Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

מדידת התכונות המכאניות של תאי חיים באמצעות מיקרוסקופ כוח אטומי

Published: June 27, 2013 doi: 10.3791/50497
Automatic Translation
1, 1, 2, 1
1Department of Physics, Worcester Polytechnic Institute, 2Department of Chemical Engineering, Worcester Polytechnic Institute

Summary

מסמך זה מדגים פרוטוקול כדי לאפיין את התכונות מכאניות של תאי חיים באמצעות microindentation באמצעות מיקרוסקופ כוח אטומי (AFM).

Abstract

תכונות מכאניות של תאים ומטריצה ​​תאית (ECM) ממלאות תפקידים חשובים בתהליכים ביולוגיים רבים, כולל בידול בתאי גזע, היווצרות גידול, וריפוי פצעים. שינויים בקשיחות של תאים וECM הם לעתים קרובות סימנים של שינויים בפיזיולוגיה של תא או מחלות ברקמות. לפיכך, תא קשיחות היא מדד להערכת המצב של תרביות תאים. בין מספר רב של שיטות שיושמו על מנת למדוד את הנוקשות של תאים ורקמות, מיקרו כניסה באמצעות מיקרוסקופ כוח אטומי (AFM) מספקת דרך למדוד את הנוקשות של תאי חיים באופן מהימן. שיטה זו כבר מיושמת באופן נרחב כדי לאפיין את הנוקשות בקנה מידה מייקר עבור מגוון רחב של חומרים, החל ממשטחי מתכת לרקמות רכות ותאים ביולוגיים. העיקרון הבסיסי של שיטה זו הוא לכניסה לתא עם קצה AFM של גיאומטריה נבחרה ולמדוד את הכח המופעל מהכיפוף של שלוחה AFM. התאמת עקומת כוח הכניסה למצב הרץl לגיאומטרית הקצה המקביל יכול לתת מדידות כמותיות של חומר קשיח. מסמך זה מדגים את ההליך כדי לאפיין את הנוקשות של תאי חיים באמצעות AFM. צעדים מרכזיים, כולל תהליך של כיול AFM, רכישת כוח עקומה, וניתוח נתונים באמצעות שגרת MATLAB הם הפגינו. מגבלות של שיטה זו הם דנו גם.

Introduction

תכונות מכאניות, במיוחד נוקשות, של תאים בודדים ומטריצות תאי המקיפות (ECM) הן קריטיות לתהליכים ביולוגיים רבים, כולל צמיחת תאים, תנועתיות, חלוקה, התמיינות, והומאוסטזיס רקמות. 1 זה כבר הוכיח כי נוקשות מכאני תא נקבעת בעיקר על ידי cytoskeleton, במיוחד את הרשתות של אקטין וסיבי ביניים וחלבונים אחרים הקשורים בהם. 2 תוצאות של בדיקות מכאניות ברשתות במבחנה של אקטין וסיבי ביניים מראות כי את המכניקה של התאים תלויה במידה רבה את מבנה cytoskeletal והמתח טרום ב שלד התא. 3-5 נוקשות של תאי חיים אז הוא נחשב למדד כדי להעריך את מבנה cytoskeletal 6, 7 פעילות שרירן ורב תהליכים תאיים אחרים. יותר מכך, שינויים בתכונות מכאניות של תאים מצויים גם לעתים קרובות להיות associ מקרובated עם תנאי מחלה שונים, כגון היווצרות גרורה סרטניים 8-10 ניטור הנוקשות מכאנית של תאי חיים ולכן יכולות לספק דרך חדשנית לניטור פיזיולוגיה תא;. לזהות ולאבחן מחלות 8;. וכדי להעריך את היעילות של טיפולים תרופתיים 11 , 12

שיטות מרובות, כולל microrheology חלקיק מעקב, 13-16 cytometry פיתול מגנטית, 17 שאיפת micropipette 18,19 וmicroindentation 20-22 פותחו כדי למדוד את האלסטיות של תאים. microrheology מעקב אחר החלקיקים משרטטת את תנודות התרמיות של חלקיקים או ניאון submicron הזריקו לתוך תאים או סמני fiducial בתוך שלד תא התא. 23 תכונות אלסטיות וצמיגות של תאים מחושבות מהתקות החלקיקים נמדדו באמצעות משפט תנודות-פיזור. 14,23 שיטה זו מאפשרת מדידות בו זמניות של מקומיתכונות מכאניות עם רזולוציה מרחבית גבוהה במקומות שונים בתא. עם זאת, הזרקת חלקיקי ניאון לתאים עלולה לגרום לשינויים בתפקוד תא, מבנה שלד תא, ומכאן מכניקה הסלולרי. שיטת שאיפת micropipette חלה לחץ שלילי בmicropipette בקוטר הנע בין 1 ל -5 מיקרומטר למצוץ חתיכה קטנה של קרום תא לתוך פיפטה. תא נוקשות מחושבת מהלחץ השלילי מיושם ועיוות קרום תא. -18 שיטה זו, עם זאת, אינו יכולה לזהות את ההתפלגות הטרוגנית של נוקשות על פני התא. cytometry פיתול המגנטית (MTC) חלה שדה מגנטי כדי ליצור מומנט בחרוזים פאראמגנטיים סופר מחובר לקרום התא. סלולרי 17 נוקשות נגזרה בשיטה זו ממערכת היחסים בין המומנט מיושם ועיוות הפיתול של קרום התא. זה קשה לשלוט על המיקום של חרוזים מגנטיים בשיטת MTC, וזה גם challenging לאפיין את העיוות מתפתלת עם רזולוציה גבוהה. Microindentation חל indenter עם גיאומטריה מוגדרת היטב לאגרוף לתוך התא. כוח indenting והכניסה וכתוצאה מכך תאים לעתים קרובות לעקוב חיזוי של מודל הרץ. moduli של יאנג של תאים ניתן לחשב את עקומות כוח ההזחה על ידי התאמתן למודל הרץ. שיטה זו כבר מיושמת באופן נרחב כדי לבחון את התכונות מכאניות של רקמות ותאים, למרות המגבלות שלה, כגון חוסר ודאות בקביעת קשר נקודה, תחולתו של מודל הרץ, ואת הפוטנציאל לפגיעה פיזית בתאים. בין התקנים רבים לmicroindentaion 20, מיקרוסקופ כוח האטומי (AFM) הוא זמין באופן מסחרי וכבר מיושם באופן נרחב לאפיון תכונות מכאניות של תאי חיים ורקמות 21,24-27.

