Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

قياس الخواص الميكانيكية للخلايا الحية باستخدام المجهر القوة الذرية

Published: June 27, 2013 doi: 10.3791/50497
Automatic Translation
1, 1, 2, 1
1Department of Physics, Worcester Polytechnic Institute, 2Department of Chemical Engineering, Worcester Polytechnic Institute

Summary

يوضح هذه الورقة على بروتوكول لتوصيف الخواص الميكانيكية للخلايا الحية عن طريق microindentation باستخدام مجهر القوة الذرية (AFM).

Abstract

الخواص الميكانيكية للخلايا والمصفوفة خارج الخلية (ECM) تلعب دورا هاما في العديد من العمليات البيولوجية بما في ذلك تمايز الخلايا الجذعية، وتشكيل الورم، والتئام الجروح. التغييرات في تصلب الخلايا وECM غالبا ما تكون علامات تغيرات في علم وظائف الأعضاء أو خلية أمراض في الأنسجة. وبالتالي، وصلابة الخلية هو مؤشر لتقييم الوضع من مزارع الخلايا. من بين العديد من الأساليب التطبيقية لقياس صلابة من الخلايا والأنسجة، والصغرى المسافة البادئة باستخدام مجهر القوة الذرية (AFM) يوفر وسيلة لقياس موثوق صلابة من الخلايا الحية. وقد تم تطبيق هذه الطريقة على نطاق واسع لتوصيف صلابة الصغيرة الحجم لمجموعة متنوعة من المواد تتراوح بين السطوح المعدنية إلى الأنسجة البيولوجية لينة والخلايا. المبدأ الأساسي لهذه الطريقة هو أن المسافة البادئة خلية مع تلميح AFM الهندسة المختارة وقياس القوة المطبقة من الانحناء للناتئ فؤاد. تركيب منحنى قوة المسافة البادئة إلى وضع هيرتزL للهندسة طرف المقابل يمكن أن تعطي قياسات كمية من صلابة المواد. يوضح هذا الإجراء ورقة لتوصيف صلابة من الخلايا الحية باستخدام AFM. وأظهرت الخطوات الرئيسية بما في ذلك عملية AFM المعايرة، واكتساب قوة منحنى، وتحليل البيانات باستخدام MATLAB الروتينية. وتناقش أيضا القيود المفروضة على هذه الطريقة.

Introduction

الخصائص الميكانيكية، خصوصا صلابة، من الخلايا الفردية ومصفوفات المحيطة بهم خارج الخلية (ECM) هي الحاسمة بالنسبة لكثير من العمليات البيولوجية بما في ذلك نمو الخلايا، حركية، وتقسيم، والتمايز، وتوازن الأنسجة. 1 وقد ثبت أن صلابة ميكانيكية الخلية يتحدد أساسا من قبل الهيكل الخلوي، وخصوصا شبكات الأكتين وخيوط الوسيطة وغيرها من البروتينات المرتبطة بها. 2 من نتائج الإختبارات الميكانيكية للشبكات في المختبر من الأكتين وخيوط الوسيطة تشير إلى أن ميكانيكا خلية يعتمد إلى حد كبير على الهيكل هيكل الخلية وقبل الإجهاد في ثم يعتبر الهيكل الخلوي. 3-5 تصلب الخلايا الحية وذلك في مؤشر لتقييم هيكل هيكل الخلية 6، النشاط الميوسين 7 والعديد من العمليات الخلوية الأخرى. الأهم من ذلك، وأيضا كثيرا ما وجدت تغيرات في الخواص الميكانيكية الخلية ليكون associ عن كثبانبعاث العوادم مع الحالات المرضية المختلفة مثل تشكيل الورم والانبثاث 8-10 الرصد وبالتالي يمكن للصلابة الميكانيكية للخلايا الحية توفر وسيلة جديدة لمراقبة فسيولوجيا الخلية؛ لكشف وتشخيص الأمراض 8؛ وتقييم فعالية العلاج بالعقاقير 11 ، 12

وقد تم تطوير طرق متعددة بما في ذلك microrheology الجسيمات تتبع، 13-16 المغناطيسي الخلوي التواء، 17 micropipette تطلع 18،19 وmicroindentation 20-22 لقياس مرونة من الخلايا. الجسيمات تتبع microrheology يتتبع الاهتزازات الحرارية إما جزيئات الفلورسنت submicron حقنها في الخلايا أو علامات إيمانية داخل الهيكل الخلوي الخلية. تحسب 23 خصائص المرونة واللزوجة من الخلايا من التشريد الجسيمات قياسها باستخدام نظرية تقلب تبديد. 14،23 يسمح هذا الأسلوب القياسات في وقت واحد من المحليةالخواص الميكانيكية لقرار مكانية عالية في أماكن مختلفة في خلية. ومع ذلك، حقن جزيئات الفلورسنت في الخلايا قد تؤدي إلى تغييرات في وظيفة الخلوية وبناء الهيكل الخلوي، وبالتالي آليات الخلية. طريقة الرشف micropipette ينطبق الضغط السلبي في micropipette من بقطر يتراوح من 1 إلى 5 ميكرون حتى تمتص قطعة صغيرة من غشاء الخلية في ماصة. يتم احتساب صلابة خلية من الضغط السلبي التطبيقية وغشاء الخلية تشوه. 18 هذا الأسلوب، ومع ذلك، لا يمكن الكشف عن التوزيع غير متجانسة من صلابة عبر الخلية. الخلوي التواء المغناطيسي (MTC) ينطبق المجال المغناطيسي لتوليد عزم الدوران على الخرز ممغطس السوبر تعلق على غشاء الخلية. مشتق 17 صلابة الخليوي في هذا الأسلوب من العلاقة بين عزم الدوران التطبيقية وتشوه التواء من غشاء الخلية. فمن الصعب السيطرة على الموقع من الخرز المغناطيسي في طريقة MTC، وأنه هو أيضا challengiنانوغرام لتوصيف تشوه التواء مع ارتفاع القرار. Microindentation ينطبق على إندينتر مع هندسة واضحة المعالم لكمة في الخلية. قوة الطعج والمسافة البادئة الناتجة في الخلايا غالبا ما تتبع التنبؤ للنموذج هيرتز. ويمكن حساب معاملات الرجوعية الشباب من الخلايا من منحنيات قوة المسافة البادئة من المناسب لهم لنموذج هيرتز. وقد تم تطبيق هذه الطريقة على نطاق واسع لاختبار الخواص الميكانيكية للأنسجة وخلايا رغم من حدودها مثل عدم اليقين في تحديد نقطة الاتصال، انطباق نموذج هيرتز، والقدرة على الإضرار بدنيا الخلايا. من بين العديد من الأجهزة لmicroindentaion 20، مجهر القوة الذرية (AFM) متاحة تجاريا وأنها طبقت على نطاق واسع لتوصيف الخواص الميكانيكية للخلايا الحية والأنسجة 21،24-27.

