Summary
Transcellulær protein interaktioner er vigtige determinanter for pancreas beta-celle funktion. Detaljeret her er en metode, tilpasset fra en cokultur model synaptogenesis-for at undersøge, hvordan specifikke transmembrane proteiner påvirker insulinsekretion. Transficerede HEK293 celler udtrykker proteiner af interesse; betaceller behøver ikke at transficeres eller på anden måde direkte foruroliget.
Abstract
Interaktioner mellem celleoverfladeproteiner hjælpe med at koordinere funktionen af naboceller. Bugspytkirtlens beta-celler er grupperet sammen inden pancreasøer og handle på en koordineret måde for at opretholde glukose homøostase. Det bliver mere og mere klart, at samvirket mellem transmembrane proteiner på overfladerne af hosliggende betaceller er vigtige determinanter for beta-celle funktion.
Belysning af roller bestemte transcellulær interaktioner af knockdown, knockout eller overekspression studier i dyrkede betaceller eller in vivo nødvendiggør direkte forstyrrelse af mRNA og proteinekspression, potentielt kan påvirke beta-celle sundhed og / eller funktion på måder, der kan forvirre analyser af følgerne af specifikke interaktioner. Disse tilgange også ændre niveauet af de intracellulære domæner af målrettede proteiner og kan forhindre effekter på grund af interaktioner mellem proteiner i den samme celle membranen at blive visttinguished fra virkningerne af transcellulær interaktioner.
Her en metode til bestemmelse af virkningen af specifikke transcellulær interaktioner på insulinudskillende kapacitet og reaktionsevne af beta-celler er præsenteret. Denne metode anvendes til beta-cellelinier, såsom INS-1-celler, og dissocierede primære betaceller. Den er baseret på cokultur modeller udviklet af neurobiologer, der fandt, at udsættelse af dyrkede neuroner til specifikke neuronale proteiner udtrykt på HEK293 (eller COS) cellelag identificerede proteiner er vigtige for kørsel synapse dannelse. I betragtning af de paralleller mellem sekretoriske maskineri af neuronale synapser og af beta-celler, begrundet vi, at beta-celle funktionelle modning kan være drevet af lignende transcellulær interaktioner. Vi udviklede et system, hvor beta-celler dyrkes på et lag af HEK293 celler, der udtrykker et protein af interesse. I denne model er den beta-cellecytoplasmaen uberørt mens ekstracellulært protein-protein-interactions er manipuleret. Selvom vi fokuserer her primært på studier af glucose-stimuleret insulinsekretion, kan andre processer analyseres, for eksempel, som ændringer i genekspression bestemmes ved immunoblotting eller qPCR.
Introduction
Vi beskriver her en metode til at lette undersøgelser af, hvordan de ekstracellulære domæner af specifikke transmembrane proteiner påvirker insulinsekretion. Metoden sonder effekten af interaktioner af proteinet af interesse med proteiner (eller eventuelt andre molekyler) på pancreas-beta-celle-overflade. Metoden giver mulighed for undersøgelser af, hvordan celle-overflade proteiner udtrykt ved beta-celler eller andre omkringliggende celler (f.eks endotelceller, neuroner, pancreas alpha celler) påvirker beta-celle funktion gennem transcellulær interaktioner (dvs. gennem interaktion med interaktion partnere på overfladen af tilstødende beta-celler).
Den cellulære plasmamembran indeholder en kompleks række af strukturelle og funktionelle proteiner, der tjener som bro til det ekstracellulære miljø. Ved dannelse af transcellulær forbindelser eller efter initiering af plast signaleringsbegivenheder, kan vekselvirkninger mellem celleoverfladeproteiner hjælpe med at koordinere denfunktion af naboceller. Bugspytkirtlens beta-celler er grupperet sammen inden pancreas holme og handle på en koordineret måde for at bevare glucosehomøostase 1.. Som afsløret, for eksempel ved betydningen af ekstracellulære EPHA-ephrinA og neuroligin-2 interaktioner i reguleringen af glucose-stimuleret insulinsekretion, bliver det stadig mere klart, at øget viden om de ekstracellulære interaktioner forekommer mellem proteiner på overfladen af tilstødende betaceller vil være af stor betydning for at opnå en fuld forståelse af insulinsekretion, beta-celle funktionelle modning og vedligeholdelse af glukose homøostase 1-3. Målet den her beskrevne fremgangsmåde er at muliggøre undersøgelser af virkningen på beta-celle funktion transcellulær interaktioner, der involverer specifik transmembrane eller på anden måde-celle-overflade-associerede proteiner. Ved co-dyrkning betaceller med HEK293 celler transficeret med forskellige ekspressionskonstrukter, vurdere virkningerne på beta cellefunktion af forskellige celleoverflade-proteiner eller muterede varianter deraf kan være effektivt probes. Dette opnås uden at transficere betacellerne selv.