מסמך זה מדגים את ההליך של שימוש מקלט MFP3D-Bio AFM לאפיין מכניקה סלולרי. AFM לא עלly מספק טופוגרפיה ברזולוציה גבוהה של תאים, אלא גם כבר מיושם באופן נרחב כדי לאפיין את התכונות מכאניות של תאים ורקמות. העיקרון של כניסת AFM מודגם באיור 1. שלוחה AFM גישות תא מכמה מיקרומטרים הנ"ל; יוצרת קשר עם התא; כניסות הסלולריים, כך שסטיית שלוחה מגיעה לנקודת סט שנבחרה מראש, ומתרחקת מהתא. במהלך תהליך זה סטיית שלוחה נרשמת כפונקציה של מיקומו, כפי שמוצגת באיור 1. לפני יצירת קשר עם התא, שלוחה נעה במדיום ללא כל סטייה נראית לעין. כאשר indenting בתא, מתכופפת שלוחה ועליות אותות הסטייה. את cantilevers הוא מודל כקורה אלסטיות, כך שהסטייה שלהם היא פרופורציונלית לכח המופעל על התא. על ידי הגדרת סטיית שלוחה המרבית, את הגודל המרבי של כוח המופעל על המדגם מוגבל, כדי למנוע דamage לתאים. החלק של עקומת כוח מהנקודה לנקודה B באיור 1 ג, שבו כניסות קצה לתוך התא, הוא מתאימים למודל הרץ כדי לחלץ את נוקשות התא.

איור 1
איור 1. איור של microindentation ופרשנות של עקומת כוח AFM. הפנל העליון מראה את התנועה של שלוחה AFM מונעת על ידי סורק piezo. המיקום האנכי של שלוחה ושלוחת z סטיית האות D הוא רשם במהלך התהליך. שלוחה מתחילה מנקודה, כמה מיקרומטרים מעל לתא. בעת שהתקרב לתא, δ כניסת המדגם נשאר אפס עד שהוא מגיע לנקודה ב ', שבו הקצה בא במגע עם התאים. הקואורדינטות של נקודת B בעלילה הן ערכים קריטייםלניתוח נתונים, מסומן על ידי (z 0, ד 0>). מ-B ל-C, את כניסות שלוחה לתוך התא עד שסטיית שלוחה מגיעה לנקודה שנקבעה, אשר מוגדרת להיות היחס בין כוח המרבי indenting ממוקד ומעיין שלוחה המתמיד. ברגע שהאות מגיעה לסטייה מהערך המרבי המוגדר מראש, שלוחה לאחר מכן נסוג מתא לנקודת D, שבו לעתים קרובות להיות משך כלפי מטה בשל הידבקות קצה מדגם, מתנתקת מהתא וחוזר למיקומו הראשוני בדואר. הפנל הימני מדגים את הקשר בין הכניסה וz המוקלט ואות ד. בפנל השמאלי התחתון היא עלילה של עקומת נציג כוח, כניסה המרבית של שלוחה, שקבועות הקפיץ נמדדה להיות 0.07N / מ ', מוגדר להיות 17 ננומטר, כך שהכח המרבי indenting להחיל מדגם הוא 1.2 NN. מקומות מפתח במהלך הכניסה מסומנים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. לכייל קבוע הקפיץ של שלוחה

  1. טען שלוחה לAFM פי הוראות היצרן. יש צורך לנקות את בעל שלוחה עם אתנול לפני כל ניסויים. זה יעזור לצמצם זיהום חיידקים לתרבות במהלך מדידות AFM.
  2. לכייל InvOLS (רגישות מנוף אופטית הופכי). פרמטר זה מתאר את כמות תגובת photodiode (וולט) לננומטר של סטיית שלוחה.
  3. טען שקופית זכוכית נקיות על הבמה המדגם, ולאחר מכן להתקין את ראש AFM ולהתאים את קרן לייזר ויישור על פי הוראות היצרן. לעסוק קצה AFM בשקופית הזכוכית.
  4. עם piezo מסוגר, ליישר מחדש את המראה לקריאת photodiode של -2 V. לבצע מדידת ספקטרוסקופיה כוח עם נקודת הדק (תגובת photodiode המרבי) של 2 V.
  5. עם piezo מסוגר, ליישר מחדש את המראה לקריאת photodiode של -2 ו 'בצע עבורמדידת RCE ספקטרוסקופיה עם נקודת הדק (תגובת photodiode המרבי) של 2 הערה ו ': ערכי המתח כאן הן ספציפיות למקלט AFM. ערך זה צריך להיות מוגדר על פי המפרטים המסופקים על ידי יצרן.
    לאחר רכישת הנתונים יסתיימו, להתקרב לאזור משרד המגע של עקומת כוח. בצע התאמה ליניארית לאזור זה כדי למצוא את השיפוע, אשר יהיה בV / ננומטר. הגומלין של ערך זה מתאר את הרגישות האופטית של אנסמבל שלוחה-photodiode.
  6. לאפס את יישור המראה כדי סטייה החופשית של 0 V.
  7. לכייל את קפיץ שלוחה מתמיד. שיטת תרמית-מנגינה משמשת לקביעה הקבוע הקפיץ של שלוחה 28.
  8. לאחר כיול InvOLS, להעלות את הסורק מבמת המדגם כזה שאין אינטראקציות בין הקצה והמדגם.
  9. להתחיל בלכידת נתונים תרמיים. במהלך תהליך זה, רטט התרמית של הקרן הוא שלוחה Recordeד. התוכנה מנתחת AFM כוח כזה ספקטרום של רטט ועלילותיו בחלון הנתונים תרמיים.
  10. אחרי כמה שניות של רכישת נתונים, לבצע התאמה למגזר נתונים מרוכזים בתדר הנמוך ביותר (תהודה בסיסית) כדי לקבוע השיא קבוע הקפיץ.