يوضح هذا الإجراء من ورقة باستخدام اللجوء MFP3D بيو AFM لتوصيف ميكانيكا الخلية. AFM ليس علىيوفر لاي تضاريس عالية الدقة من الخلايا ولكن أيضا تم تطبيقه على نطاق واسع لتوصيف الخواص الميكانيكية للخلايا الأنسجة. ويتضح مبدأ AFM المسافة البادئة في الشكل 1. ناتئ AFM تقترب الخلية من بضعة ميكرومتر أعلاه؛ يجعل الاتصال مع الخلية؛ المسافات البادئة الخلية بحيث انحراف ناتئ تصل إلى نقطة مجموعة انتقاؤه، وتسحب بعيدا عن الخلية. أثناء هذه العملية يتم تسجيل انحراف ناتئ بوصفها وظيفة من موقعه كما هو مبين في الشكل 1. قبل إجراء الاتصال مع الخلية، ينتقل ناتئ في الوسط دون أي انحراف واضح. عندما الطعج على الخلية، والانحناءات ناتئ والزيادات إشارة انحراف. وعلى غرار الكابولي كما الحزمة مرنة بحيث انحراف بهم يتناسب مع القوة المطبقة على الخلية. عن طريق تحديد الحد الأقصى للانحراف ناتئ، والحد الأقصى لحجم القوة المطبقة على عينة محدودة لتجنب Damage إلى الخلايا. جزء من منحنى القوة من نقطة إلى نقطة ب ج في الشكل 1، حيث المسافات البادئة طرف في الخلية، ولا يصلح لنموذج هيرتز لاستخراج صلابة الخلية.

الشكل 1
الشكل 1. التوضيح من AFM microindentation وتفسير منحنى القوة. لوحة العلوي يظهر حركة AFM ناتئ مدفوعا الماسح الضوئي بيزو. يتم تسجيل موقع العمودي ناتئ Z وناتئ انحراف إشارة د أثناء العملية. يبدأ ناتئ من النقطة (أ)، وعدد قليل ميكرومتر أعلى الخلية. بينما تقترب الخلية، يبقى δ المسافة البادئة عينة الصفر حتى يصل إلى نقطة (ب)، حيث يأتي في اتصال مع طرف الخلية. إحداثيات النقطة (ب) في المؤامرة هي القيم الحرجةلتحليل البيانات، يشار إليه ب (Z 0، د 0>). من B إلى C، البادئة ناتئ في الخلية حتى انحراف ناتئ تصل إلى نقطة المجموعة، والتي من المقرر أن تكون النسبة بين الحد الأقصى الطعج القوة المستهدفة والربيع ناتئ المستمر. مرة واحدة في إشارة انحراف تصل القيمة القصوى محددة مسبقا، ثم يتم سحب ناتئ من الخلية إلى نقطة التطوير، حيث أنه غالبا ما يتم سحبها إلى الأسفل بسبب التصاق بلاغ عينة، يفصل من الخلية ويعود إلى المكان الأولي في البريد. يوضح اللوحة اليمنى العلاقة بين المسافة البادئة وZ المسجلة وإشارة د. في على اللوحة اليسرى السفلى هو مؤامرة من منحنى ممثل القوة، والحد الأقصى المسافة البادئة من ناتئ، من الذي يقاس ثابت الربيع ليكون 0.07N / م، ومن المقرر أن يكون 17 نانومتر بحيث الحد الأقصى للقوة الطعج تطبيقها على العينة 1.2 ن ن. يتم وضع علامة على المواقع الرئيسية خلال المسافة البادئة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. معايرة الربيع ثابت من الكابولي

  1. تحميل ناتئ إلى AFM وفقا لتعليمات الشركة الصانعة. فمن الضروري لتنظيف حامل ناتئ مع الايثانول قبل أي تجارب. وهذا سوف يساعد الحد من التلوث الجرثومي للثقافة خلال قياسات AFM.
  2. معايرة InvOLS (معكوس بصري حساسية ليفر). يصف هذه المعلمة مقدار استجابتها الثنائي الضوئي (فولت) لكل نانومتر من انحراف ناتئ.
  3. تحميل شريحة زجاجية نظيفة على خشبة المسرح عينة، ثم تثبيت الرأس AFM وضبط شعاع الليزر والمحاذاة وفقا لتعليمات الشركة الصانعة. إشراك طرف فؤاد على شريحة زجاجية.
  4. مع بيزو سحب، إعادة تنظيم المرآة لقراءة الضوئي -2 V. إجراء القياس الطيفي قوة مع نقطة الزناد (الحد الأقصى استجابة الثنائي الضوئي) من +2 V.
  5. مع بيزو سحب، إعادة تنظيم المرآة لقراءة الضوئي -2 V. إجراء FOالقياس الطيفي RCE مع نقطة الزناد (الحد الأقصى استجابة الثنائي الضوئي) من +2 V. ملاحظة: القيم الجهد هنا هي محددة إلى اللجوء AFM. يجب أن يتم تعيين هذه القيمة وفقا للمواصفات المقدمة من قبل الشركة المصنعة.
    بعد الحصول على البيانات كاملة، وتكبير لمنطقة الشركة التي الاتصال من منحنى القوة. إجراء مناسبا خطي إلى هذه المنطقة للعثور على المنحدر، والتي ستكون في الخامس / نانومتر. معكوس هذه القيمة يصف الحساسية الضوئية من الفرقة ناتئ-الثنائي الضوئي.
  6. إعادة تعيين محاذاة مرآة لانحراف خالية من 0 V.
  7. معايرة الربيع ناتئ المستمر. استخدمت طريقة الحرارية تصل قيمتها لتحديد الربيع المستمر للناتئ 28.
  8. بعد معايرة InvOLS، ورفع الماسح الضوئي بعيدا عن مرحلة عينة مثل عدم وجود تفاعلات بين طرف وعينة.
  9. بدء التقاط البيانات الحرارية. خلال هذه العملية، واهتزاز الحراري للشعاع ناتئ هو recordeد. البرنامج AFM يحلل طيف الطاقة من مثل هذا الاهتزاز الحراري والمؤامرات في نافذة البيانات.
  10. بعد بضع ثوان من الحصول على البيانات، إجراء مناسبا لمقطع البيانات تركزت على أدنى تردد (صدى الأساسية) لتحديد الذروة في ربيع دائم.