Belysning af roller bestemte transcellulær interaktioner af knockdown, knockout eller overekspression studier i dyrkede betaceller eller in vivo nødvendiggør direkte forstyrrelse af beta-celle-mRNA og proteinekspression, potentielt kan påvirke beta-celle sundhed og / eller funktion på måder, der kan forvirre analyser af virkningerne af specifikke ekstracellulære interaktioner. Disse tilgange også ændre niveauet af de intracellulære domæner af målrettede proteiner og endvidere tillader ikke effekter på grund af interaktioner mellem proteiner på eller i den samme celle skal adskilles fra virkningerne af transcellulær interaktioner. Her en metode til bestemmelse af virkningen af specifikke transcellulær interaktioner på insulinudskillende kapacitet og reaktionsevne beta-celler er descrIBED. Denne metode kan anvendes til insulinproducerende beta-cellelinier, såsom INS-1-celler 4, og dissocierede primær gnaver eller humane betaceller. Den er baseret på cokultur modeller udviklet af neurobiologer, der fandt, at udsættelse af dyrkede neuroner til specifikke neuronale proteiner udtrykt på HEK293 (eller COS) cellelag kunne identificere proteiner, der drev synapse dannelse 5,6. I betragtning af de paralleller mellem sekretoriske maskineri af neuronale synapser og af beta-celler, begrundet vi, at beta-celle funktion og funktionel modning kan være drevet af lignende transcellulær interaktioner 7-9. For at undersøge disse interaktioner, udviklede vi det heri beskrevne system, hvor beta-celler er dyrket sammen på et lag af HEK293 celler, der udtrykker et protein af interesse 10.. Dette system tillader beta-cellecytoplasmaen at forblive uberørt mens ekstracellulære protein-protein interaktioner er manipuleret.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1.. Transfektion af HEK293 Layer
- Forbered HEK293 cell medium ved tilsætning til 500 ml flasker af DMEM (med 4,5 g / ml glucose og phenolrødt og uden glutamin): 50 ml FBS, 5 ml 100X penicillin / streptomycin opløsning, 5 ml 100x L-glutamin løsning og 500 pi amphotericin B.
- Plade ud HEK293 celler i en 24-brønds plade ved anvendelse af 0,5 ml HEK293 medier per brønd. Sikre, at cellerne er spredt jævnt over bunden af pladen.
- Når HEK293 celler nå op på 100% konfluens transficere med 0,8 ug plasmid koder proteinet af interesse (indsat i en mammal ekspressionsvektor) og 2 pi Lipofectamine 2000 ifølge de Lipofectamin protokol. Vi har valgt at bruge pcDNA 3.3 backbone konstrueret til ekspression i pattedyrceller.
- Eventuelt efter 6 timers inkubering, udveksling transfektionsaktiviteterne medier beskrevet i lipofectamin protokol med normale HEK293 medier.
- At evaluere ekspressionen af det transficerede protei, kan en delmængde af de transficerede vævsdyrkningsbrønde anvendes til immunofluorescent påvisning af det udtrykte protein eller western blot-analyse af protein-ekspression under anvendelse af standardteknikker.
2.. Valgfri Fiksering af HEK293 celler, der udtrykker Transficeret Protein
Transficerede HEK293 celler kan forsigtigt fastsættes med henblik på at lette cokultur i medier, der kan være skadelige for levende HEK293-celler (f.eks trin 3.9 nedenfor) eller for at tillade en effektiv forberedelse forud for plader til adskillige eksperimenter på én gang (se også Diskussion).
- Gennemføre pilotundersøgelser at bestemme tidsforløbet af ekspression af proteinet i HEK293-celler.