2. טעינה לדוגמא

  1. התקן את אבזר מחמם תבשיל על הבמה AFM, אם לא כבר מצויד.
  2. הגדר את הטמפרטורה ל -37 מעלות צלזיוס, ולחכות 20 דקות עד שהמערכת מגיעה לשיווי משקל תרמי יציב.
  3. מניחים את צלחת התרבות על הבמה AFM ולאבטח אותו באמצעות המהדק מסופק עם תנור חימום המנה. חשוב לצמצם את הזמן בין הסרת הצלחת מהחממה ולהניח אותו על הבמה, כדי להימנע מטראומה לתאים. עבור מדידות ארוכות יותר מ -30 דקות, יש להשתמש במדיום עצמאי CO 2 להחליף את מדיום התרבות הנורמלי.
  4. תחול ירידה קטנה של 37 מעלות צלזיוס תרבות בינונית עד קצה tהוא שלוחה AFM, ולהוריד את הראש עד הקצה AFM הוא פשוט שקוע בנוזל.
  5. באמצעות מצלמת CCD העליון הנוף, ליישר מחדש את קרן לייזר בשלוחה (היישור בנוזל יהיה שונה מאשר באוויר, בגלל השינוי במקדם השבירה של המדיום).
  6. לעסוק קצה AFM על אזור נקי של צלחת התרבות.
  7. לבצע כיול של InvOLS כפי שתואר לעיל, לרגישות שלוחה בסביבה הנוזלית.

הערה: א) אם תאים בתרבית על הידרוג, הכיול של InvOLS צריכה להתבצע מראש על המשטח התחתון של מנה תרבות מלאה בתרבות תקשורת סלולרי. בעת מעבר לדגימות תאים, יש תשומת לב מיוחדת שישולם שלא לשנות את יישור קרן לייזר עם שלוחה. ב) יש InvOLS להיות recalibrated כל פעם שיש שינוי ביישור בלייזר. ג) מומלץ גם לקחת InvOLS כממוצע של ערך מכמה עקומות כיול, sאינס כל כיול יוצר InvOLS שונה. הווריאציה בInvOLS היא, לעומת זאת, קטנה בהשוואה לערך הממוצע. לדוגמה, כיול שלוחה Bruker DNP-10 עם אביב קבוע 0.06 N / מ 'במצב נוזלי על ידי 100 פעמים לייצר ערך ממוצע של 66.3 InvOLS ננומטר / V, עם סטיית תקן של רק 0.5 ננומטר / V.

3. איסוף Curves חיל זחה סלולרי

  1. בחר תא לכניסה. בעזרת מיקרוסקופ האופטי, להזיז את הבמה כדי למקם שלוחה מעל התא, כך שקצו ממוקם באזור פרי הגרעינים. התאמה מדויקת של מיקום שלוחה ניתן להשיג זאת על ידי החלת קיזוז לX ו Y סורקים.
    הערה: יש שלוחה AFM שנסוג משטח המדגם תוך הזזת הבמה המדגם כדי לבחור תא היעד. זה מגן על שלוחה מדפיקות במדגם, שכן שטח המדגם לא יכול להיות שטוח.
  2. לעבור לחיל מצב ספקטרוסקופיה. הגדר את הכניסהשיעור לטווח של 1-10 מיקרומטר / sec, נמוך מספיק כדי למנוע תופעות הידרודינמית.
  3. להגדיר את נקודת הדק הסטייה, אשר מגבילה את כוח indenting המרבי, כדי למנוע נזק לתאים. בחר את האפשרות יחסית מפעילה, שתתקן לסחיפה בכל אות הסטייה. כוח מרבי של 2 NN הוא נקודת התחלה טובה עבור רוב הדגימות. ערך זה, עם זאת, צריך להיות מותאם לפי מדגם הנוקשות. לקבלת דוגמיות רכה אמור לשמש ערך נמוך יותר, כדי למנוע כניסה מוגזמת למדגם. לקבלת דוגמיות נוקשות יש להשתמש בערך גבוה כדי ליצור כניסה למדידה.
  4. הגדר את מרחק כוח גדול מספיק כדי להבטיח שהקצה יהיה מנותק לחלוטין מהתא בין מדידות כוח. בדרך כלל, את מרחק כוח מוגדר ב5 מיקרומטר.
  5. פקד AFM לקחת עקומת כוח יחידה.
  6. לאסוף לפחות שלוש עקומות כוח במקומות שונים באזור פרי הגרעינים של כל תא. למרות זאת הוא מועיל לקחת מרוביםעקומות בכל תא לנתונים סטטיסטיים אמינים, לוקחים עקומות כוח רבות מדי עלולות לגרום לשינויים בתא נוקשות עקב לחץ מבדיקת AFM.
  7. כאשר איסוף הנתונים הושלם, למשוך את הקצה, וחזור על שלבים 3.1-3.6 לתאים רבים ככל נדרש לנתונים סטטיסטיים טובים על תא נוקשות בתנאי מדגם מסוים. בדרך כלל, 30 תאים נמדדים עבור כל תנאי.