2. تحميل عينة

  1. تثبيت ملحق سخان طبق على المرحلة AFM، إن لم يكن مجهزة بالفعل.
  2. ضبط درجة الحرارة إلى 37 درجة مئوية، وانتظر لمدة 20 دقيقة للنظام من أجل التوصل إلى التوازن الحراري مستقرة.
  3. وضع الطبق الثقافة على المسرح AFM وضمان الحصول عليها باستخدام المشبك المتوفرة مع سخان الطبق. فمن المهم لتقليل الوقت بين إزالة الطبق من الحاضنة ووضعه على المسرح، لتجنب الصدمة إلى الخلايا. لقياس أطول من 30 دقيقة، CO 2 متوسطة المستقل ينبغي أن تستخدم لتحل محل ثقافة المتوسط ​​العادي.
  4. ضع قطرة صغيرة من 37 ° C مستنبت لغيض من رانه AFM ناتئ، وخفض رأس AFM حتى يتم المغمورة غيض فقط في السائل.
  5. باستخدام أفضل كاميرا الرؤية CCD، يعيد تنظيم شعاع الليزر على ناتئ (سوف المحاذاة في السائل تكون مختلفة مما كانت عليه في الهواء، وذلك بسبب التغير في معامل الانكسار للوسط).
  6. إشراك طرف فؤاد على منطقة نظيفة من صحن الثقافة.
  7. أداء المعايرة للInvOLS كما هو موضح أعلاه، لحساسية ناتئ في البيئة السائلة.

ملاحظة: أ) إذا يتم استزراع الخلايا على الهلاميات المائية، ومعايرة InvOLS يجب أن يتم تنفيذ مقدما ضد السطح السفلي من صحن الثقافة مليئة سائل الإعلام والثقافة الخلية. عند التبديل إلى عينات الخلايا، اهتماما خاصا يجب أن يدفع لعدم تغيير محاذاة شعاع الليزر مع ناتئ. ب) لديه InvOLS أن تعديلها كلما كان هناك تغيير في محاذاة الليزر. ج) كما يوصى لاتخاذ InvOLS على أنه متوسط ​​قيمة من عدة منحنيات المعايرة، قاينس كل معايرة يولد InvOLS مختلفة. الاختلاف في InvOLS هو، ومع ذلك، صغيرة مقارنة مع القيمة المتوسطة. على سبيل المثال، معايرة وبروكر DNP-10 ناتئ مع الربيع الدائم 0.06 نيوتن / متر في السائل بواسطة 100 مرة تنتج قيمة InvOLS متوسط ​​66.3 نانومتر / V، مع انحراف معياري من نانومتر فقط 0.5 / V.

3. جمع منحنيات القوة المسافة البادئة الخليوي

  1. حدد خلية للتسنن. مع المعونة من المجهر الضوئي، حرك مرحلة لوضع ناتئ فوق الخلية بحيث يقع طرف في المنطقة شبه نوى. التعديل الدقيق للموقف ناتئ ويمكن تحقيق ذلك بتطبيق إزاحة إلى X و Y الماسحات الضوئية.
    ملاحظة: ناتئ AFM لابد من سحبها من سطح العينة في الوقت الذي يتجه المرحلة عينة لتحديد خلية الهدف. هذا يحمي ناتئ من يطرق في العينة، حيث أن سطح العينة قد لا تكون مسطحة.
  2. التبديل إلى الوضع فرض الطيفي. تعيين المسافة البادئةمعدل إلى ضمن مجموعة من 1-10 ميكرون / ثانية، منخفضة بما فيه الكفاية لتجنب الآثار الهيدروديناميكية.
  3. تعيين نقطة الزناد انحراف، الأمر الذي يحد من الحد الأقصى للقوة الطعج لتجنب الضرر للخلايا. حدد الخيار اثار النسبية، والتي سوف تصحيح أي انحراف في إشارة انحراف. قوة أقصى 2 ن ن هي نقطة انطلاق جيدة بالنسبة لمعظم العينات. هذه القيمة، ومع ذلك، ينبغي تعديلها وفقا للصلابة العينة. للحصول على عينات لينة انخفاض قيمة ينبغي أن تستخدم لتجنب المسافة البادئة المفرط للعينة. للحصول على عينات شديدة قيمة عالية وينبغي أن تستخدم لتوليد المسافة البادئة قابلة للقياس.
  4. تعيين مسافة قوة كبيرة بما يكفي لضمان أن غيض سيتم فصل كامل من الخلية بين قياسات القوة. عادة، يتم تعيين مسافة النفاذ في 5 ميكرون.
  5. قيادة AFM أن تأخذ منحنى قوة واحدة.
  6. جمع ما لا يقل عن ثلاثة منحنيات القوة في مواقع مختلفة في منطقة شبه نواة كل خلية. على الرغم من أنه هو مفيد لاتخاذ متعددةالمنحنيات على كل خلية لبيانات إحصائية موثوقة، مع الكثير من المنحنيات القوة يمكن أن يؤدي إلى تغييرات في صلابة الخلية بسبب الإجهاد من التحقيق فؤاد.
  7. عندما جمع البيانات كاملة، سحب الحافة، وكرر الخطوات من 3،1-3،6 لأكبر عدد من الخلايا حسب الحاجة للبيانات إحصائية جيدة على صلابة الخلية تحت بعض حالة العينة. عادة، يتم قياس 30 خلايا لكل حالة.

