Måling av mekaniske egenskaper Living Cells hjelp Atomic Force Mikroskopi

Summary

Denne artikkelen viser en protokoll for å karakterisere de mekaniske egenskapene til levende celler ved hjelp av microindentation ved hjelp av en Atomic Force Microscope (AFM).

Abstract

Mekaniske egenskapene til celler og ekstracellulære matrix (ECM) spiller viktige roller i mange biologiske prosesser, inkludert stamceller differensiering, svulst formasjon, og sårtilheling. Endringer i stivhet av celler og ECM er ofte tegn på endringer i celle fysiologi eller sykdommer i vev. Derfor er celle stivhet en indeks for å vurdere status av cellekulturer. Blant de mange metoder som er anvendt for å måle stivheten av celler og vev, gir mikro-skår med en Atomic Force mikroskop (AFM) en driftsikker måte å måle stivheten av levende celler. Denne metoden har blitt mye brukt for å karakterisere den mikro-skala stivhet til en rekke materialer, som strekker seg fra metalloverflater til mykt biologisk vev og celler. Det grunnleggende prinsippet om denne metoden er å rykke inn en celle med en AFM spissen av valgt geometri og måle anvendt kraft fra bøying av AFM cantilever. Montering av kraft-innrykk kurven til Hertz-modusl for tilsvarende spiss geometri kan gi kvantitative målinger av vesentlig stivhet. Denne artikkelen viser prosedyren for å karakterisere stivhet i levende celler ved hjelp av AFM. Viktige trinn, blant annet prosessen med AFM kalibrering, kraft-kurve erverv og dataanalyse ved hjelp av en MATLAB rutine blir demonstrert. Begrensninger av denne metoden blir også diskutert.

Introduction

Mekaniske egenskaper, spesielt stivhet, av individuelle celler og deres omkringliggende ekstracellulære matriser (ECM) er kritisk for mange biologiske prosesser, inkludert cellevekst, motilitet, divisjon, differensiering og vev homeostase. ^1. Det har vist seg at celle mekanisk stivhet bestemmes i hovedsak av cytoskjelettet, spesielt nettverk av aktin og mellomliggende filamenter og andre proteiner knyttet til dem. ² Resultater fra mekaniske tester på in vitro nettverk av aktin og mellomliggende filamenter tyder på at cellen mekanikk er i stor grad avhengig av cytoskeletal struktur og pre-stress i cytoskjelettet. ^3-5 Stivhet av levende celler blir da regnet som en indeks for å vurdere cytoskeletal struktur ^6, myosin aktivitet ⁷ og mange andre cellulære prosesser. Enda viktigere, er endringer i celle mekaniske egenskaper også ofte funnet å være nært tilknyttedererte med ulike sykdomstilstander som tumor dannelse og metastase ^8-10 Overvåking mekanisk stivhet i levende celler kan derfor gi en ny måte å overvåke cellefysiologi;. å oppdage og diagnostisere sykdommer ^8;., og å evaluere effektiviteten av medikamentell behandling ^{11 , 12}