- Efter transfektion af HEK293 cellelag, aspireres mediet fra cellerne på post-transfektion tidspunkt er forbundet med højeste udtryk. Hvis dette sker inden for de første 24 timer, skal du ikke aspireres indtil 24 timer efter transfektion.
- Vask HEK293-celler forsigtigt med D-PBS og derefter tilsættes 500 pi 4% paraformaldehyd (PFA) og inkuberes ved stuetemperatur i 30 minutter. (For at få 4% PFA-løsning, start med 16% opløsning i 1X PBS og fortyndes 1:04 med 1X PBS.)
- Anvendelse af sterilt PBS, vask forsigtigt cellerne 3 gange og inkuberes i PBS O / N ved 4 ° C.
- Vask cellerne 3 gange med sterilt PBS, derefter tilføje PBS og henstår ved 4 ° C indtil tiltrængt (maksimale opbevaringstid kan variere afhængigt udtrykte protein. Vi gemmer HEK293 celler transficeret til at udtrykke neuroligin isoformer i op til 2 uger uden væsentlige ændringer i observerede effekter på insulinsekretion).
3.. Co-dyrkning af INS-1 betaceller med HEK293 Cells
- Forbered INS-1-medier ved tilsætning til 500 ml RPMI 1640 (med glucose og phenolrødt og uden glutamin): 50 ml FBS, 5 ml 100X penicillin / streptomycin, 5 ml 100X L-glutamin opløsning, 5 ml natriumpyruvat, 500 pi amphotericin B, 500 pi beta-mercaptoethanol (dette er næsten identisk medium typisk anvendes til primær islet kultur med undtagelse af tilføjelsen af beta-mercaptoethanol).
- Brug Cell-stripper (eller en anden ikke-enzymatisk celle remover), høst INS-1-celler på ca 70-80% konfluens væk fra bunden af en T75 dyrkningskolbe. Hver kolbe vil give omtrent nok celler i 48 brønde.
- Efter spinning ned celler i centrifugen i 3 minutter ved 1.200 rpm, resuspender i en 50/50 blanding af INS-1 og HEK medier. For en 70-80% sammenflydende kolbe af INS-1-celler, resuspenderes i cirka 25 ml mixed media.
- Hvis du bruger HEK293 celler, der er blevet rettet i paraformaldehyd snarere end levende HEK293 celler resuspendere INS-1-cellerne i 100% INS-1 media snarere end mixed media.
- Ved hjælp af en 10 ml pipette, cellerne fra pelleten løsne at gøre en homogen cellesuspension.
- Aspirer at fjerne mediet på HEK293 celler.
- Ved hjælp af en P1000 pipette forsigtigt tilsættes 500 ul INS-1 cellesuspension på HEK cellelag langs siderne of brønden. Efter hver 6 brønde, skal du bruge en 10 ml pipette for at genfordele INS-1-cellerne igen for at sikre en homogen cellesuspension. Den samlede ordning for cokultur set-up er afbildet i figur 1..
- Inkuberes cellerne i 24-48 timer afhængig af forsøgsprotokollen.
- Hvis mere end 48 hr cokultur periode, skal der bruges valgfri trin i afsnit 2 ovenfor for at løse HEK293 celler.
- Hvis du bruger primære dissocieret gnaver eller menneskelige holme [se f.eks forudgående protokoller i JOVE 11-15] sikre, at et passende medier såsom RPMI med 5 ml pen / strep, 5 ml L-Glut, 0,5 ml amphotericin-B anvendes i stedet for INS-1-medier. Selv om man kan bruge dissocierede øceller i en plade med 24 brønde, i praksis på grund af det store antal øer potentielt behov, anbefales det overvejes at skalering ned til en 48 brønds plade (nødvendiggør færre islet celler per brønd). På en 48 brønds plade, tilsættes cirka 100 holme værd af dissociated celler pr plade til at starte. Afhængigt effekten af dissociation og den anvendte metode, kan færre øer være påkrævet.
4.. Glukose insulinsekretion
- Preincubate celler i 250 pi 2,5 mM glucose i KRB (Krebs-Ringer bicarbonatbuffer) i mindst 1 time. At preincubate fjerne cokultur medium og straks erstatte med KRB. Denne udveksling bør gøres en brønd på et tidspunkt for at minimere eksponeringen af INS-1 celler til miljømæssig ilt. Aspirere med den ene hånd, mens pipettering af lav (2,5 mM) glucose KRB med den anden.