لتوصيف توزيع صلابة داخل خلية واحدة، يتم تطبيق وضع قوة الخريطة. في وضع قوة الخريطة، وتعيين حجم المسح الضوئي لتشمل المنطقة من الفائدة؛ تعيين القرار المناسب؛ تعيين المعلمات المسافة البادئة لتلك التي اختيرت لمنحنيات قوة واحدة؛ سوف AFM ثم النقطية عبر منطقة العينة المحددة وتأخذ منحنيات قوة واحدة في كل بكسل في المنطقة عينة.

4. تحليل البيانات

ويتم تحليل منحنيات القوة تسجيلها باستخدام إجراء مخصص MATLAB لحساب صلابة الخلية. وفيما يلي وصفا موجزا لإجراء MATLAB:

  1. يحدد برنامج MATLAB نقطة الاتصال بتنسيق Z0 وD0 (انظر الشكل 1) باستخدام خوارزمية اعتمد من أسلوب نشرته لين وآخرون 29.:
  2. لكل نقطة بيانات في منحنى القوة، نفذ نوبة خطية من البيانات إلى يسار نقطة من الفائدة، ونموذجا يصلح هيرتز إلى اليمين (باستخدام نقطة المحددة كنقطة اتصال أولية)، وصولا إلى مجموعة أقصى المسافة البادئة (200-300 نانومتر مستحسن).
  3. لكل نقطة، وحساب الخطأ RMS النسبية لكلا متقطعة وخلاصة هذه القيم.
  4. يتم تحديد النقطة التي يبلغ الحد الأدنى المشاركات الخطأ المناسب كنقطة اتصال أولية.
    ملاحظة: يمكن تخفيض الوقت اللازم للحساب من خلال تنفيذ البحث المقطع الذهبي، بدلا من المسح الضوئي خطيا منحنى القوة بأكملها.
  5. يتم احتساب عينة δ تشوه والطعج قوة F على النحو التالي:
    المعادلة 1
  6. يتم تطبيق المربعات الصغرى المناسب لتناسب F مقابل البيانات δ في المنطقة بعد الاتصال، Z ≥ Z 0، لنموذج هيرتز لاستخراج معامل يونغ، E للخلية:
    المعادلة 2
    ، حيث v هي النسبة بواسون.
    ملاحظة: عندما يكون δ هو أكثر من 10٪ من عينة سماكة (ارتفاع الخلية)، يتأثر صلابة الخلية تقاس صلابة الركيزة. سمك منطقة شبه النووي هو عادة بناء على أمر من بضعة ميكرومتر. لذلك، ولا يصلح إلا للنانومتر 200-300 أول من F-δ للنموذج منحنى هيرتز.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

ويبين الشكل 2A ثلاثة منحنيات القوة الممثلة المأخوذة من الخلايا الليفية 3T3 مثقف على سطح البلاستيك، هلام بولي أكريلاميد من الشباب معاملات الرجوعية 3،000 باسكال و17،000 باسكال، على التوالي. بعد تحديد دقيق لنقاط الاتصال في المنحنيات، يتم رسم قوة الطعج وظيفة من تشوه الخلية في الشكل 2B. تحت قوة من حجم أصغر من 0.3 NN، هرم شكل غيض المسافات البادئة 3 ميكرومتر في خلية تربيتها على 3 كيلو باسكال هلام بولي أكريلاميد. في المقابل، لا بد من قوة أكثر من 1.6 ن ن البادئة 500 نانومتر في الخلية نمت على طبق ثقافة عادي باستخدام نفس معلومات سرية. ويتضح من هذا الرسم البياني أن الخلية مثقف على هلام بولي أكريلاميد لينة ليونة من الخلايا المستزرعة في الطبق زراعة قاسية. تركيب الجزء الأول (δ <30 نانومتر) من منحنيات القوة التي δ للنموذج هيرتز يعطي معاملات الرجوعية الشباب من هذه الخلايا ثلاثة إلى 10 كيلو باسكال، 1.2 كيلو باسكال، و1.10 كيلو باسكال، على التوالي. الخلايا على الثقافةطبق ه هي 100 مرة أكثر صلابة من الخلايا المستزرعة على المواد الهلامية بولي أكريلاميد. سولون وآخرون. وأفادت نتائج مماثلة 25. ووجد الباحثون أن الخلايا الليفية تشديد بنشاط cytoskeletons بهم لتتناسب مع صلابة من ركائز أنها تلتزم بها. كما تم الإبلاغ عن العديد من أنواع الخلايا الأخرى لتصبح أكثر صلابة عندما مثقف على صلابة ركائز 30.