Flere metoder, inkludert partikkel-sporing microrheology, ^13-16 magnetisk kronglete cytometry, ¹⁷ micropipette aspirasjon ^18,19 og microindentation ^20-22 har blitt utviklet for å måle elastisitet av celler. Partikkel sporing microrheology sporer de termiske vibrasjoner av enten submicron fluorescerende partikler sprøytet inn celler eller fiducial markører inne i cellen cytoskjelettet. ²³ Elastiske og viskøse egenskaper til celler er beregnet ut fra de målte partikkel forskyvninger ved hjelp av svingning-spredning teorem. ^14,23 Denne metoden gjør samtidige målinger av lokalemekaniske egenskaper med høy romlig oppløsning på forskjellige steder i en celle. Imidlertid kan injisere fluorescerende partikler inn i cellene føre til endringer i cellulære funksjon, cytoskeleton struktur, og dermed cellen mekanikk. Mikropipette aspirasjon metoden gjelder undertrykk i en mikropipette med diameter i området 1-5 um for å suge en liten del av cellemembranen inn i pipetten. Cell stivhet beregnes ut fra den anvendte undertrykk og cellemembranen deformasjon. ^18. Denne metoden er imidlertid ikke detekterer den heterogene fordeling av stivheten på tvers av cellen. Magnetisk vridning cytometri (MTC) gjelder magnetisk felt for å generere dreiemoment på super paramagnetiske kuler festet til cellemembranen. Cell ¹⁷ stivhet er avledet på denne måte fra forholdet mellom den anvendte dreiemoment og den vridning deformasjon av cellemembranen. Det er vanskelig å kontrollere plasseringen av magnetiske kuler ved MTC-metoden, og det er også challenging for å karakterisere den ikke vrir deformasjon med høy oppløsning. Microindentation gjelder en indenter med veldefinerte geometri å slå inn i cellen. Den innrykk kraft og den resulterende innrykk i cellene ofte følger prediksjon av Hertz modell. Youngs moduli av celler kan beregnes ut fra den kraft-skår kurver ved å montere dem på Hertz-modellen. Denne metoden har blitt mye brukt for å teste de mekaniske egenskaper av vev og celler til tross for sine begrensninger som usikkerhet i kontaktpunkt bestemmelse, anvendelse av modellen Hertz, og potensialet for fysisk å skade cellene. Blant de mange enheter for microindentaion ²⁰ for ^fremstilling av Atomic Force mikroskop (AFM) kommersielt tilgjengelige og har vært mye anvendt for å karakterisere mekaniske egenskapene til levende celler og vev ^21,24-27.

Denne artikkelen viser fremgangsmåten for å bruke en Asylum MFP3D-Bio AFM å karakterisere cellen mekanikk. AFM ikke påly gir høy oppløsning topografi av celler, men også har blitt mye brukt for å karakterisere de mekaniske egenskapene til vev celler. Prinsippet for AFM skår er illustrert i figur 1.. Den AFM cantilever nærmer cellen fra noen få mikrometer ovenfor, kommer i kontakt med cellen; rykkes cellen slik at bjelkeenden defleksjonen når en på forhånd valgt settpunkt, og trekker bort fra cellen. Under denne prosessen blir frittbærende avbøyning blir registrert som en funksjon av sin plassering som vist i figur 1. Før å ta kontakt med cellen, flyttes cantilever i medium uten noen åpenbar nedbøyning. Når innrykk på cellen, de cantilever svinger og nedbøyning signal øker. De cantilevers modelleres som elastiske bjelker, slik at deres avbøyning er proporsjonal med den kraft som påføres på cellen. Ved å sette den maksimale cantilever avbøyning, er den maksimale størrelse av kraft som påføres prøven er begrenset for å unngå dAmage til cellene. Den del av kurven kraft fra punkt B til punkt C på figur 1, der spissen fordypningene inn i cellen, er skikket til hertz modell for å trekke ut den celle stivhet.

Figur 1. Illustrasjon av AFM microindentation og tolkning av kraften kurven. Den øverste panelet viser bevegelse av AFM cantilever drevet av piezo skanneren. Den vertikale plasseringen av cantilever z og cantilever nedbøyning signal d er registrert under prosessen. Den frittbærende starter fra et punkt, noen få mikrometer over cellen. Mens nærmer celle, forblir prøven skår δ null inntil den når punktet b, der spissen kommer i kontakt med cellen. Koordinatene til punkt b i plottet er kritiske verdierfor data analyse, merket med (z _0, d _0>). Fra B til C, de cantilever innrykk i cellen til det cantilever defleksjonen når et sett punkt, som er satt til å være forholdet mellom målrettet maksimal innrykk kraft og bommene våren konstant. Når nedbøyning signal når forhåndsinnstilt maksimalverdi, blir cantilever så trukket tilbake fra cellen til punktet d, hvor den ofte trekkes nedover på grunn av spiss-sample adhesjon, løsner fra cellen og går tilbake til sin opprinnelige plassering ved e. Høyre panel viser forholdet mellom innsnittet og den innspilte Z og D-signalet. I den nedre venstre panel viser et diagram av en representativ kurve kraft, den maksimale innrykk av en konsoll, hvorav den fjærkonstant er målt til å være 0.07N / m, er satt til å være 17 nm, slik at den maksimale kraft som påføres innrykk prøven er 1,2 nN. De sentrale posisjoner under innrykk er merket.

