INS-1 en condiciones de baja (2,5 nM) y alta (20 mM) de glucosa y también después de la estimulación por la glucosa alta junto con IBMX. B, el INS-1 contenido de insulina celular después de co-cultivo con células HEK293 que expresan NL-Y. C, analyses de la insulina y PDX-1 los niveles de transcripción por RT-qPCR utilizando ARN aislado de las células INS-1 cocultivadas con células HEK293 transfectadas con NL-Y o con células de control-HEK293 transfectadas. (*, P <0,05; **, P <0,01; ***, P <0,001).
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Discussion
El método de cocultivo descrito aquí proporciona una forma eficaz para determinar la importancia fisiológica de las proteínas de las células beta-superficie, transmembrana específicos, y específicamente de sus dominios extracelulares. Por el cultivo de las células beta o células de insulinoma (tales como las células INS-1 empleadas aquí) en contacto con las células HEK293 que presentan una proteína de interés en la superficie celular, se pueden diseñar experimentos para determinar los efectos extracelulares de las interacciones proteína-proteína sin alterar directamente el medio intracelular de las células. Dado que las proteínas de interés se expresan por las células HEK293, cualquier efecto sobre la función β-célula que podría estar mediado por los dominios intracelulares de las proteínas transfectadas estarían ausentes y por lo tanto no complicar el análisis de los efectos de las interacciones extracelulares.
Efectos sobre la secreción de insulina se pueden determinar fácilmente mediante la comparación de la secreción de las células beta cocultured con células HEK293expresar una proteína de interés a la secreción de las células beta cocultured en contacto con células HEK293 de control. Las células de control pueden ser HEK293 transfectadas de manera simulada o, alternativamente, transfectada con una variante de construir el plásmido experimental mutado para producir una variante no funcional de la proteína de interés. En nuestras manos, ambos tipos de controles han dado resultados idénticos. Dado que la superficie celular HEK293 contiene inherentemente una gran variedad de proteínas, ya sea tipo de control permite la función de las células beta en contacto con muchos diferentes moléculas de la superficie celular, incluyendo la proteína de interés, al ser comparado con la función de las células beta en contacto con el mismo conjunto de moléculas de superficie celular con la excepción de la proteína de interés (o incluyendo una versión mutada de la proteína de interés).
SIN-1 células (u otras células beta) se añaden a los HEK293 capas a baja densidad de modo que haya un mínimo o ningún contacto de las células INS-1 con otra INS-1 cells. Esto permite que los efectos de las interacciones transcelular entre la proteína de interés expresada en la superficie celular HEK293 y proteínas en la superficie de células INS-1 para ser observado en la ausencia de potencial de ruido de fondo causado por las interacciones transcelular referentes a la misma proteína expresada endógenamente en el INS superficie de la célula -1.
Después de la transfección, la capa de células HEK293 se puede fijar suavemente. Esta fijación opcional se puede utilizar para permitir que múltiples placas de cocultivo a ser preparados a la vez para la adición posterior de las células beta en una fecha posterior. La fijación de las células HEK293 también sería ventajoso si existe la preocupación de que HEK293 metabolismo o la función secretora de alguna manera interferir con el análisis de la función de las células beta. Por último, el protocolo de fijación se puede emplear para facilitar experimentos de cocultivo prolongados. Aquí, la principal ventaja del uso de células HEK293 fijos es que el medio de cultivo óptimo para las células beta se puede emplear en lugar de utilizar untécnica mixta (por ejemplo, véase paso 3.3) necesarias para mantener cocultivadas HEK293 y células beta simultáneamente. En los experimentos de cocultivo prolongados, el uso de la mezcla de los medios de comunicación-que no es óptima, ya sea para el tipo de células puede poner en peligro la viabilidad de las células beta.
Las células HEK293 se emplean aquí, ya que son altamente susceptibles de transfección: pueden ser transfectadas con alta eficacia usando una variedad de diferentes reactivos de transfección 18,19. HEK293 es uno de los dos tipos de células-junto con las células COS - que se emplean habitualmente en los sistemas de cocultivo neuronales similares 5. Lipofectamine 2000 es un reactivo de transfección probada muy comúnmente utilizado con células HEK293 y el logro de eficiencias de transfección de forma rutinaria (por ciento de las células transfectadas) de mayor que 95% en los estudios publicados 18-20. Otros reactivos pueden lograr eficiencias de transfección similares 19,20. Con nuestra neuroligin-2 construcción de plásmido, transfección eficiencia es generalmente ~ 80%. AltHough nos centramos aquí en los estudios de la glucosa estimulada por la secreción de insulina, otros modos de análisis son posibles, por ejemplo, mediante FACS, inmunohistoquímica, transferencia de Western y / o, como se ve en la Figura 2C, la qPCR.
A pesar de ser una herramienta muy útil para ayudar a descubrir la función de determinadas interacciones de proteínas extracelulares, el método descrito aquí no es sin sus límites. Debido a que las células beta necesitan estar en contacto directo con la capa de células HEK293, líneas celulares de insulinoma tales como células INS-1 son particularmente adecuados para este sistema de cocultivo 4. Traslación de los resultados primarios de células de los islotes requiere la dispersión de islotes aislados. Dado que la propia estructura de los islotes es parte integral de la señalización adecuada y la respuesta a la glucosa, la respuesta de insulina estimulada se embota en las células beta primarias dispersas relativas a los islotes intactos 1,3,17. Además, debido a la transfección transitoria no da lugar a la expresión uniforme de th proteína de correo a través del césped HEK, al realizar experimentos basados en la imagen (inmunohistoquímica), un método para normalizar los niveles de expresión de proteínas puede ser necesaria para interpretar los resultados. Un enfoque experimental que se aprovecha de esta expresión no uniforme para analizar el efecto de la proteína transfectada en la maquinaria secretora de cocultured células INS-1 se representa en la Figura 3 en Suckow et al., 2012 10.
También debe tenerse en cuenta que el grado de contacto entre cualquier célula beta dada y las células vecinas que expresa la proteína de interés es probable que sea menos en este sistema que en islotes intactos in vivo, en el que las células beta pueden estar rodeados por todos los lados por las células que expresa la proteína. Este contacto de célula a célula relativamente reducido podría reducir la magnitud de los cambios en la secreción de insulina a por debajo de lo que se observaría si las interacciones transcelular pertinentes fueron eliminados de alguna manera a partir de islotes nativos.
e_content "> Uso de una población clonal de células HEK293 transfectadas de forma estable en lugar de la transfección transitoria podría dar lugar a la expresión más uniforme y posiblemente simplificar montaje experimental, pero requeriría sustancialmente más por adelantado el tiempo y esfuerzo con el fin de generar la forma estable- las células que expresan. Los estudios futuros determinarán si, mediante la transfección de dos o más proteínas de la transmembrana en la capa de células HEK293, se pudieron observar los posibles efectos sinérgicos.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
No tenemos nada que revelar.
Acknowledgments
Este trabajo fue financiado por los Institutos Nacionales de Salud de subvención R01DK080971 y la Fundación de Investigación de Diabetes Juvenil subvención 37-2009-44. También agradecemos el apoyo recibido del Centro de Investigación de Diabetes Pediátrica UCSD (PDRC).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| pcDNA 3.3 vector/backbone | Invitrogen | K830001 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 18324012 | |
| DMEM | Mediatech | 45001-312 | |
| Pen/strep solution | Mediatech | 45001-652-1 | |
| Amphotericin B | Mediatech | 45001-808-1/30 | |
| RPMI-1640 | Mediatech | 45001-404 | |
| D-PBS | Mediatech | 45001-434 | |
| Sodium Pyruvate | Mediatech | 45001-710-1 | |
| 2-Mercapt–thanol | Invitrogen | 21985023 | |
| Cell stripper | Mediatech | 45000-668 | |
| T75 Flask | BD | 1368065 | |
| 16% Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 50980487 | |
| 10x PBS | Mediatech | 45001-130 | |
| Fetal bovine serum | Mediatech | MT35010CV | |
| IBMX | Sigma | I5879-100MG | |
| RIPA lysis buffer | Sigma | R0278 |
References
- Kelly, C., McClenaghan, N. H., Flatt, P. R. Role of islet structure and cellular interactions in the control of insulin secretion. Islets. 3, 41-47 (2011).
- Konstantinova, I., et al. EphA-Ephrin-A-mediated beta cell communication regulates insulin secretion from pancreatic islets. Cell. 129, 359-370 (2007).
- Jain, R., Lammert, E.
- Poitout, V., Olson, L. K., Robertson, R. P. Insulin-secreting cell lines: classification, characteristics and potential applications. Diabetes Metab. 22, 7-14 (1996).
- Craig, A. M., Graf, E. R., Linhoff, M. W. How to build a central synapse: clues from cell culture. Trends in Neurosciences. 29, 8-20 (2006).
- Scheiffele, P., Fan, J., Choih, J., Fetter, R., Serafini, T. Neuroligin expressed in nonneuronal cells triggers presynaptic development in contacting axons. Cell. 101, 657-669 (2000).
- Abderrahmani, A., et al. Neuronal traits are required for glucose-induced insulin secretion. FEBS Lett. 565, 133-138 (2004).
- Lowe, A. W., Madeddu, L., Kelly, R. B. Endocrine secretory granules and neuronal synaptic vesicles have three integral membrane proteins in common. The Journal of Cell Biology. 106, 51-59 (1988).
- Suckow, A. T., et al. Expression of neurexin, neuroligin, and their cytoplasmic binding partners in the pancreatic beta-cells and the involvement of neuroligin in insulin secretion. Endocrinology. 149, 6006-6017 (2008).
- Suckow, A. T., et al. Transcellular neuroligin-2 interactions enhance insulin secretion and are integral to pancreatic beta cell function. The Journal of Biological Chemistry. 287, 19816-19826 (2012).
- Kohnert, K. D., Hehmke, B. Preparation of suspensions of pancreatic islet cells: a comparison of methods. J. Biochem. Biophys. Methods. 12, 81-88 (1986).
- Qi, M., et al. Human pancreatic islet isolation: Part I: digestion and collection of pancreatic tissue. J. Vis. Exp. (27), e1125 (2009).
- Qi, M., et al. Human pancreatic islet isolation: Part II: purification and culture of human islets. J. Vis. Exp. (27), e1343 (2009).
- Szot, G. L., Koudria, P., Bluestone, J. A.
- Zmuda, E. J., Powell, C. A., Hai, T. A method for murine islet isolation and subcapsular kidney transplantation. J. Vis. Exp. (50), e2096 (2011).
- Hauge-Evans, A. C., Squires, P. E., Persaud, S. J., Jones, P. M. Pancreatic beta-cell-to-beta-cell interactions are required for integrated responses to nutrient stimuli: enhanced Ca2+ and insulin secretory responses of MIN6 pseudoislets. Diabetes. 48, 1402-1408 (1999).
- Spiess, Y., Smith, M. A., Vale, W. Superfusion of dissociated pancreatic islet cells attached to Cytodex beads. Diabetes. 31, 189-193 (1982).
- Pham, P. L., et al. Transient gene expression in HEK293 cells: peptone addition posttransfection improves recombinant protein synthesis. Biotechnol. Bioeng. 90, 332-344 (2005).
- Thomas, P., Smart, T. G. HEK293 cell line: a vehicle for the expression of recombinant proteins. J. Pharmacol. Toxicol. Methods. 51, 187-200 (2005).
- Maurisse, R., et al. Comparative transfection of DNA into primary and transformed mammalian cells from different lineages. BMC Biotechnol. 10, 9 (2010).