ومن المهم أن نلاحظ أن المسافة البادئة يمكن أن يسبب تشوه البلاستيك في الخلايا، مما يؤدي مكامن الخلل كما هو موضح في منحنى الأرجواني. عادة، ينبغي أن تستبعد مثل هذه المنحنيات من تحليل البيانات. ومع ذلك، لا يزال منحنى استخدامها لحساب صلابة الخلية إذا كان شبك هو أبعد من نطاق البيانات المناسب. على سبيل المثال، شبك في منحنى الأرجواني يحدث في ما يقرب من 400 نانومتر. هذا المنحنى لا يزال من الممكن تحليلها من قبل تركيب بيانات تصل فقط إلى δ = 30 نانومتر إلى نموذج هيرتز لتسفر عن قيمة صلابة من 1.2 كيلو باسكال. ومن المهم أيضا لضبط "نقطة الإطلاق" وفقا لاله عينة صلابة. على سبيل المثال، يتم أخذ منحنى الأزرق من خلية لينة تربيتها على 3 كيلو باسكال هلام بولي أكريلاميد. تحديد انحراف نسبي نقطة الزناد في 5 نانومتر، البادئة غيض فؤاد 3 ميكرومتر في الخلية. ينبغي منع مثل هذه المسافة البادئة كبير خلال قياسات صلابة الخلية، لأنه قد يؤدي إلى تمزق غشاء الخلية وتقتل الخلية. العديد من العوامل الأخرى بما في ذلك السرعة وبيانات معدل اكتساب معلومات سرية خلال اقتناء منحنى القوة يمكن أن تؤثر على نوعية منحنيات القوة المكتسبة، وبالتالي صلابة الناتجة من الخلايا 31. لإجراء قياسات موثوقة فمن الضروري لضبط كل هذه المعايير للحصول على "نظيف" منحنيات القوة كما منحنى الأحمر هو مبين في الشكل 2A، الذي لديه جزء قبل الاتصال مسطحة تليها زيادة غير الخطية جزء بعد الاتصال.

الشكل 3A يظهر صورة مضان من الخلايا الليفية 3T3 على طبق خلية ثقافة. وtransfected الخلية مع GFP vimentin،نوع من خيوط الوسيطة. وقد تم تنفيذ AFM قوة رسم الخرائط في هذا ميكرون 80 ميكرون بنسبة 80 منطقة، مع قرار من 32 × 32 بكسل. يظهر خريطة صلابة مما أدى إلى 3B الشكل. صلابة يختلف عبر الخلية. و، المنطقة قدم صفاحية هو أكثر صلابة وأكثر تنوعا من المنطقة شبه النووي الذي يحيط نواة صلبة.

الشكل 2
الشكل 2. البيانات منحنى القوة وتحليل منحنى قوة المسافة البادئة. أ) مجموعة من ثلاثة بيانات منحنى القوة المكتسبة ممثل عن الخلايا الليفية 3T3 تربيتها على الزجاج (الحمراء)، و 17 كيلو باسكال هلام بولي أكريلاميد (اللون الأرجواني)، و 3 كيلو باسكال هلام بولي أكريلاميد (الازرق). وتحولت منحنيات بحيث نقطة اتصال (Z 0، د 0) يقع في الأصل (0،0) من الإحداثينظام. ب) منحنيات المسافة البادئة قوة يحسب من أ) والمناسب للبيانات المسافة البادئة إلى النموذج هيرتز فقط باستخدام نانومتر 300 الأولى من المسافة البادئة. أقحم في ب) يظهر الخير من يصلح لنموذج هيرتز لنانومتر 300 الأولى من المسافة البادئة؛ الاوساط البيانات التجريبية، وخطوط تمثل البيانات مناسبا. ربيع دائم من ناتئ هو 0.062 نيوتن / متر في هذه الحالة.

الشكل (3)
الشكل (3). أ) صورة مضان من الخلايا الليفية 3T3 transfected مع GFP vimentin. يظهر سوى جزء من الخلية في الصورة. شريط الحجم يمثل 20 ميكرون. ب) A 32 × 32 بكسل خريطة صلابة من نفس المنطقة. كل بكسل يمثل 2.5 ميكرون.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

الأسلوب المسافة البادئة AFM له مزايا لتوصيف الخواص الميكانيكية للخلايا الحية. وإن كان أقل حساسية من الخلوي التواء المغناطيسي وملاقط بصرية، والتي يمكن قياس القوى على مستوى piconewton 32، يمكن للAFM كشف قوة المقاومة من عينات تتراوح بين عشرات بيكو نيوتن لمئات من النانو نيوتن، مماثلة لمجموعة من القوة التي يمكن تطبيقها على الخلايا باستخدام micropipette 19. هذا النطاق للقوة يناسب احتياجات لخلق تشوهات قابلة للقياس في جميع أنواع الخلايا 19. القرار المكانية العالية يجعل من الممكن لتوصيف على مستوى submicron والتغاير في الأنسجة وداخل الخلايا واحد 33. كما يسمح في الوقت الحقيقي القياسات الخلية الحية. يمكن أن العديد من النماذج المصممة للAFM العينات البيولوجية تعمل في بيئة السائل ومجهزة مراحل تسخن عينه، والتي توفر دقة التحكم في درجة الحرارة، مما يجعل من الممكن للحفاظ على ENVI الفسيولوجيةيحدث حولك لالخلايا الحية خلال القياسات. وقد تم تطبيق AFM المسافة البادئة بنجاح لقياس الخواص الميكانيكية للمجموعة واسعة من أنواع الخلايا، 25،34-36، واستخدمت على نطاق واسع لتقييم التغيرات في الخواص الميكانيكية للخلايا المرتبطة تمايز الخلايا والمريضة في سياقات مختلفة. 30،37

خطوة مهمة لحساب صلابة من قوة منحنى يتم تحديد نقطة حيث الطرف الأول يجعل الاتصال مع الخلية. عدم اليقين في نقطة الاتصال يمكن أن تؤثر على معامل المرونة 31. للمواد قاسية، يزيد من إشارة انحراف فجأة بعد الاتصال بلاغ العينة، ويتم التعرف على نقطة الاتصال بسهولة كنقطة تحول في المنحنيات. هذه نقطة تحول حاد، ومع ذلك، في كثير من الأحيان لا يظهر في القوة التي المنحنيات من الخلايا، ونظرا لصلابة الخلية المنخفض (انظر الشكل 2). تم تطوير مدونة MATLAB للعثور بدقة نقاط الاتصال في منحنيات القوةمن عينات لينة باستخدام الخوارزمية المقترحة من لين وآخرون. 29 رمز يمكن التعامل مع المنحنيات قوة من عينات لينة، والتي تمكننا من أتمتة عملية تحليل البيانات من خلال البحث تلقائيا لنقطة الاتصال وتركيب البيانات المسافة البادئة إلى النموذج هيرتز. يتم تطبيق التعليمة البرمجية MATLAB لتحديد نقاط اتصال في 60 منحنيات القوة التي اتخذت في نفس الموقع من هلام بولي أكريلاميد، والتي كان صلابة مقياس لتكون 7.2 كيلو باسكال من قبل القياسات الريولوجيا السائبة. رمز الكشف عن نقاط الاتصال في هذه المنحنيات. نطاق الاختلاف في نقطة الاتصال الموقع أصغر من 15 نانومتر. واستنادا إلى هذه نقاط الاتصال، ويعني صلابة المحسوب هو 6.9 كيلو باسكال، الانحراف المعياري هو 0.2 كيلو باسكال، وأقصى مدى من التباين 0.6 كيلو باسكال. النتائج من هذه التجربة مقياسا لتقييم عدم التيقن من صلابة قياس. عدم اليقين في نتائج نانومتر 15 نقطة اتصال في حالة عدم اليقين في صلابة، والتي هي أقل من 10٪ من متوسط ​​VALUه. ليونة المواد الهلامية مع مستوى منخفض جدا من إشارة انحراف، يمكن الشك في نقطة الاتصال أن تصل إلى 30 نانومتر، مما يؤدي إلى عدم اليقين في صلابة تصل إلى 30٪. رمز متاح كمكمل لهذه المادة.

AFM يمكن قياس موثوق صلابة تتراوح بين أقل من 100 باسكال إلى 10 6 باسكال، الذي يغطي مجموعة من صلابة بالنسبة لمعظم الأنسجة والخلايا. لقياسات موثوقة، فمن المهم لتحديد الكابولي AFM مع ثوابت الربيع مطابقة تماما لصلابة العينة. عندما ناتئ قاسية جدا، انحراف لها صغير جدا لكشف وأنها يمكن أن تتلف الخلايا، وإذا كان ناتئ لينة جدا، وانها لن المسافة البادئة الخلية بما فيه الكفاية للحصول على خصائص المواد موثوق بها ويمكن لها الاهتزازات الحرارية تهيمن على منحنى القوة. الكابولي من 0.06 نيوتن / متر مع طرف الهرم قابلة للتطبيق بالنسبة لمعظم أنواع الخلايا المستزرعة على أطباق ثقافة شديدة. هذه الكابولي، ومع ذلك، لا تنطبق على قياس الخلايا المستزرعة علىركائز لينة. كما هو مبين في الشكل 2، وخلايا مستنبتة على 3،000 باسكال هلام بولي أكريلاميد لينة بحيث ميكرون تسنن 3 مطلوب لتوليد انحراف نانومتر 5 في ناتئ. منحنى القوة مسطح حتى لا يكون هناك فارق كبير جدا بين ما قبل الاتصال والمنطقة في مرحلة ما بعد الاتصال. وهذا يؤدي إلى عدم اليقين الكبيرة في نقطة الاتصال، وبالتالي القيم صلابة الناتجة عن ذلك. باستخدام ناتئ يونة يحسن إلا قليلا التناقض بين ما قبل الاتصال ومناطق ما بعد الاتصال. لقياس هذه المواد لينة، وينصح الكابولي مع تلميح كروية كبيرة. A 0.06 N / M ناتئ مع طرف كروية من 10 ميكرومتر في القطر يمكن تطبيقها لقياس العينات مع انخفاض صلابة من 100 الكابولي بنسلفانيا مع تلميح كروية متاحة تجاريا من العديد من البائعين. ويمكن أن تكون أيضا صنعت خصيصا من قبل الإلتصاق المجهرية إلى الكابولي tipless. نصائح كروية توفير إشارة انحراف أكبر ومنع تلف غشاء الخلية. However، فهي ليست قابلة للتطبيق لرسم الخرائط صلابة عالية الدقة نظرا لمنطقتهم الاتصال الكبيرة مع الخلايا. الجدول 1 يقدم قائمة من تحقيقات AFM أوصت لقياس صلابة الخلية.

نموذج ثابت الربيع (N / M) نوع تلميح دائرة نصف قطرها طرف (نانومتر)
بروكر DNP10-D 0.06 هرم 20
بروكر MLCT-B/C/E 0.01/0.02/0.03 هرم 20
Novascan PT.GS 0.01/0.03/0.06 مجال الزجاج 2،000 / 5،000 / 10،000
Novascan PT.PS 0.01/0.03/0.06 المجال البوليسترين 1،000 / 4،500 / 10،000

الجدول 1. A SEفصل من الكتاب المقدس من تحقيقات فؤاد مع الربيع المستمر المطبقة والهندسة نصيحة للتسنن الخلية.

يجب وضع علامة أيضا القيود المفروضة على الطريقة المعروضة. نموذج هيرتز الذي تم تطبيقه لاحتواء البيانات المسافة البادئة هو نموذج التبسيط. ويتوقع العلاقة قوة المسافة البادئة للحزوز متناهية الصغر من مواد مرنة بحتة من قبل indenters متناسق مع المحور. بعض الافتراضات للنموذج هيرتز لا تنطبق على المسافة البادئة الخلية.

نموذج هيرتز يفترض مادة متجانسة ومرنة خطيا، في حين أن الخلية غير المتجانسة (انظر الشكل 3) ومرن nonlinearly. في المنطقة قدم صفاحية، فمن غير متجانسة بدلا نظرا لهيكل غير متجانسة من الهيكل الخلوي أكتين. وذكرت وصلابة الميكانيكية للخلية حيث بلغ متوسط ​​صلابة المستخرجة من ثلاثة أو أكثر من منحنيات القوة المكتسبة من منطقة محيط بالنواة متجانسة نسبيا. 25،36 معاد تكوينه الشبكهKS من الأكتين والمتوسطة خيوط هي مواد سلالة تشنج، أي أنها أكثر صلابة في تشوهات أكبر. وقد لوحظ 38،39 مثل هذا مرونة غير الخطية للخلايا الحية، ولكن لا تحتسب في نموذج هيرتز. للحد من تأثير مرونة غير الخطية على صلابة الخلية المبلغ عنها، ولا يصلح إلا للنانومتر 300 الأولى من البيانات المسافة البادئة إلى النموذج هيرتز.