- Exchange præinkubation KRB til 250 pi af enten 2,5 eller 20 mM glucose i KRB-puffer én brønd på en gang.
- Hvis egnet til den specifikke eksperiment, kan yderligere antidiabetika såsom 100 uM IBMX være tilsat for at fremstille en mere robust stimuleret insulin sekretoriske respons. Dissocierede primære ø betaceller i særdeleshed er dårligt reagerer på øget glucosekoncentrationer Alone, så her især tilsætning af IBMX eller andre antidiabetika bør overvejes 16,17.
- Efter 1 time inkubation overføre medier til mikrocentrifugerør og spin 1.500 xg i 5 min.
- Fjern 200 ul af supernatanten og bruge denne til analyse af insulin RIA eller ELISA.
- For at forberede cellelysat, tilsættes 100 ul RIPA cellelyse-buffer (150 mM NaCl, 1,0% IGEPALCA-630 eller Nonidet P-40, 0,5% natriumdeoxycholat, 0,1% SDS, 50 mM Tris, pH 8,0) med proteaseinhibitorer til plade umiddelbart efter fjernelse medier og inkuberes ved 4 ° C i 20 min.
- Spin ned lysat i 15 minutter ved 10.000 xg og fjerne 50 ul af supernatanten til analyse af insulin RIA eller ELISA.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ved anvendelse af fremgangsmåden beskrevet her, har vi testet effekten af forskellige varianter af proteinet neuroligin på insulinsekretion. Dette supplerer vores publicerede arbejder undersøge effekten af neuroligin-2 på beta-celle funktion 10. Figur 2, for eksempel, viser resultater opnået fra coculturing INS-1 betaceller med HEK293 celler transficeret til at udtrykke en neuroligin isoform her benævnt NL- X. Dette forsøg blev designet til at teste den hypotese, at NL-X engagerer sig i transcellulær interaktioner, der øger insulinsekretion. I figur 2A, kan det ses, at ekspression af NL-X forøget basal og stimuleret insulinsekretion ved dyrket sammen INS-1-celler. Fremgangsmåden med transficere HEK293 celler, så de udtrykker NL-X tillader os at vide, at det er det ekstracellulære domæne-som er den region, der vises på HEK293 celleoverfladen og dermed i stand til at komme i berøring med dyrket sammen INS-1-celler, der bringer om observed stigning i sekretion. NL-X ekstracellulære domæne skal interagere med et andet protein (eller måske en anden molekyle) på INS-1 celleoverfladen at forårsage INS-1-celler til at udskille mere insulin. Hvis det ønskes, kan secerneret insulin også udtrykkes som en procent af cellulær insulin indhold, der kan måles efter lysering af cellerne.
I figurerne 2B og 2C, er resultater fra andre typer af analyser anvender cokultur systemet afbildet: specifikt analyser af effekten af transcellulær interaktioner, der involverer neuroligin variant NL-Y på cellulær insulinindholdet på PDX-1 og insulin mRNA niveauer. NL-Y øget insulin indholdet af dyrket sammen INS-1-celler (figur 2B). Yderligere forsøg vil være nødvendigt at afgøre, om dette skyldtes en stigning i mængden af insulin per celle eller på grund af øget INS-1 celleproliferation. I figur 2C blev RNA høstet fra cellenlag og analyseret ved RT-qPCR. Da de HEK293 celler er af human oprindelse, til udskrifter, der kan være til stede i både HEK293 og INS-1-celler, brug af rotte-specifikke PCR primere (INS-1-celler er af rotte oprindelse) sikrer, at kun mRNA INS-1 oprindelse måles. Her kan det ses, at cokultur med NL-Y øget insulin og PDX-1-mRNA-niveauer (normalisering var til 18S RNA). De primere, og metoder, der anvendes til dette RT-qPCR analyse, var tidligere beskrevet 10 online supplement.
Figur 1. Cokultur set-up. HEK293 (HEK) celler tilsættes til 24-brønds vævskulturplader og transficeres derefter. En lys field billede af en repræsentativ HEK293 cellelag vises på det øverste højre. HEK-celler transficeret til at udtrykke en epitop-tagget transmembrant protein. Her immunfluorescensfarvning bruges til at afsløre den transficeredeceller (grøn). Dernæst INS-1-celler tilsættes. Immunfluorescensfarvning for insulin blev udført for at tillade visualisering af dyrket sammen INS-1-celler (rød).
Figur 2. Resultater fra coculturing INS-1 betaceller med HEK293 celler transficeret til at udtrykke de neuroligin proteinvarianter NL-X eller NL-Y (udfyldt, sorte søjler). Kontrol HEK293-celler blev transficeret med de samme plasmidkonstruktioner ændret, så de ikke udtrykkelig protein (hvide søjler). A, insulinsekretion ved dyrket sammen INS-1-celler under lav (2,5 nM) og høj (20 mM) glucose betingelser og også efter stimulering med høj glucose sammen med IBMX. B, INS-1 celle insulin indhold efter cokultur med HEK293 celler, der udtrykker NL-Y. C analyser af insulin og PDX-1 transkriptniveauer ved RT-qPCR hjælp RNA isoleret fra INS-1-celler dyrket sammen med enten HEK293 celler transficeret med NL-Y eller med styring-transfekterede HEK293 celler. (* P <0,05, ** P <0,01, *** p <0,001).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den cokultur her beskrevne metode giver en effektiv måde at bestemme den fysiologiske betydning af specifikke beta-celle-overflade, transmembrane proteiner, og specifikt af deres ekstracellulære domæner. Ved dyrkning af betaceller eller insulinom celler (såsom INS-1-cellerne ansat her) i kontakt med HEK293 celler, som viser et protein af interesse på celleoverfladen, kan man udvikle bestemme virkningerne af ekstracellulære protein-protein interaktioner uden direkte at forstyrre den intracellulære miljø af cellerne. Da proteinerne af interesse udtrykkes ved HEK293-celler vil eventuelle virkninger på β-celle funktion, der kunne medieres af de intracellulære domæner af transficerede proteiner være fraværende og derfor ikke ville komplicere analyse af virkningerne af ekstracellulære interaktioner.
Virkninger på insulinsekretion kan let bestemmes ved at sammenligne sekretion fra beta-celler dyrket sammen med HEK293-cellerudtrykker et protein af interesse til sekretion fra beta-celler dyrket sammen i kontakt med kontrol HEK293-celler. Kontrolorganerne HEK293 celler kan være mock-transficerede eller alternativt transficeret med en variant af den eksperimentelle plasmidkonstruktion muteret til at producere en ikke-funktionel variant af proteinet af interesse. I vores hænder, har begge typer af kontrol, givet samme resultater. Da HEK293 celleoverfladen sagens natur indeholder en lang række proteiner, enten type kontrol tillader funktionen af betaceller i kontakt med mange forskellige celle-overflademolekyler, herunder proteinet af interesse, der skal sammenlignes funktionen af betaceller i kontakt med det samme sæt af celleoverflademolekyler med undtagelse af proteinet af interesse (eller med en muteret version af proteinet af interesse).
INS-1-celler (eller andre beta-celler) tilsættes til de HEK293 lag ved lav tæthed, således at der er minimal eller ingen kontakt af INS-1-celler med andre INS-1 cells. Dette tillader virkningerne af transcellulær vekselvirkninger mellem proteinet af interesse udtrykkes på HEK293 celleoverfladen og proteiner på INS-1 celleoverfladen skal overholdes i fravær af potentielle baggrundsstøj forårsaget af transcellulær interaktioner, der involverer det samme protein udtrykkes endogent på INS -1 celleoverfladen.
Efter transfektion kan HEK293 cellelag forsigtigt fast. Denne valgfri fiksering kan udnyttes til at tillade flere cokultur plader skal forberedes på én gang for efterfølgende tilsætning af betaceller på et senere tidspunkt. Fastsættelse af HEK293 celler ville også være en fordel, hvis der var bekymring for, at HEK293 metabolisme eller sekretionsfunktionen ville eller anden måde forstyrre analysen af beta-celle funktion. Endelig kan fiksering protokollen anvendes til at lette langvarig cokultur eksperimenter. Her, den vigtigste fordel ved hjælp af faste HEK293 celler er, at den optimale dyrkningsmedium til beta-celler kan anvendes snarere end at bruge enmixed media (f.eks se trin 3.3), der er nødvendige for at opretholde dyrket sammen HEK293 og beta-celler samtidig. I længerevarende cokultur eksperimenter, brug af blandede medier, hvilket ikke er optimalt for hverken celletype-kan forringe beta-celle levedygtighed.
HEK293-celler anvendes her, fordi de er meget modtagelige for transfektion: de kan transficeres med høj effektivitet ved hjælp af en række forskellige transfektionsreagenser 18,19. HEK293 er en af to celletyper-sammen med COS-celler - som er rutinemæssigt anvendes i lignende neuronale cokultur systemer 5. Lipofectamine 2000 er et gennemprøvet transfektionsreagens meget almindeligt brugt med HEK293 celler og rutinemæssigt opnå transfektionseffektiviteter (procent af transficeret) større end 95% i publicerede studier 18-20. Andre reagenser kan opnå lignende effektivitetsgevinster af transfektion 19,20. Med vores neuroligin-2 plasmidkonstruktion, er transfektionseffektivitet generelt ~ 80%. AltHough fokuserer vi her på studier af glucose-stimuleret insulinsekretion, andre former for analyse er muligt, for eksempel ved FACS, immunhistokemi, western blotting og / eller, som det ses i figur 2C, qPCR.
Trods et meget nyttigt værktøj til at hjælpe afdække funktionen af bestemte ekstracellulære protein interaktioner, beskrev metoden her, er ikke uden grænser. Fordi beta-cellerne skal være i direkte kontakt med HEK293 cellelag, insulinom cellelinjer, såsom INS-1-celler er særligt velegnet til dette cokultur system 4. Omsætning af resultaterne til primære øceller kræver dispersionen af isolerede øer. Da holmen struktur i sig selv er en integreret korrekt signalering og respons på glukose, bliver stimuleret insulin respons afstumpet i spredte primære betaceller i forhold til intakte holme 1,3,17. På grund transient transfektion ikke resulterer i ensartet ekspression af th e protein hele HEK plænen, når der foretages billeddannelse-baserede (immunhistokemisk) eksperimenter, en metode til at normalisere til protein udtryk niveauer kan være forpligtet til at fortolke resultater. En eksperimentel fremgangsmåde, der drager fordel af denne ikke-ensartet udtryk til at analysere virkningen af det transficerede protein på sekretoriske maskineri dyrket sammen INS-1-celler er afbildet i figur 3 i Suckow et al. 2012 10..
Det skal også bemærkes, at omfanget af kontakten mellem en given beta celle og tilstødende celler, der udtrykker proteinet af interesse er sandsynligvis være mindre i dette system end i intakte øer in vivo, hvor beta-celler kan være omgivet på alle sider af celler ekspression af proteinet. Dette relativt reduceret celle-til-celle kontakt kunne reducere omfanget af ændringer i insulin-sekretion til under, hvad der ville blive tilsidesat, såfremt de relevante transcellulær interaktioner eller anden måde blev fjernet fra indfødte holme.
e_content "> Anvendelse af en klonal population af stabilt-transficerede HEK293 celler snarere end transient transfektion ville resultere i en mere ensartet udtryk og eventuelt forenkle forsøgsopstilling, men ville kræve væsentligt mere up-front tid og kræfter til at generere stabilt- udtrykkende celler. Fremtidige undersøgelser vil fastslå, om ved transfektion to eller flere transmembrane proteiner i HEK293 cellelag kan eventuelle synergieffekter skal overholdes.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Vi har intet at afsløre.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af National Institutes of Health tilskud R01DK080971 og Juvenile Diabetes Research Foundation tilskud 37-2009-44. Vi værdsætter også modtaget støtte fra UCSD Pediatric Diabetes Research Center (PDRC).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| pcDNA 3.3 vector/backbone | Invitrogen | K830001 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 18324012 | |
| DMEM | Mediatech | 45001-312 | |
| Pen/strep solution | Mediatech | 45001-652-1 | |
| Amphotericin B | Mediatech | 45001-808-1/30 | |
| RPMI-1640 | Mediatech | 45001-404 | |
| D-PBS | Mediatech | 45001-434 | |
| Sodium Pyruvate | Mediatech | 45001-710-1 | |
| 2-Mercapt–thanol | Invitrogen | 21985023 | |
| Cell stripper | Mediatech | 45000-668 | |
| T75 Flask | BD | 1368065 | |
| 16% Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 50980487 | |
| 10x PBS | Mediatech | 45001-130 | |
| Fetal bovine serum | Mediatech | MT35010CV | |
| IBMX | Sigma | I5879-100MG | |
| RIPA lysis buffer | Sigma | R0278 |
References
- Kelly, C., McClenaghan, N. H., Flatt, P. R. Role of islet structure and cellular interactions in the control of insulin secretion. Islets. 3, 41-47 (2011).
- Konstantinova, I., et al. EphA-Ephrin-A-mediated beta cell communication regulates insulin secretion from pancreatic islets. Cell. 129, 359-370 (2007).
- Jain, R., Lammert, E. Cell-cell interactions in the endocrine pancreas. Diabetes Obes. Metab. 11, Suppl 4. 159-167 (2009).
- Poitout, V., Olson, L. K., Robertson, R. P. Insulin-secreting cell lines: classification, characteristics and potential applications. Diabetes Metab. 22, 7-14 (1996).
- Craig, A. M., Graf, E. R., Linhoff, M. W. How to build a central synapse: clues from cell culture. Trends in Neurosciences. 29, 8-20 (2006).
- Scheiffele, P., Fan, J., Choih, J., Fetter, R., Serafini, T. Neuroligin expressed in nonneuronal cells triggers presynaptic development in contacting axons. Cell. 101, 657-669 (2000).
- Abderrahmani, A., et al. Neuronal traits are required for glucose-induced insulin secretion. FEBS Lett. 565, 133-138 (2004).
- Lowe, A. W., Madeddu, L., Kelly, R. B. Endocrine secretory granules and neuronal synaptic vesicles have three integral membrane proteins in common. The Journal of Cell Biology. 106, 51-59 (1988).
- Suckow, A. T., et al. Expression of neurexin, neuroligin, and their cytoplasmic binding partners in the pancreatic beta-cells and the involvement of neuroligin in insulin secretion. Endocrinology. 149, 6006-6017 (2008).
- Suckow, A. T., et al. Transcellular neuroligin-2 interactions enhance insulin secretion and are integral to pancreatic beta cell function. The Journal of Biological Chemistry. 287, 19816-19826 (2012).
- Kohnert, K. D., Hehmke, B. Preparation of suspensions of pancreatic islet cells: a comparison of methods. J. Biochem. Biophys. Methods. 12, 81-88 (1986).
- Qi, M., et al. Human pancreatic islet isolation: Part I: digestion and collection of pancreatic tissue. J. Vis. Exp. (27), e1125 (2009).
- Qi, M., et al. Human pancreatic islet isolation: Part II: purification and culture of human islets. J. Vis. Exp. (27), e1343 (2009).
- Szot, G. L., Koudria, P., Bluestone, J. A. Murine pancreatic islet isolation. J. Vis. Exp. (7), e255 (2007).
- Zmuda, E. J., Powell, C. A., Hai, T. A method for murine islet isolation and subcapsular kidney transplantation. J. Vis. Exp. (50), e2096 (2011).
- Hauge-Evans, A. C., Squires, P. E., Persaud, S. J., Jones, P. M. Pancreatic beta-cell-to-beta-cell interactions are required for integrated responses to nutrient stimuli: enhanced Ca2+ and insulin secretory responses of MIN6 pseudoislets. Diabetes. 48, 1402-1408 (1999).
- Spiess, Y., Smith, M. A., Vale, W. Superfusion of dissociated pancreatic islet cells attached to Cytodex beads. Diabetes. 31, 189-193 (1982).
- Pham, P. L., et al. Transient gene expression in HEK293 cells: peptone addition posttransfection improves recombinant protein synthesis. Biotechnol. Bioeng. 90, 332-344 (2005).
- Thomas, P., Smart, T. G. HEK293 cell line: a vehicle for the expression of recombinant proteins. J. Pharmacol. Toxicol. Methods. 51, 187-200 (2005).
- Maurisse, R., et al. Comparative transfection of DNA into primary and transformed mammalian cells from different lineages. BMC Biotechnol. 10, 9 (2010).