Protocol

En. Kalibrere Spring Constant av Cantilever

1. Laste cantilever inn i AFM i henhold til produsentens instruksjoner. Det er nødvendig å rengjøre cantilever holder med etanol før noen eksperimenter. Dette vil bidra til å begrense bakteriell forurensning til kultur i løpet av de AFM målinger.
2. Kalibrere InvOLS (Inverse Optical Lever sensitivitet). Denne parameteren beskriver mengden av fotodiode respons (volt) per nanometer av cantilever nedbøyning.
3. Legg et rent glass lysbilde på prøven scenen, deretter installere AFM hodet og justere laserstrålen og justering i henhold til produsentens instruksjoner. Engasjere AFM spissen på glass-slide.
4. Med piezo trukket tilbake, justere speilet til en fotodiode lesning av -2 V. Utfør en kraft spektroskopi måling med et triggerpunkt (maks. photodiode respons) av 2 V.
5. Med piezo trukket tilbake, justere speilet til en fotodiode lesning av -2 V. Utfør en foRCE spektroskopi måling med et triggerpunkt (maks. photodiode respons) av to V. Merk: Spenningen verdier her er spesifikke for Asylum AFM. Denne verdien bør settes i henhold til spesifikasjonene fra produsenten.
   Etter datainnsamling er fullført, zoome inn til firmaet-kontakt regionen i kraft kurve. Utføre en lineær tilpasning til denne regionen å finne skråningen, som vil være i V / nm. Den resiproke verdi av denne verdi beskriver den optiske følsomheten av cantilever-fotodioden ensemble.
6. Tilbakestille speil justering til en gratis nedbøyning av 0 V.
7. Kalibrere cantilever våren konstant. En termisk-tune metode brukes for å bestemme den fjærkonstant av bommene ^28..
8. Etter kalibrering av InvOLS, heve skanneren unna prøven scenen slik at det ikke er noen interaksjoner mellom spissen og prøve.
9. Begynne å spille termiske data. I løpet av denne prosess, er den termiske vibrasjon av utkragerbjelke recorded. AFM programvaren analyserer en makt spektrum av en slik termisk vibrasjon og plotter det i en data-vinduet.
10. Etter noen sekunder med datainnsamling, utføre en tilpasning til data segmentet sentrert til lavest frekvens (fundamental resonans) peak å bestemme våren konstant.

2. Legge Sample

1. Installer Dish Heater tilbehør på AFM scenen, hvis det ikke allerede utstyrt.
2. Still temperaturen til 37 ° C, og vente i 20 min for systemet å nå en stabil termisk likevekt.
3. Plasser kultur fatet på AFM scenen og fest den med klemmen som følger med parabol varmeapparat. Det er viktig å minimere tiden mellom fjerning av fatet fra inkubatoren og plassere den på scenen, for å unngå skade på cellene. For målinger på mer enn 30 min, bør CO _to uavhengige medium brukes til å erstatte den normale kulturmediet.
4. Påfør en liten dråpe 37 ° C kulturmedium til spissen av than AFM cantilever, og senk AFM hodet til spissen er bare nedsenket i væske.
5. Bruk av topp-visning CCD-kamera, omstille laserstrålen på utkrager (innrettingen i væsken vil være annerledes enn i luft, på grunn av endringen i brytningsindeksen for det medium).
6. Engasjere AFM spissen på et rent område av kulturen fatet.
7. Utføre kalibrering av InvOLS som beskrevet ovenfor, for den frittbærende følsomhet i det flytende miljø.

Merk: a) Dersom celler dyrkes i hydrogeler, bør kalibreringen av InvOLS bli utført på forhånd mot bunnoverflaten av en kultur tallerken fylt med cellekulturmedier. Når du bytter til celleprøver, har spesiell oppmerksomhet rettes mot ikke endre laserstrålen innretting med bommene. b) InvOLS må rekalibreres når det er en endring i den laseropprettingssystem. c) Det anbefales også å ta InvOLS som gjennomsnittet av verdien fra flere kalibreringskurver, sInce hver kalibrering genererer en annen InvOLS. Variasjonen i InvOLS er imidlertid liten i forhold til den midlere verdi. For eksempel, å kalibrere et Bruker DNP-10 cantilever med fjærkonstant 0,06 N / m i flytende ved 100 ganger produsere en middelverdi InvOLS verdi på 66,3 nm / V, med standardavvik på bare 0,5 Nm / V.

3. Samle Force Curves of Cell Skår

1. Velg en celle for innrykk. Ved hjelp av det optiske mikroskop, flytter stadium å posisjonere den frittbærende over cellen, slik at spissen ligger i det peri-kjerner region. Nøyaktig justering av frittbærende stilling kan oppnås ved å bruke forskyvninger til X-og Y-skannere.
   Merk: AFM cantilever må trekkes tilbake fra prøven overflaten mens du flytter prøven scenen for å velge et mål celle. Dette beskytter bommene slåes inn i prøven, siden den type overflate ikke kan være flat.
2. Bytt til kraft spektroskopi modus. Sett Innrykksats til innen området av 1-10 um / sek, lav nok til å unngå hydrodynamiske effekter.
3. Sett nedbøyning triggerpunkt, noe som begrenser den maksimale innrykk makt for å unngå skader på cellene. Velg Relativ utløsende alternativet, som vil korrigere for enhver drift i nedbøyning signalet. En maksimal kraft på 2 nN er et godt utgangspunkt for de fleste prøvene. Denne verdi, men bør justeres i henhold til prøven stivhet. For myke prøver en lavere verdi bør brukes for å unngå overdreven innrykk til prøven. For stive prøver en høy verdi bør brukes til å generere målbar innrykk.
4. Sett kraft avstand stor nok til å sikre at spissen vil være fullt løsrevet fra cellen mellom kraft målinger. Vanligvis er kraften avstand satt til 5 mikrometer.
5. Kommandoen AFM til å ta en enkelt kraft kurve.
6. Samle minst tre tvinger kurvene på forskjellige steder i den peri-kjerner region av hver celle. Selv om det er fordelaktig å ta multiplumkurver på hver celle for pålitelige statistiske data, tar for mange force kurver kan føre til endringer i celle stivhet på grunn av stress fra AFM probe.
7. Når datainnsamlingen er ferdig, ta ut spissen, og gjenta trinn 03.01 til 03.06 for så mange celler som trengs for gode statistiske data om celle stivhet under en viss prøve tilstand. Vanligvis er 30 celler måles for hver tilstand.

Å karakterisere fordelingen av stivhet innenfor en enkelt celle, er kraft-map-modus brukes. I Force-map-modus, stille en skanning størrelse å inkludere regionen av interesse, sette en passende oppløsning; angi innrykk parameterne som de valgte for enkelt kraft kurver; AFM vil da raster over definerte prøven området og ta enkelt kraft kurver på hver piksel i prøven regionen.

4. Data Analysis

De registrerte kraft kurvene er analysert ved hjelp av en tilpasset MATLAB prosedyre for å beregne cellen stivhet. Det følgende er en kort beskrivelse av MATLAB prosedyre:

1. MATLAB-programmet identifiserer kontaktpunkt koordinerer z0 og d0 (se figur 1) ved hjelp av en algoritme adoptert fra et offentliggjort metode Lin et al ^29.:
2. For hvert datapunkt i kraft kurve, utfører en lineær tilpasning av dataene til venstre for punktet av interesse, og en Hertz-modellen passer til den høyre (ved hjelp av det valgte punktet som den første kontaktpunkt), opp til den innstilte maksimal innrykk (200-300 nm anbefales).
3. For hvert punkt, beregne den relative RMS feil av både passer og summere disse verdiene.
4. Poenget som oppnår minimum total montering feilen er valgt som første kontaktpunkt.
   Merk: Computation tiden kan reduseres ved å implementere en golden-delen søk i stedet for lineært skanne hele kraften kurven.
5. Sample deformasjon δ og innrykk kraft F er beregnet som:
   
6. En minste kvadraters tilpasning er brukt til å passe F g. δ data i post-kontakt regionen, z ≥ z _0, til Hertz modell for å trekke ut Youngs modul, E av cellen:
   
   , Der v er Poisson ratio.
   Merk: Når δ er mer enn 10% av prøvens tykkelse (høyde celle), blir den målte celle stivhet påvirkes av substratet stivhet. Tykkelsen av peri-kjernefysiske regionen er vanligvis i størrelsesorden noen få mikrometer. Derfor er bare de første 200-300 nm for F-δ kurve passer til Hertz modell.

Representative Results

Figur 2a viser tre representative kurver kraft tatt fra 3T3 fibroblaster dyrket på plastoverflaten, polyakrylamidgel av Youngs moduli 3000 Pa og 17 000 Pa, henholdsvis. Etter omhyggelig identifisere kontaktpunktene i kurvene, blir innrykk kraft som funksjon av celle deformasjon plottet i Figur 2b. Under en kraft størrelsesorden mindre enn 0,3 nN, pyramideform tips innrykk tre mikrometer i en celle dyrket på en 3 kPa polyakrylamidgel. I motsetning til dette er en kraft i overkant av 1,6 nN kreves for å rykke 500 nanometer i cellen dyrkes på vanlig kultur tallerken ved hjelp av den samme spiss. Det er klart fra dette diagrammet at cellen dyrket på myk polyakrylamidgel er mykere enn cellen dyrkes på stiv dyrkning fatet. Montering av første segmentet (δ <30 nm) av kraft-δ kurver til Hertz modellen gir Youngs moduli av disse tre celler som 10 kPa, 1,2 kPa, og 1,10 kPa hhv. Celler på culture fatet er 100 ganger stivere enn celler dyrket på polyakrylamidgeler. Solon et al. Har rapportert lignende resultater ^25. De fant at fibroblaster aktivt stive sine cytoskeletons å matche stivheten underlag de følger. Mange andre celletyper har også blitt rapportert å bli stivere når dyrket på stivere underlag ^30.

Det er viktig å merke seg at innsnittet kan forårsake plastisk deformasjon i celler, noe som resulterer knekk som vist i purpur kurve. Normalt skal slike kurver bli ekskludert fra dataanalysen. Imidlertid kan kurven fortsatt brukes til å beregne celle stivhet hvis knekkpunkt er utenfor rekkevidden til å tilpasse data. For eksempel forekommer det kink i den lilla kurven ved ca 400 nm. Denne kurven kan fremdeles bli analysert ved å tilpasse dataene bare opp til δ = 30 nm på Hertz-modell for å gi en stivhet verdi på 1,2 kPa. Det er også viktig å justere "utløsende punkt" ifølge the sample stivhet. For eksempel er den blå kurve tatt fra en myk celle dyrkes i 3 kPa polyakrylamidgel. Innstilling av relativ nedbøyning triggerpunkt på 5 nm, de AFM tips innrykk tre mikrometer inn i cellen. Et slikt stort skår bør forhindres det celle stivhet målingene, siden den kan briste cellemembranen og dreper cellen. Mange andre faktorer, inkludert tuppen hastighet og datainnsamling hastighet i løpet av kraft kurve kjøpet, kan påvirke kvaliteten av ervervede kraft kurver og dermed den resulterende stivhet i celler ^31. For å gjøre pålitelige målinger er det nødvendig å justere alle disse parametrene for å erverve "rene" force kurver som røde kurven er vist i figur 2a, som har en flat pre-kontaktdelen etterfulgt av en ikke-lineær økende post-kontaktdelen.

Figur 3a viser en fluorescens bilde fra en 3T3 fibroblast på en cellekultur parabolen. Cellen blir tilført med GFP vimentin,en form for mellomliggende filamenter. AFM Force-kartlegging er gjennomført i denne 80 mikrometer med 80 mikrometer område, med en oppløsning på 32 x 32 piksler. Den resulterende stivhet kart er vist i figur 3b. Den stivhet varierer over hele cellen. Og, er det lamellipodium regionen stivere og mer heterogene enn peri-kjernefysiske regionen som omgir stiv kjerne.

Figur 2. Force kurve data og analysert kraft-skår kurve. A) Et sett av tre representative kraft kurve data ervervet for 3T3 fibroblaster dyrket på glass (rød), 17 kPa polyakrylamidgel (purpur), og 3 kPa polyakrylamidgel (blå). Kurvene er forskjøvet slik at det kontaktpunkt (z _{0, 0} d) ligger i origo (0,0) av koordinatsystemetsystem. b) innrykk-force kurver beregnet ut fra a) og montering av innrykk data til Hertz modell med kun de første 300 nm av innrykk. Innfelt i b) viser føyning til Hertz modell for de første 300 nm av innrykk, sirkler er eksperimentelle data, linjer representerer fit data. Den fjærkonstant av utkragingen er 0.062 N / m i dette tilfellet.

Figur 3. a) Fluorescens bilde av en 3T3 fibroblast transfektert med GFP vimentin. Bare en del av cellen er vist i bildet. Scale bar representerer 20 mikrometer. B) En 32 x 32 piksler stivhet kart over samme område. Hver piksel representerer 2,5 mikrometer.

Discussion

Den AFM skår metode har fordeler å karakterisere mekaniske egenskapene til levende celler. Riktignok mindre følsom enn den magnetiske kronglete cytometry og optiske pinsetter, som kan måle krefter på piconewton nivå ^32, kan AFM oppdage motstand kraft fra prøver som spenner fra titalls pico-Newton til hundrevis av nano-Newton, kan sammenlignes med alt av kraft som kan anvendes på celler ved hjelp av en mikropipette ^19.. Denne serien av makt passer behovene for å skape målbare deformasjoner i alle typer celler ^19. Den høy romlig oppløsning gjør det mulig å karakterisere den submikron nivå de heterogeniteter i vev og innenfor enkeltceller ^33.. Den tillater også sanntid live celle målinger. Flere AFM-modeller utformet for biologiske prøver kan operere i et flytende miljø, og er utstyrt med oppvarmede prøven stadier, som gir nøyaktig kontroll med temperaturen, noe som gjør det mulig å opprettholde en fysiologisk miljømentet for levende celler under målingene. AFM innrykk har blitt brukt for å måle de mekaniske egenskapene til en rekke celletyper, ^25,34-36 og har vært brukt mye for å vurdere endringer i mekaniske egenskapene til celler assosiert med mobilnettet differensiering og i ulike syke sammenhenger. ^30,37

Et viktig trinn for å beregne stivhet fra kraft-kurve er å identifisere det punkt hvor spissen først får kontakt med cellen. Usikkerheten i kontaktpunktet kan påvirke elastisitetsmodulen ^31.. For stive materialer, øker nedbøyning signal brått etter tip-prøven kontakt, og kontaktpunkt er lett identifisert som vendepunkt i svingene. En slik skarp vendepunkt, men gjør ofte ikke vises i de kraft-kurver fra celler, på grunn av den lave stivhet celle (se figur 2). En MATLAB koden er utviklet for å nøyaktig finne kontaktpunktene i kraft kurverfra myke prøver ved hjelp av algoritmen foreslått av Lin et al. ^29. Koden kan håndtere de force kurver fra myke prøver, noe som gjør oss i stand til å automatisere prosessen med dataanalyse ved automatisk å søke etter kontaktpunkt og montering av innrykk data til Hertz modell. Matlab-kode er brukt for å bestemme kontaktpunktene i 60 kraft kurver tatt på samme sted av en polyakrylamidgel, hvorav den stivhet var målet å være 7,2 kPa ved bulk reologi målinger. Koden oppdaget kontakt punkter i disse kurvene. Variasjonsområdet i kontaktpunkt sted er mindre enn 15 nm. Basert på disse kontaktpunktene, er det beregnet gjennomsnittlig stivhet 6,9 kPa, er standardavviket 0,2 kPa, og maksimal variasjon 0,6 kPa. Resultater fra dette forsøk gir et mål for å vurdere den usikkerheten av den målte stivhet. Den 15 nm usikkerhet i kontaktpunktet resulterer i en usikkerhet i stivhet, som er mindre enn 10% av den midlere verdifullee. For mykere geler med meget lavt nivå av nedbøyning signal, kan usikkerheten i kontaktpunktet være så høyt som 30 nm, noe som fører til en viss usikkerhet i stivhet så høyt som 30%. Koden er tilgjengelig som et supplement til denne artikkelen.

AFM kan pålitelig måle stivhet som varierer fra mindre enn 100 Pa til 10 Pa ^6, som dekker området fra stivhet for de fleste vev og celler. For pålitelige målinger, er det viktig å velge AFM cantilevers med våren konstanter godt matchet til prøven stivhet. Når bjelkeenden er for stiv, er dens avbøyning for liten til å detektere, og det kan ødelegge cellen, hvis bjelkeenden er for myk, vil det ikke strekpunkt cellen tilstrekkelig til å oppnå pålitelige materialegenskapene og de termiske vibrasjoner kan dominere kraft kurve. Cantilevers på 0,06 N / m med en pyramide tips er aktuelt for de fleste celletyper dyrket på stive kultur retter. Disse cantilevers er imidlertid ikke aktuelt å måle celler dyrket påmyke underlag. Som vist i figur 2, er cellen dyrkes i 3000 Pa polyacrylamidgel så myke at et 3 mikrometer innrykk er nødvendig for å generere et 5 nm nedbøying av frittbærende. Kraften kurven er så flat at det er svært liten forskjell mellom for-kontakt og post-kontakt region. Dette fører til stor usikkerhet i kontaktpunktet og dermed de resulterende stivhetsverdier. Ved hjelp av en mykere cantilever bare litt bedre kontrast mellom pre-kontakt og post-kontakt regioner. Til måling slike myke materialer, er cantilevers med stor sfærisk spissen anbefales. A 0,06 N / m cantilever med en sfærisk spiss med 10 mikrometer i diameter kan brukes til å måle prøvene med lavere stivhet enn 100 Pa cantilevers med sfærisk spiss er kommersielt tilgjengelig fra mange leverandører. De kan også være skreddersydd etter liming mikrosfærer til tipless cantilevers. De sfæriske tips gi større utslag signal og hindre skader på cellemembranen. However, de gjelder ikke for høy oppløsning stivhet kartlegging på grunn av sin store kontaktflate med cellene. Tabell 1 gir en oversikt over AFM prober anbefalt for celle stivhet målinger.

Model	Fjærkonstant (N / m)	Tips Type	Tips radius (nm)
Bruker dnp10-D	0,06	Pyramid	20
Bruker MLCT-B/C/E	0.01/0.02/0.03	Pyramid	20
Novascan PT.GS	0.01/0.03/0.06	Glasskule	2000/5000/10000
Novascan PT.PS	0.01/0.03/0.06	Polystyren Sphere	1000/4500/10000

Tabell 1. A selection av AFM prober med gjeldende våren konstant og tips geometri for celle innrykk.

Begrensningene til presenterte metode bør også merkes. Hertz modell som har blitt brukt for å passe innrykk data er en forenklet modell. Det spår force-innrykk forhold for ørlille innrykk av rent elastiske materialer ved axisymmetric indenters. Noen av forutsetningene for Hertz modellen gjelder ikke cellen innrykk.

Den Hertz modellen antar homogen og lineært elastisk materiale, mens en celle er heterogen (se figur 3) og ikke-lineært elastisk. I lamellipodium regionen, er det heller inhomogene på grunn av den heterogene struktur av aktin cytoskjelettet. Den mekaniske stivhet i en celle er rapportert som gjennomsnittet stivhet hentet fra tre eller flere force kurver ervervet fra den relativt homogene oppklaring rundt kjernen regionen. ^25,36 Rekonstituert nettverks av aktin og mellomliggende filament er stamme-stive materialer, dvs. de er stivere på større deformasjoner. ^38,39 slikt en ikke-lineær elastisitet har blitt observert for levende celler, men ikke regnskapsført i Hertz modell. For å begrense effekten av ikke-lineær elastisitet på rapporterte celle stivhet, er bare de første 300 nm fra innrykket data som passer til den Hertz modellen.

Det er også lagt til grunn i Hertz modellen at materialene er rent elastisk. Imidlertid, celler og deres cytoskjelett er viskoelastiske materialer med stivhet avhengig tid skala av målinger. Ved kortere tidsskala, kommer cantilever avbøyning hovedsakelig fra den elastiske reaksjon av celler. Ved lang tid skala imidlertid kryper prøven og gir en mykere respons. Tidsskalaen av AFM innrykk styres av tips hastighet. Derfor er den observerte forskjellen i celle stivhet bare mening når de force kurvene er kjøpt med samme innrykk velobyen. For å kvantitativt trekke frekvensen avhengig viskoelastisitet av celler, har AFM "force modulasjon"-metoden er utviklet ved å bruke høyfrekvente små amplitude svingninger på et større innrykk ^21,27.

Forutsetningen om uendelig utvalg tykkelse i Hertz-modellen gjelder ikke for celler. Cellene er vanligvis noen få mikrometer tykk i oppklaring rundt kjernen regionen, og noen hundre nanometer tykk i lamell-regionen. Korreksjoner er gjort rede for endelig prøve tykkelse. ^31,40 Data innhentet fra kraft-mapping inneholder både innrykk data og celle høyde data. Lokalt prøven tykkelse kan beregnes fra de høydedata. Fremtidig arbeid er nødvendig for å gjennomføre prøven tykkelse korreksjoner i analysen for kraft-kartdata.

I sammendraget, presenterer dette papiret en protokoll for å karakterisere den mekaniske stivhet i levende celler ved hjelp av en Asylum MFP3D-Bio atomic force microscope. Prinsippene for AFM drift og MATLAB dataanalyse prosedyren gjelder for alle andre AFM-modeller. I de senere årene har optiske mikroskopi teknikker, inkludert lyse felt, konfokalmikroskopi, og total intern refleksjon fluorescens mikroskopi (TIRF) blitt slått sammen med AFM for real-time imaging av celler til mekaniske stimuli. ^41,42 Disse oppsettene også tillate samtidige målinger av cellen mekanikk og bildebehandling av de cytoskeletal komponenter. Samkjøre de lokale stivhet data til distribusjon av lokale cytoskeletal komponenter vil gi innsiktsfull informasjon om hvordan de cytoskeletal komponenter bidrar til celle mekanikk.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Atomic Force Microscope	Asylum Research	MFP3D-BIO