כדי לאפיין את ההפצה של נוקשות בתוך תא בודד, מצב כוח המפה מוחל. במצב חיל-המפה, להגדיר גודל סריקה כדי לכלול את האזור של עניין; להגדיר רזולוציה מתאימה; להגדיר את הפרמטרים הזחה כמו אלה שנבחרו לעקומות כוח אחידות ויחידות, ואז יהיה AFM סריקה על פני שטח המדגם שנקבע ולקחת את עקומות כוח יחידה בכל פיקסל באזור המדגם.

4. ניתוח נתונים

עקומות כוח שנרשמו מנותחות באמצעות הליך MATLAB מותאם אישית כדי לחשב את נוקשות התא. להלן תיאור קצר של הליך MATLAB:

  1. תכנית MATLAB מזהה את נקודת המגע מרכזת Z0 וD0 (ראה איור 1), תוך שימוש באלגוריתם אימצה משיטה שפורסמה על ידי לין ואח' 29.:
  2. עבור כל נקודת נתונים בעקומת כוח, לבצע התאמה ליניארית של הנתונים מהשמאל לנקודת העניין, ודגם שיתאים לרץ הימני (באמצעות נקודה שנבחרה כנקודה הראשונית של מגע), עד לסט כניסה המרבית (200-300 ננומטר מומלץ).
  3. עבור כל נקודה, לחשב את שגיאת RMS היחסית של שני ההתקפים ולסכם את הערכים הללו.
  4. הנקודה המשיגה את השגיאה הולמת הכוללת מינימאלית שנבחרה היא נקודה הראשונית של קשר.
    הערה: זמן חישוב יכול להיות מופחת על ידי יישום חיפוש זהוב סעיף ולא ליניארי סריקת עקומת כוח כולה.
  5. δ עיוות המדגם וindenting כוח F מחושב כ:
    משוואת 1
  6. התאמת ריבועים פחותה מוחלת כדי להתאים את ה-F לעומת נתוני δ באזור שלאחר הקשר, z ≥ z 0, למודל הרץ כדי לחלץ מודולוס יאנג של, דואר של התא:
    משוואה 2
    , שבו V הוא היחס של פואסון.
    הערה: כאשר δ הוא יותר מ -10% ממדגם העובי (גובה תא), נוקשות התא נמדדו מושפעת קשיחות המצע. העובי של אזור פרי הגרעיני הוא בדרך כלל על הסדר של כמה מיקרומטרים. לכן, רק את 200-300 ננומטר הראשון של ה-F-δ עקומה הוא מתאים למודל הרץ.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

איור 2a מציג שלוש עקומות כוח מייצגות שנלקחו מfibroblasts 3T3 תרבית על משטח פלסטיק, ג'ל polyacrylamide של moduli 3,000 אבא של יאנג ו17,000 אבא, בהתאמה. לאחר זיהוי בזהירות את הנקודות המגע בעקומות, כוח indenting כפונקציה של עיוות תא הוא להתוות איור 2b. תחת כוח בסדר גודל קטן יותר מאשר 0.3 NN, פירמידת כניסות צורת קצה 3 מיקרומטר לתוך תא בתרבית על ג'ל polyacrylamide kPa 3. בניגוד לכך, בכוח יותר מ 1.6 NN הוא נדרש לכניסת 500 ננומטרים לתוך התא גדל על צלחת התרבות רגיל תוך שימוש באותה עצה. זה ברור מהגרף הזה שהתא בתרבית על ג'ל polyacrylamide הרך הוא רך יותר מהתא בתרבית על צלחת culturing הנוקשה. התאמת הקטע הראשון (δ <30 ננומטר) של עקומות כוח δ למודל הרץ נותנת moduli של יאנג משלושת תאים אלה כ10 kPa, 1.2 kPa, ו1.10 kPa, בהתאמה. תאים בculturצלחת דואר הן 100 פעמים נוקשה יותר תאים בתרבית על ג'לי polyacrylamide. סולון et al. דיווחו על תוצאות דומות 25. הם מצאו כי באופן פעיל fibroblasts להקשיח cytoskeletons שלהם כדי להתאים את הנוקשות של מצעים שהם לדבוק. כבר דיווחו סוגי תאים רבים אחרים גם להיות נוקשה כאשר בתרבית על מצעים נוקשה 30.

חשוב לציין כי הכניסה יכולה לגרום לעיוות פלסטיק בתאים, מה שגורם סטיות כמוצג בעקומה הסגולה. בדרך כלל, צריכים להיות מחוץ עקומות כאלה מניתוח הנתונים. עם זאת, עדיין ניתן להשתמש כדי לחשב את עקומת תא נוקשות אם שריטה היא מעבר לטווח של נתונים מתאימים. לדוגמה, שריטה בעקומה הסגולה מתרחשת בכ 400 ננומטר. עקומה זו עדיין יכולה להיות מנותחת על ידי התאמת הנתונים רק עד δ = 30 ננומטר למודל הרץ להניב ערך קשיחות של 1.2 kPa. כמו כן, חשוב להתאים את "נקודה מפעילה" על פי הדואר מדגם נוקשות. לדוגמה, העקומה הכחולה נלקחה מתא רך תרבית על ג'ל polyacrylamide kPa 3. הגדרת נקודת הדק הסטייה היחסית ב5 ננומטר, את כניסות קצה AFM 3 מיקרומטר לתוך התא. כגון כניסה גדולה יש למנוע במדידות הנוקשות הסלולריים, שכן הוא יכול להיקרע קרום התא ולהרוג את התא. גורמים נוספים רבים, כולל שיעור רכישת המהירות ונתוני הקצה ברכישת עקומת כוח יכולים להשפיע על האיכות של עקומות כוח שנרכשו ולכן כתוצאה מהנוקשות של תאים 31. לבצע מדידות אמינות יש צורך להתאים את כל הפרמטרים הללו לרכוש עקומות כוח "נקיות" כמו העקומה האדומה שמוצגת באיור 2 א, שבו יש חלק שלפני ואחרי מגע שטוח חלק הולך וגדל קוי לאחר יצירת קשר.

איור 3 א מציג תמונת הקרינה מפיברובלסטים 3T3 על צלחת תרבית תאים. תא transfected עם GFP vimentin,סוג של סיבי ביניים. AFM Force-מיפוי שבוצע במיקרומטר 80 זה על ידי מיקרומטר אזור 80, עם רזולוציה של 32 פיקסלים 32. מפת נוקשות כתוצאה מוצגת באיור 3. הקשיחות משתנה על פני התא. ו, אזור lamellipodium הוא נוקשה והטרוגנית יותר מאשר באזור פרי הגרעיני המקיף את הגרעין הנוקשה.

איור 2
איור 2. נתוני עקומת כוח ועקומת כוח הכניסה מנותחת.) קבוצה של שלושה נתונים עקום כוח מייצגים נרכשו עבור fibroblasts 3T3 תרבית על זכוכית (אדום), 17 ג'ל kPa polyacrylamide (סגול), ו3 ג'ל polyacrylamide kPa (כחול). את קימוריו יעברו, כך שנקודת המגע (0 z, ד 0) ממוקמת במוצאו (0,0) של הקואורדינטותמערכת. ב) העקומות בכוח הכניסה מחושבת מ) והתאמה של נתוני ההזחה למודל הרץ רק באמצעות 300 ננומטר הראשון של כניסה. הבלעה בב) מראה את טיב התאמה למודל לרץ 300 ננומטר הראשון של כניסה; חוגים הם נתונים ניסיוניים, קווים מייצגים את הנתונים המתאימים. קבוע הקפיץ של שלוחה הוא 0.062 N / מ 'במקרה זה.

איור 3
איור 3. א) תמונה פלואורסצנטי של פיברובלסטים 3T3 transfected עם GFP vimentin. רק חלק של התא שמוצג בתמונה. בר סולם מייצג 20 מיקרומטר. ב) 32 x 32 מפת נוקשות פיקסל של אותו האזור. כל פיקסל מייצג 2.5 מיקרומטר.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

יש שיטת כניסת AFM יתרונות לאפיין תכונות מכאניות של תאי חיים. אם כי פחות רגיש מאשר cytometry המגנטית הפיתול ופינצטה אופטית, שיכול למדוד את הכוחות ברמת piconewton 32, AFM יכול לזהות כוח התנגדות מדוגמאות הנעות בין עשרות Pico-ניוטון למאות ננו ניוטון, דומות לטווח של כוח ש יכול להיות מיושם על תאים באמצעות micropipette 19. מגוון זה של כוח מתאים לצרכים ליצור עיוותים מדידים בכל סוגי תאים 19. הרזולוציה מרחבית הגבוהה הופכת אותו ניתן לאפיין ברמת submicron את heterogeneities ברקמות ותאים בודדים בתוך 33. זה גם מאפשר מדידות תא חיות בזמן אמת. מודלים AFM כמה מיועדים לדגימות ביולוגיות יכולים לפעול בסביבת נוזלים ומצוידים בשלבי מדגם מחוממים, המספקים שליטה מדויקת בטמפרטורה, כך שניתן לשמור על envi פיסיולוגיהתמצאות בסביבה לתאים חיים במהלך המדידות. כניסת AFM יושמה בהצלחה למדידת התכונות מכאניות של מגוון רחב של סוגי תאים, 25,34-36 וכבר נעשתה שימוש נרחב לשינויים בהערכת תכונות מכאניות של תאים הקשורים להתמיינות תאים ובהקשרים חולים שונים. 30,37

צעד חשוב כדי לחשב נוקשות מכוח העיקול הוא זיהוי הנקודה שבה הופך את הטיפ ראשון במגע עם התא. חוסר הוודאות בנקודת מגע יכול להשפיע על מודול אלסטי 31. לקבלת חומרים נוקשים, אות הסטייה מגבירה פתאומיות לאחר מגע קצה המדגם, ונקודת המגע מזוהה בקלות כנקודת מפנה בעקומות. כגון נקודת מפנה חדה, עם זאת, לעתים קרובות אינה מופיעה בכוח עקומות מתאי, בשל קשיחות התא הנמוכה (ראה איור 2). קוד MATLAB מפותח כדי למצוא במדויק את הנקודות המגע בעקומי כוחמדגימות רכות באמצעות האלגוריתם שהוצע על ידי לין ואח'. 29 הקוד יכול להתמודד עם עקומות כוח מהדגימות רכות, המאפשרת לנו להפוך את תהליך ניתוח הנתונים באופן אוטומטי על ידי מחפש את נקודת המגע והולם את נתוני ההזחה למודל הרץ. קוד MATLAB מוחל כדי לקבוע את הנקודות המגע ב60 עקומות כוח שצולמו באותו המקום של ג'ל polyacrylamide, מתוכם הנוקשות היו מידה להיות 7.2 kPa על ידי מדידות rheology בתפזורת. הקוד מזוהה פנה נקודות בעקומות אלה. מגוון רחב של שונות במיקום נקודת מגע הוא קטן יותר מ -15 ננומטר. בהתבסס על נקודות מגע אלו, הנוקשות הממוצעת המחושבת היא 6.9 kPa, סטיית התקן היא 0.2 kPa, והטווח המרבי של 0.6 kPa הווריאציה. תוצאות מניסוי זה לספק מידה להעריך את חוסר הוודאות של הנוקשות נמדדות. חוסר ודאות ננומטר 15 תוצאות בנקודת מגע בחוסר ודאות בנוקשות, שהוא פחות מ -10% של ממוצע valuדואר. לג'לי רך עם רמה נמוכה מאוד של אות סטייה, אי הוודאות בנקודת מגע יכולה להיות גבוהה כמו 30 ננומטר, מה שמוביל לחוסר ודאות בקשיחות גבוהה כמו 30%. הקוד זמין כתוספת למאמר זה.

AFM מהימן יכול למדוד את הנוקשות הנעות בין פחות מ -100 אבא עד 10 6 אבא, המכסות את מגוון של קשיחות עבור רוב הרקמות ותאים. למדידות אמינות, חשוב לבחור את cantilevers AFM עם קבועי קפיץ המתאימים היטב למדגם הנוקשות. כאשר שלוחה היא נוקשה מדי, הסטייה שלה היא קטנה מדי כדי לזהות וזה יכול לגרום נזק לתא, ואם את שלוחתו היא רכה מדי, זה לא יהיה כניסה לתא מספיק כדי להשיג תכונות חומר אמינות ותנודות התרמיות שלה יכולות לשלוט בעקומת כוח. Cantilevers של 0.06 N / M עם קצה פירמידה חלים עבור רוב סוגי תאים בתרבית על מנות התרבות נוקשות. cantilevers אלה, עם זאת, אינם ישימים למדידת תאים בתרבית עלמצעים רכים. כפי שמוצג באיור 2, התא בתרבית על ג'ל 3,000 polyacrylamide אבא הוא כל כך רך שכניסת מיקרומטר 3 נדרש כדי ליצור סטיית ננומטר 5 בשלוחה. עקומת כוח היא כל כך שטוחה שיש הבדל קטן מאוד בין הקשר מראש והאזור שלאחר יצירת קשר. זה מוביל לחוסר ודאות גדולה בנקודת המגע, ולכן הערכים נוקשות הנובעים מכך. באמצעות שלוחה רכה יותר רק במעט משפר את הניגודיות בין האזורים שלאחר התקשרות מראש והמגע. למדידת חומרים רכים כאלה, cantilevers עם קצה כדורי גדול מומלצים. ניתן ליישם שלוחה 0.06 N / מ 'עם קצה כדורי של 10 מיקרומטרים בקוטר למדוד דגימות עם קשיחות נמוכה מ -100 cantilevers אבא עם קצה כדורי זמינים מסחרי מיצרנים רבים. הם יכולים גם להיות מותאמים אישית שנעשה על ידי הדבקת microspheres לcantilevers tipless. את העצות כדוריות לספק אות סטייה גדולה יותר ולמנוע נזק לקרום התא. However, הם אינם ישימים למיפוי נוקשות ברזולוציה גבוהה בשל שטח המגע הגדול שלהם עם התאים. טבלה 1 מספקת רשימה של בדיקות AFM המומלצות למדידות נוקשות סלולריים.

מודל קבוע קפיץ (N / מ ') סוג טיפ רדיוס עצה (ננומטר)
ברוקר DNP10-D 0.06 פירמידה 20
ברוקר MLCT-B/C/E 0.01/0.02/0.03 פירמידה 20
Novascan PT.GS 0.01/0.03/0.06 זכוכית תחום 2,000 / 5,000 / 10,000
Novascan PT.PS 0.01/0.03/0.06 כדור קלקר 1000/4500 / 10,000

טבלת מס '1. Selection של בדיקות AFM עם מתמיד ישימה אביב ובגיאומטרית טיפ לכניסת תא.

המגבלות של השיטה שהוצגה צריכים להיות גם מסומנות. מודל הרץ שיושם כדי להתאים את נתוני ההזחה הוא מודל פשטני. זה מנבא את יחסי כוח הכניסה לחריצים זעירים של חומרים אלסטיים גרידא על ידי Indenters axisymmetric. חלק מההנחות של מודל הרץ אינו חלים על כניסת התא.

המודל מניח הרץ חומר הומוגני וליניארי אלסטי, ואילו תא הוא הטרוגנית (ראה איור 3) וnonlinearly אלסטי. באזור lamellipodium, הוא דווקא הומוגניות עקב המבנה ההטרוגני של cytoskeleton אקטין. נוקשות מכאני של תא היא דיווח כנוקשות ממוצעת מופקים משלוש או יותר עקומות כוח שנרכשו מאזור perinuclear הומוגנית יחסית. 25,36 מחדש networKS של אקטין ונימה הם חומרי ביניים זן-התקשות, כלומר הם נוקשה בעיוותים גדולות יותר. כזו גמישות קוי 38,39 נצפתה לתאים חיים, אך לא היוותה במודל הרץ. כדי להגביל את ההשפעה של האלסטיות ליניארית על נוקשות התא דיווחו, רק 300 ננומטר הראשון של נתוני כניסתו לא יהיה כשיר למודל הרץ.

כמו כן, הנחה הוא במודל הרץ שהחומרים הם אך ורק אלסטי. עם זאת, תאים וcytoskeleton הם חומרי viscoelastic עם נוקשות תלויות בטווח הזמן של מדידות. בקנה מידה של זמן קצר יותר, סטיית שלוחה בעיקר מגיעה מהתגובה אלסטית של תאים. בקנה מידת זמן רב, עם זאת, המדגם מתגנב ונותן מענה רך יותר. בקנה מידה של זמן כניסת AFM נשלט על ידי מהירות קצה. לפיכך, ההבדל שנצפה בתא נוקשות הוא בעל משמעות רק כאשר עקומות כוח נרכשות עם אותו velo הכניסהעיר. כדי לחלץ את viscoelasticity התלוי בתדירות של תאי כמותית, שיטת AFM "כוח האפנון" פותחה על ידי יישום תנודות משרעת קטנות בתדירות גבוהה על כניסה גדולה 21,27.

ההנחה של עובי מדגם אינסופי במודל הרץ אינה חלה על תאים. תאים הם בדרך כלל כמה מיקרומטרים עבים באזור perinuclear, וכמה מאה ננומטרים עבים באזור lamella. תיקונים שנעשו לחשבון לעובי המדגם הסופי. 31,40 נתונים שנרכשו מכוח המיפוי מכילים שני נתונים הזחה ונתוני גובה תא. עובי מדגם מקומי ניתן לחשב את נתוני הגובה. עבודה בעתיד נדרש ליישם את התיקונים בעובי דוגמה ניתוח נתונים למיפוי כוח.

לסיכום, מאמר זה מציג פרוטוקול לאפיין את הנוקשות מכאני של תאי חיים משתמשים MICR כוח אטומי MFP3D-Bio מקלטoscope. את עקרונות הפעלת AFM ואת הליך ניתוח נתוני MATLAB חלים על כל דגמי AFM האחרים. בשנים האחרונות, שיטות מיקרוסקופיה אופטיות, כולל שדה בהיר, מיקרוסקופיה confocal, ומיקרוסקופ פלואורסצנטי סך הכל השתקפות הפנימי (TIRF) כבר בשילוב עם AFM להדמיה בזמן אמת של תאים לגירויים מכאניים. 41,42 מערכים אלה גם מאפשרים מדידות בו זמניות של מכניקה של תאים והדמיה של מרכיבי cytoskeletal. ההתאמה בין נתוני הקשיחות המקומיות להפצה של רכיבי cytoskeletal מקומיים תספק מידע תובנה על איך מרכיבי cytoskeletal לתרום למכניקה סלולרי.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

אין ניגודי האינטרסים הכריזו.

Acknowledgments

המחברים מודים לד"ר פול Janmey באוניברסיטת פנסילבניה למתן קווים סלולריים בשימוש במאמר זה. QW גם להכיר JF Byfield והאוון אנדרסון לדיוני תובנות שלהם על טכניקות AFM.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Atomic Force Microscope Asylum Research MFP3D-BIO

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Discher, D. E., Janmey, P., Wang, Y. L. Tissue cells feel and respond to the stiffness of their substrate. Science. 310, 1139-1143 (2005).
  2. Wagner, O. I., et al. Softness, strength and self-repair in intermediate filament networks. Exp. Cell Res. 313, 2228-2235 (2007).
  3. Wang, N., et al. Mechanical behavior in living cells consistent with the tensegrity model. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98, 7765-7770 (2001).
  4. Wang, N., et al. Cell prestress. I. Stiffness and prestress are closely associated in adherent contractile cells. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 282, 606-616 (2002).
  5. Kasza, K. E., et al. Filamin A is essential for active cell stiffening but not passive stiffening under external force. Biophysical Journal. 96, 4326-4335 (2009).
  6. Elson, E. L. Cellular mechanics as an indicator of cytoskeletal structure and function. Annual Review of Biophysics and Biophysical Chemistry. 17, 397-430 (1988).
  7. Schafer, A., Radmacher, M. Influence of myosin II activity on stiffness of fibroblast cells. Acta Biomaterialia. 1, 273-280 (2005).
  8. Guck, J., et al. Optical deformability as an inherent cell marker for testing malignant transformation and metastatic competence. Biophysical Journal. 88, 3689-3698 (2005).
  9. Cross, S. E., Jin, Y. S., Rao, J., Gimzewski, J. K. Nanomechanical analysis of cells from cancer patients. Nature Nanotechnology. 2, 780-783 (2007).
  10. Plodinec, M., et al. The nanomechanical signature of breast cancer. Nature Nanotechnology. 7, 757-765 (2012).
  11. Rotsch, C., Radmacher, M. Drug-induced changes of cytoskeletal structure and mechanics in fibroblasts: an atomic force microscopy study. Biophysical Journal. 78 (00), 520-535 (2000).
  12. Cross, S. E., Jin, Y. S., Lu, Q. Y., Rao, J., Gimzewski, J. K. Green tea extract selectively targets nanomechanics of live metastatic cancer cells. Nanotechnology. 22, 215101 (2011).
  13. Hoffman, B. D., Crocker, J. C. Cell mechanics: dissecting the physical responses of cells to force. Annual Review of Biomedical Engineering. 11, 259-288 (2009).
  14. Hoffman, B. D., Massiera, G., Van Citters, K. M., Crocker, J. C. The consensus mechanics of cultured mammalian cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103, 10259-10264 (2006).
  15. Lau, A. W., Hoffman, B. D., Davies, A., Crocker, J. C., Lubensky, T. C. Microrheology, stress fluctuations, and active behavior of living cells. Physical Review Letters. 91, 198101 (1981).
  16. Liu, J., et al. Microrheology probes length scale dependent rheology. Physical Review Letters. 96, 118104 (2006).
  17. Deng, L., et al. Fast and slow dynamics of the cytoskeleton. Nature Materials. 5, 636-640 (2006).
  18. Oh, M. J., Kuhr, F., Byfield, F., Levitan, I. Micropipette Aspiration of Substrate-attached Cells to Estimate Cell Stiffness. J. Vis. Exp. (67), e3886 (2012).
  19. Hochmuth, R. M. Micropipette aspiration of living cells. Journal of Biomechanics. 33, 15-22 (2000).
  20. Levental, I., et al. A simple indentation device for measuring micrometer-scale tissue stiffness. J. Phys-Condens. Mat. 22, (2010).
  21. Mahaffy, R. E., Park, S., Gerde, E., Kas, J., Shih, C. K. Quantitative analysis of the viscoelastic properties of thin regions of fibroblasts using atomic force microscopy. Biophysical Journal. 86, 1777-1793 (2004).
  22. Radmacher, M. Measuring the elastic properties of biological samples with the AFM. IEEE Engineering in Medicine and Biology Magazine: The Quarterly Magazine of the Engineering in Medicine & Biology Society. 16, 47-57 (1997).
  23. Crocker, J. C., Hoffman, B. D. Multiple-particle tracking and two-point microrheology in cells. Methods in Cell Biology. 83, 141-178 (2007).
  24. Liu, F., Tschumperlin, D. J. Micro-mechanical characterization of lung tissue using atomic force microscopy. J. Vis. Exp. (54), e2911 (2011).
  25. Solon, J., Levental, I., Sengupta, K., Georges, P. C., Janmey, P. A. Fibroblast adaptation and stiffness matching to soft elastic substrates. Biophysical Journal. 93, 4453-4461 (2007).
  26. Wu, H. W., Kuhn, T., Moy, V. T. Mechanical properties of l929 cells measured by atomic force microscopy: Effects of anticytoskeletal drugs and membrane crosslinking. Scanning. 20, 389-397 (1998).
  27. Radmacher, M., Fritz, M., Kacher, C. M., Cleveland, J. P., Hansma, P. K. Measuring the viscoelastic properties of human platelets with the atomic force microscope. Biophysical Journal. 70, 556-567 (1996).
  28. Levy, R., Maaloum, M. Measuring the spring constant of atomic force microscope cantilevers: thermal fluctuations and other methods. Nanotechnology. 13, 33-37 (2002).
  29. Lin, D. C., Dimitriadis, E. K., Horkay, F. Robust strategies for automated AFM force curve analysis--I. Non-adhesive indentation of soft, inhomogeneous materials. Journal of Biomechanical Engineering. 129, 430-440 (2007).
  30. Davis, J. T., Wen, Q., Janmey, P. A., Otteson, D. C., Foster, W. J. Muller cell expression of genes implicated in proliferative vitreoretinopathy is influenced by substrate elastic modulus. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53, 3014-3019 (2012).
  31. Engler, A. J., Rehfeldt, F., Sen, S., Discher, D. E. Microtissue elasticity: Measurements by atomic force microscopy and its influence on cell differentiation. Method Cell Biol. 83, 521-545 (2007).
  32. Lele, T. P., et al. Tools to study cell mechanics and mechanotransduction. Methods in Cell Biology. 83 (07), 443-472 (2007).
  33. A-Hassan, E., et al. Relative microelastic mapping of living cells by atomic force microscopy. Biophysical Journal. 74, 1564-1578 (1998).
  34. Costa, K. D., Sim, A. J., Yin, F. C. Non-Hertzian approach to analyzing mechanical properties of endothelial cells probed by atomic force microscopy. Journal of Biomechanical Engineering. 128, 176-184 (2006).
  35. Xiong, Y., Lee, A. C., Suter, D. M., Lee, G. U. Topography and nanomechanics of live neuronal growth cones analyzed by atomic force microscopy. Biophysical Journal. 96, 5060-5072 (2009).
  36. Byfield, F. J., et al. Absence of filamin A prevents cells from responding to stiffness gradients on gels coated with collagen but not fibronectin. Biophysical Journal. 96, 5095-5102 (2009).
  37. Cross, S. E., et al. AFM-based analysis of human metastatic cancer cells. Nanotechnology. 19, 384003 (2008).
  38. Storm, C., Pastore, J. J., MacKintosh, F. C., Lubensky, T. C., Janmey, P. A. Nonlinear elasticity in biological gels. Nature. 435, 191-194 (2005).
  39. Wen, Q., Janmey, P. A. Polymer physics of the cytoskeleton. Current Opinion in Solid State & Materials Science. 15, 177-182 (2011).
  40. Dimitriadis, E. K., Horkay, F., Maresca, J., Kachar, B., Chadwick, R. S. Determination of elastic moduli of thin layers of soft material using the atomic force microscope. Biophysical Journal. 82 (02), 2798-2810 (2002).
  41. Trache, A., Lim, S. M. Live cell response to mechanical stimulation studied by integrated optical and atomic force microscopy. J. Vis. Exp. (44), e2072 (2010).
  42. Lim, S. M., Kreipe, B. A., Trzeciakowski, J., Dangott, L., Trache, A. Extracellular matrix effect on RhoA signaling modulation in vascular smooth muscle cells. Exp. Cell Res. 316, 2833-2848 (2010).

Tags

ביופיזיקה גיליון 76 Bioengineering ביולוגיה תאית ביולוגיה מולקולרית פיסיקה הנדסה הכימית ביומכניקה Bioengineering (כללי) AFM תא נוקשות microindentation כוח ספקטרוסקופיה מיקרוסקופ כוח אטומי מיקרוסקופית
מדידת התכונות המכאניות של תאי חיים באמצעות מיקרוסקופ כוח אטומי
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Thomas, G., Burnham, N. A.,… More

Thomas, G., Burnham, N. A., Camesano, T. A., Wen, Q. Measuring the Mechanical Properties of Living Cells Using Atomic Force Microscopy. J. Vis. Exp. (76), e50497, doi:10.3791/50497 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter