שיטה פשוטה מתוארת לאינדוקציה של אפיתל למעבר mesenchymal (EMT) במגוון רחב של סוגי תאים. שיטות לניתוח של תאים במדינות EMT ידי immunocytochemistry כלולים.
אפיתל למעבר mesenchymal (EMT) הוא חיוני להמורפוגנזה הנאותה במהלך פיתוח. ויסות לא תקין של תהליך זה הייתה מעורב כאירוע מפתח בסיסטיק ואת ההתקדמות של קרצינומות למצב גרורתי. הבנת התהליכים שבבסיס EMT היא הכרחית לאבחון המוקדם ובקרה קלינית של מדינות מחלה אלה. אינדוקציה אמינה של EMT במבחנה היא כלי שימושי לגילוי סמים, כמו גם לזהות חתימות ביטוי גנים משותפות למטרות אבחון. כאן אנו מדגימים שיטה פשוטה לאינדוקציה של EMT במגוון רחב של סוגי תאים. שיטות לניתוח של תאים לפני ואינדוקצית ההודעה EMT-ידי immunocytochemistry כלולים גם כן. בנוסף, אנחנו מדגימים את האפקטיביות של שיטה זו דרך ניתוח מערך המבוסס על נוגדן ומבחני הגירה / פלישה.
אפיתל למעבר mesenchymal (EMT) הוא התהליך שבו תאי אפיתל מקוטבים עוברים מגוון רחב של שינויים וכתוצאה מכך תא mesenchymal ניעתי מאוד, כמו פיברובלסטים. תהליך זה מתרחש, בין שאר, באמצעות שינויי ביטוי גנים והשפלה של צמתים adherens, וכתוצאה מכך יכולת מוגברת להגר ולפלוש. מבחינה פיזיולוגית, EMT משחק תפקידים חשובים במהלך התפתחות עוברית וריפוי פצעים. אובדן השליטה נאותה על EMT יכול להוביל לסיסטיק וגרורות של קרצינומה של 1,2.
הירידה של E-cadherin על פני השטח של תאי האפיתל היא שלב קריטי בהתקדמות של תא דרך EMT 3,4. E-cadherin הוא חלבון הטרנסממברני אחת לעבור ישירות אינטראקציה עם חלבוני cadherin על תאים סמוכים. בנוסף לתפקידה בהידבקות תא, תא השפעות E-cadherin איתות באמצעות אינטראקציות בין זנב cytoplasmic של E-cadherinמגוון da של חלבונים רגולטוריים, בעיקר β-catenin. β-catenin משחק תפקיד בייצוב של צמתים adherens. במהלך איתות Wnt הקנונית, β-catenin הוא שוחרר מבית E-cadherin וtranslocated לגרעין שבו היא פועלת כגורם שעתוק במורד הזרם במסלול Wnt 3,4,5. בגרעין, β-catenin הוכח להגדיל את השעתוק של מספר גורמים הקשורים לEMT כולל טוויסט, Slug, פיברונקטין, וכן מגוון של metalloproteases מטריקס 3,6.
בנוסף לWnts, איתות TGF-β הוכח לשחק תפקיד משמעותי באינדוקצית EMT הן במהלך התפתחות נורמלית ובמדינות חולות 7,8,9. TGF-β הוא מעורב בEMT המתרחש במהלך היווצרות חיך ובלב פיתוח 10. הוא גם היה מעורב בסיסטיק ובהתקדמות סרטן לגרורות 7.
ההליך המתואר כאן יחסי הציבורovides אינדוקציה עקבית של EMT במגוון רחב של סוגי תאים ללא הצורך במניפולציה גנטית. הליך זה משתמש בקוקטייל של E-cadherin, sFRP-1, וDKK-1 נוגדני חסימה וWnt-5A וחלבונים רקומביננטיים TGF-β1. קוקטייל זה נועד לחסום מבוסס-cadherin E הידבקות תוך שיפור Wnt ואיתות TGF-β. היכולת לזירוז EMT חזק היא קריטית להבנת הביולוגיה של תהליך זה וכיצד לתפעל אותו למטרות טיפוליות. סמנים נפוצים הנוכחיים של EMT, E-cadherin (downregulated בEMT) וvimentin (שהוגברו בEMT), ניתן למצוא בשיתוף מתבטא בסוגי סרטן ובכך לא מספקים סמני האבחון הטובים ביותר של תאים גרורתי פוטנציאל 12. חשוב מכך, הניתוח של מגוון רחב של סוגי התאים שעברו EMT שימושי לפתח חתימות ביטוי נפוצות גן שיכול לשמש למטרות אבחון בסרטן וסיסטיק 11. בנוסף, מחקרים שנעשו לאחרונה הראו כי EMT עשוי לשחק תפקיד בהיווצרות של תאי גזע סרטניים, מה שמרמז שתאים שעברו EMT עשויים להיות שימושיים עבור הקרנת סמים כדי לזהות תרכובות שיכולות למקד תאים אלה 13.
שיטות קודמות לזירוז EMT השתמשו בדרך כלל גירוי TGF-β או הנדסה גנטית. למרות TGF-β לבד הוכח לגרום EMT בכמה סוגי תאים, זה עתה הוכיח כי TGF-β הוא הכרחי לEMT, אבל זה לא מספיק בכל סוגי התאים 6,14. שימוש בהנדסה גנטית לזירוז EMT היא זמן רב ועבודה אינטנסיבית. השיטה המתוארת כאן משתמשת בשילוב של גורמים, לרבות, E-cadherin אנטי אנושי, sFRP-1 אנטי אנושי, DKK-1 אנטי אנושי, Wnt-5A האנושי רקומביננטי, וTGF-β1 אנושיים רקומביננטי לגרום EMT באופן מהימן. זה שילוב של גורמים נועד לחסום הידבקות E-מבוססת cadherin, שלב קריטי לזירוז EMT 4, ולשפר את האיתות של Wnt על ידי הוספת חלבון Wnt-5A, כמו גם באמצעות נוגדני חסימה למעכבי Wnt, sFRP-1 וDKK -1. Wnt ואיתות TGF-β הוכחו לפעול בלולאת autocrine כדי לגרום ולשמור על Stat תא mesenchymalדואר 6. שיטת אינדוקציה זה תמנע מניפולציה גנטית והוא יעיל יותר מאשר השימוש בTGF-β לבד. חשוב מכך, אנו מסוגלים להתבונן אינדוקציה של EMT בסוגי תאים, כולל MCF7 וPANC-1 תאים, שהוכח בעבר שלא להגיב אך ורק לגירוי TGF-β (איור 5) 14.
תאים שטופלו עם מופע מוסף EMT התרמת מדיה מורפולוגיה ציר בצורת פחות קומפקטית ומוגברת (איור 1). בנוסף, יש ירידה במקביל ביטוי E-cadherin משטח עם עלייה בביטוי פיברונקטין, שהם מסימני ההיכר של EMT (איורים 2 ו -3). סמני mesenchymal נוספים כגון vimentin וחילזון גם הוגברו בתאים המושרה EMT בהשוואה לקבוצת ביקורת uninduced (איור 4). יכולות הגירה ופלישה מוגברות הם המאפיינים הפונקציונליים העיקריים של תאי mesenchymal. במבחנה </em> מבחני הגירה ופלישה, תאים שטופלו במוסף EMT התרמת מדיה הפגינו יכולת מוגברת באופן משמעותי להגר ולפלוש (איור 6).
זו שיטה פשוטה לזירוז EMT שימושית ללימוד איתות EMT כפי שהודגם באמצעות נתונים ביטוי מערך נוגדנים שמוצגים באיור 7. ניתן להשוות סוגי תאים שונים לפני ואינדוקצית ההודעה EMT-להשיג חתימות נפוצות ביטוי הקשורים EMT, כגון העלייה בCREB פוספורילציה וERK1 / 2 ראו בשני MCF7 ותאים מושרה-EMT A549. זירחון S133 של CREB מגרה DNA המחייב והוכח לפעול במורד הזרם של TGF-מושרה β1 EMT 15. ERK1 / 2 זירחון כן הוכח לפעול במורד הזרם של TGF-מושרה β1 EMT 16. הבדלים במסלולי איתות בין סוגי תאים יכולים גם להיות הובהר כפי שניתן לראות עם העלייה בזירחון GSK-3β בתאי A549 לעומת p70S6זירחון K בMCF7. זירחון GSK-3β בסרין 9 מקטין אותו לתפקד, וGSK-3β הוכח לעכב את גורם השעתוק פרו-EMT, חילזון 17. לעומת זאת, p70S6K גורם פעילות החילזון וזירחון שלו קשור בהפעלתו של חלבון זה 18.
בסך הכל, אינדוקציה פשוטה ואמינה של EMT, במיוחד בתאים הראו בעבר שלא להגיב אך ורק לTGF-β, היא שימושית להבנת הביולוגיה של EMT, זיהוי חתימות ביטוי נפוצות לשימוש כסמנים פרוגנוסטיים, ובפיתוח והערכה של תרופות חדשניות לסרטן ומחלה fibrotic.
The authors have nothing to disclose.
המחברים רוצים להכיר ג'וליה Hatler ומרטין צוקים (R & D מערכות) לדיון מועיל וביקורת כתב יד.
Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
Epithelial cells of interest | We have tested: A431, A549, HT29, T98G, MCF10A, MCF7, and PANC1 | ||
EMT Inducing Media Supplement | R & D Systems | CCM017 | |
Recombinant Human TGF-β1 | R & D Systems | 240-B | Used at 10ng/ml |
Anti-E-Cadherin NL557 conjugated antibody | R & D Systems | NL648R | Used at a 1:10 dilution for immunocytochemistry |
Anti-E-Cadherin | R & D Systems | MAB1838 | Used at 0.1 μg/ml for western blotting |
Anti-Fibronectin | R & D Systems | MAB1918 | Used at 10 μg/ml for immunocytochemistry; Used at 0.5 μg/ml for western blotting |
Anti-GAPDH | R & D Systems | AF5718 | Used at 0.2 μg/ml for western blotting |
Goat Anti-Mouse NL493 Secondary Antibody | R & D Systems | NL009 | Used at a 1:200 dilution for immunocytochemistry |
Donkey Anti-Goat HRP Secondary Antibody | R & D Systems | HAF109 | Used at 1:2000 for western blotting |
Goat Anti-Mouse HRP Secondary Antibody | R & D Systems | HAF007 | Used at 1:2000 for western blotting |
EMT 3-Color Immunocytochemistry Kit | R & D Systems | SC026 | Used according to the manufacturer’s instructions. This kit contains directly conjugated antibodies against E-cadherin, Vimentin, and Snail. |
96 Well BME Cell Invasion Assay | R & D Systems | 3455-096-K | This kit was used according to the manufacturer’s recommendations. |
Proteome Profiler Human Phospho-MAPK Array Kit | R & D Systems | ARY002B | This kit was used according to the manufacturer’s recommendations19. |
Mounting Media | R & D Systems | CTS011 | |
0.4% Trypan Blue Solution | Life Technologies | 15350-061 | |
1X Phosphate Buffered Saline (PBS) | |||
95% Ethanol | |||
Bovine Serum Albumin | Sigma | A3311 | |
Normal Donkey Serum | Jackson Labs | 017-000-121 | |
Triton-X-100 | Roche Molecular Biochemicals | 789-704 | Dilute in 1X PBS to make a 10% stock solution |
Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | Dilute in 1X PBS to a 4% working concentration. |
DAPI Solution | Sigma | D9542 | Make stock solution at 14.3mM by dissolving in water. Working solution is a 1:5000 dilution of the stock solution in 1X PBS. |
Fine pointed curved forceps | Thermo-Fisher Scientific | 08-875 | |
12 mm coverslips | Carolina Biological | 633009 | |
Nonfat dry milk | Used at 5% in TBST for blocking in western blotting | ||
TBST [25mM Tris, pH 7.4, 0.15M NaCl, 0.1% Tween 20] | For western blotting blocking and washing | ||
PVDF Membrane | For western blotting | ||
4-20% SDS-page gel | For western blotting | ||
ECL substrate | For western blotting | ||
15 ml conical tubes | |||
Plates/flasks, tissue culture treated | |||
24-well plates, tissue culture treated | |||
Pipettes / pipette tips | |||
Pipet Aid / pipets | |||
Hemocytometer | |||
37 °C Water Bath | |||
37 °C/5%CO2 Incubator | |||
Centrifuge | |||
Inverted light microscope | |||
Fluorescence microscope |