ومن المفترض أيضا في نموذج هيرتز أن المواد هي مرونة بحتة. ومع ذلك، الخلايا والهيكل الخلوي هم المواد اللزجة مع صلابة تعتمد على الفترة الزمنية للقياسات. في مقياس زمني أقصر، وانحراف ناتئ تأتي أساسا من الاستجابة المرنة من الخلايا. على نطاق واسع منذ فترة طويلة، ومع ذلك، فإن عينة تزحف ويعطي استجابة أكثر ليونة. يتم التحكم في النطاق الزمني لAFM المسافة البادئة من قبل سرعة غيض. وبالتالي، فإن الفرق الملحوظ في صلابة الخلية هو مفيد فقط عندما يتم الحصول على منحنيات القوة مع نفس المسافة البادئة VELOالمدينة. لاستخراج كميا وتيرة زوجة مطاطية تعتمد من الخلايا، وقد تم تطوير أسلوب AFM "قوة التشكيل" من خلال تطبيق عالية التردد التذبذبات الصغيرة السعة بناء على المسافة البادئة أكبر 21،27.

لا ينطبق افتراض لا حصر له سماكة العينة في نموذج هيرتز للخلايا. الخلايا هي عادة بضعة ميكرومتر سميكة في منطقة محيط بالنواة، وبضع مئات من نانومتر سميكة في المنطقة لاميلا. وقد بذلت تصحيحات لحساب سماكة عينة محدودة. 31،40 بيانات تم الحصول عليها من قوة رسم الخرائط يحتوي على كل البيانات المسافة البادئة والبيانات ارتفاع الخلية. ويمكن حساب سمك العينة المحلية من البيانات ارتفاع. مطلوب عمل في المستقبل لتنفيذ التصحيحات سماكة العينة في تحليل لبيانات القوى رسم الخرائط.

في ملخص، تعرض هذه الورقة على بروتوكول لتوصيف صلابة الميكانيكية من الخلايا الحية باستخدام اللجوء MFP3D بيو ميكر القوة الذريةoscope. مبادئ عملية AFM وإجراء تحليل البيانات MATLAB تنطبق على جميع الموديلات AFM الأخرى. في السنوات الأخيرة، وقد تم الجمع بين تقنيات المجهر الضوئي بما في ذلك حقل مشرق، الفحص المجهري متحد البؤر، ومجموع الداخلية انعكاس مضان المجهري (TIRF) مع AFM للتصوير في الوقت الحقيقي من الخلايا للمؤثرات الميكانيكية. 41،42 كما تسمح هذه الاجهزة القياسات في وقت واحد ميكانيكا الخليوي والتصوير من مكونات هيكل الخلية. وربط البيانات صلابة المحلية لتوزيع مكونات هيكل الخلية المحلية تقديم معلومات الثاقبة على كيفية المساهمة في مكونات هيكل الخلية إلى خلية الميكانيكا.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

Acknowledgments

الكتاب أشكر الدكتور بول Janmey في جامعة ولاية بنسلفانيا لتوفير خطوط الخلايا المستخدمة في هذه الورقة. QW نعترف أيضا JF في Byfield وايفان اندرسون للمناقشات الثاقبة على تقنيات AFM.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Atomic Force Microscope Asylum Research MFP3D-BIO

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Discher, D. E., Janmey, P., Wang, Y. L. Tissue cells feel and respond to the stiffness of their substrate. Science. 310, 1139-1143 (2005).
  2. Wagner, O. I., et al. Softness, strength and self-repair in intermediate filament networks. Exp. Cell Res. 313, 2228-2235 (2007).
  3. Wang, N., et al. Mechanical behavior in living cells consistent with the tensegrity model. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98, 7765-7770 (2001).
  4. Wang, N., et al. Cell prestress. I. Stiffness and prestress are closely associated in adherent contractile cells. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 282, 606-616 (2002).
  5. Kasza, K. E., et al. Filamin A is essential for active cell stiffening but not passive stiffening under external force. Biophysical Journal. 96, 4326-4335 (2009).
  6. Elson, E. L. Cellular mechanics as an indicator of cytoskeletal structure and function. Annual Review of Biophysics and Biophysical Chemistry. 17, 397-430 (1988).
  7. Schafer, A., Radmacher, M. Influence of myosin II activity on stiffness of fibroblast cells. Acta Biomaterialia. 1, 273-280 (2005).
  8. Guck, J., et al. Optical deformability as an inherent cell marker for testing malignant transformation and metastatic competence. Biophysical Journal. 88, 3689-3698 (2005).
  9. Cross, S. E., Jin, Y. S., Rao, J., Gimzewski, J. K. Nanomechanical analysis of cells from cancer patients. Nature Nanotechnology. 2, 780-783 (2007).
  10. Plodinec, M., et al. The nanomechanical signature of breast cancer. Nature Nanotechnology. 7, 757-765 (2012).
  11. Rotsch, C., Radmacher, M. Drug-induced changes of cytoskeletal structure and mechanics in fibroblasts: an atomic force microscopy study. Biophysical Journal. 78 (00), 520-535 (2000).
  12. Cross, S. E., Jin, Y. S., Lu, Q. Y., Rao, J., Gimzewski, J. K. Green tea extract selectively targets nanomechanics of live metastatic cancer cells. Nanotechnology. 22, 215101 (2011).
  13. Hoffman, B. D., Crocker, J. C. Cell mechanics: dissecting the physical responses of cells to force. Annual Review of Biomedical Engineering. 11, 259-288 (2009).
  14. Hoffman, B. D., Massiera, G., Van Citters, K. M., Crocker, J. C. The consensus mechanics of cultured mammalian cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103, 10259-10264 (2006).
  15. Lau, A. W., Hoffman, B. D., Davies, A., Crocker, J. C., Lubensky, T. C. Microrheology, stress fluctuations, and active behavior of living cells. Physical Review Letters. 91, 198101 (1981).
  16. Liu, J., et al. Microrheology probes length scale dependent rheology. Physical Review Letters. 96, 118104 (2006).
  17. Deng, L., et al. Fast and slow dynamics of the cytoskeleton. Nature Materials. 5, 636-640 (2006).
  18. Oh, M. J., Kuhr, F., Byfield, F., Levitan, I. Micropipette Aspiration of Substrate-attached Cells to Estimate Cell Stiffness. J. Vis. Exp. (67), e3886 (2012).
  19. Hochmuth, R. M. Micropipette aspiration of living cells. Journal of Biomechanics. 33, 15-22 (2000).
  20. Levental, I., et al. A simple indentation device for measuring micrometer-scale tissue stiffness. J. Phys-Condens. Mat. 22, (2010).
  21. Mahaffy, R. E., Park, S., Gerde, E., Kas, J., Shih, C. K. Quantitative analysis of the viscoelastic properties of thin regions of fibroblasts using atomic force microscopy. Biophysical Journal. 86, 1777-1793 (2004).
  22. Radmacher, M. Measuring the elastic properties of biological samples with the AFM. IEEE Engineering in Medicine and Biology Magazine: The Quarterly Magazine of the Engineering in Medicine & Biology Society. 16, 47-57 (1997).
  23. Crocker, J. C., Hoffman, B. D. Multiple-particle tracking and two-point microrheology in cells. Methods in Cell Biology. 83, 141-178 (2007).
  24. Liu, F., Tschumperlin, D. J. Micro-mechanical characterization of lung tissue using atomic force microscopy. J. Vis. Exp. (54), e2911 (2011).
  25. Solon, J., Levental, I., Sengupta, K., Georges, P. C., Janmey, P. A. Fibroblast adaptation and stiffness matching to soft elastic substrates. Biophysical Journal. 93, 4453-4461 (2007).
  26. Wu, H. W., Kuhn, T., Moy, V. T. Mechanical properties of l929 cells measured by atomic force microscopy: Effects of anticytoskeletal drugs and membrane crosslinking. Scanning. 20, 389-397 (1998).
  27. Radmacher, M., Fritz, M., Kacher, C. M., Cleveland, J. P., Hansma, P. K. Measuring the viscoelastic properties of human platelets with the atomic force microscope. Biophysical Journal. 70, 556-567 (1996).
  28. Levy, R., Maaloum, M. Measuring the spring constant of atomic force microscope cantilevers: thermal fluctuations and other methods. Nanotechnology. 13, 33-37 (2002).
  29. Lin, D. C., Dimitriadis, E. K., Horkay, F. Robust strategies for automated AFM force curve analysis--I. Non-adhesive indentation of soft, inhomogeneous materials. Journal of Biomechanical Engineering. 129, 430-440 (2007).
  30. Davis, J. T., Wen, Q., Janmey, P. A., Otteson, D. C., Foster, W. J. Muller cell expression of genes implicated in proliferative vitreoretinopathy is influenced by substrate elastic modulus. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53, 3014-3019 (2012).
  31. Engler, A. J., Rehfeldt, F., Sen, S., Discher, D. E. Microtissue elasticity: Measurements by atomic force microscopy and its influence on cell differentiation. Method Cell Biol. 83, 521-545 (2007).
  32. Lele, T. P., et al. Tools to study cell mechanics and mechanotransduction. Methods in Cell Biology. 83 (07), 443-472 (2007).
  33. A-Hassan, E., et al. Relative microelastic mapping of living cells by atomic force microscopy. Biophysical Journal. 74, 1564-1578 (1998).
  34. Costa, K. D., Sim, A. J., Yin, F. C. Non-Hertzian approach to analyzing mechanical properties of endothelial cells probed by atomic force microscopy. Journal of Biomechanical Engineering. 128, 176-184 (2006).
  35. Xiong, Y., Lee, A. C., Suter, D. M., Lee, G. U. Topography and nanomechanics of live neuronal growth cones analyzed by atomic force microscopy. Biophysical Journal. 96, 5060-5072 (2009).
  36. Byfield, F. J., et al. Absence of filamin A prevents cells from responding to stiffness gradients on gels coated with collagen but not fibronectin. Biophysical Journal. 96, 5095-5102 (2009).
  37. Cross, S. E., et al. AFM-based analysis of human metastatic cancer cells. Nanotechnology. 19, 384003 (2008).
  38. Storm, C., Pastore, J. J., MacKintosh, F. C., Lubensky, T. C., Janmey, P. A. Nonlinear elasticity in biological gels. Nature. 435, 191-194 (2005).
  39. Wen, Q., Janmey, P. A. Polymer physics of the cytoskeleton. Current Opinion in Solid State & Materials Science. 15, 177-182 (2011).
  40. Dimitriadis, E. K., Horkay, F., Maresca, J., Kachar, B., Chadwick, R. S. Determination of elastic moduli of thin layers of soft material using the atomic force microscope. Biophysical Journal. 82 (02), 2798-2810 (2002).
  41. Trache, A., Lim, S. M. Live cell response to mechanical stimulation studied by integrated optical and atomic force microscopy. J. Vis. Exp. (44), e2072 (2010).
  42. Lim, S. M., Kreipe, B. A., Trzeciakowski, J., Dangott, L., Trache, A. Extracellular matrix effect on RhoA signaling modulation in vascular smooth muscle cells. Exp. Cell Res. 316, 2833-2848 (2010).

Tags

الفيزياء الحيوية، العدد 76، الهندسة الحيوية، علم الأحياء الخلوي، علم الأحياء الجزيئية، الفيزياء، الهندسة الكيميائية، الميكانيكا الحيوية والهندسة الحيوية (عام)، AFM، وصلابة الخلية، microindentation، قوة التحليل الطيفي، ومجهر القوة الذرية، المجهري
قياس الخواص الميكانيكية للخلايا الحية باستخدام المجهر القوة الذرية
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Thomas, G., Burnham, N. A.,… More

Thomas, G., Burnham, N. A., Camesano, T. A., Wen, Q. Measuring the Mechanical Properties of Living Cells Using Atomic Force Microscopy. J. Vis. Exp. (76), e50497, doi:10.3791/50497 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter