Mätning av mekaniska egenskaper i levande celler Använda Atomkraftsmikroskopi

Summary

Detta dokument visar ett protokoll för att karakterisera de mekaniska egenskaperna hos levande celler genom mikrointryckt använder ett atomkraftsmikroskop (AFM).

Abstract

Mekaniska egenskaper hos celler och extracellulär matris (ECM) spelar viktiga roller i många biologiska processer inklusive stamceller differentiering, tumörbildning, och sårläkning. Förändringar i styvhet av celler och ECM är ofta tecken på förändringar i cellens fysiologi eller sjukdomar i vävnader. Därför är cell stelhet ett index för att utvärdera statusen av cellkulturer. Bland de många metoder som används för att mäta styvheten hos celler och vävnader, ger mikro-indrag använder ett atomkraftsmikroskop (AFM) ett sätt att tillförlitligt mäta styvheten hos levande celler. Denna metod har i stor utsträckning för att karakterisera den mikroskala styvhet för en mängd olika material, från metallytor för att mjuka biologiska vävnader och celler. Den grundläggande principen för denna metod är att dra in en cell med en AFM spets vald geometri och mäta den applicerade kraften från böjningen av AFM fribärande. Montering av kraft-indrag kurva till Hertz-lägetl för motsvarande spets geometri kan ge kvantitativa mätningar av material styvhet. Denna uppsats visar proceduren för att karakterisera styvheten hos levande celler med användning av AFM. Viktiga steg, inklusive arbetet med AFM kalibrering, kraft-kurvan förvärv, och data analys med en MATLAB rutin demonstreras. Begränsningar av denna metod diskuteras också.

Introduction

Mekaniska egenskaper, särskilt styvhet, i enskilda celler och deras omgivande extracellulära matriser (ECM) är kritisk för många biologiska processer, inklusive celltillväxt, motilitet, division, differentiering, och vävnad homeostas. ¹ Det har visats att celler mekanisk styvhet i huvudsak bestäms av cytoskeletonen, särskilt de nätverk av aktin och intermediära filament och andra proteiner associerade med dem. ² Resultat från mekaniska tester på in vitro nätverk av aktin och intermediära filament antyder att cellen mekanik är i hög grad beroende av den cytoskeletal struktur och pre-stress i cytoskelettet. ^3-5 Styvhet av levande celler är sedan betraktas som ett index för att utvärdera cytoskelettala strukturen ^6, myosin aktivitet ⁷ och många andra cellulära processer. Ännu viktigare, är förändringar i cellernas mekaniska egenskaper också ofta visat sig vara nära intresseföretagpade med olika sjukdomstillstånd, såsom tumörbildning och metastas ^8-10 Övervakning mekanisk styvhet levande celler därför kan ge ett nytt sätt att övervaka cellens fysiologi;. att upptäcka och diagnostisera sjukdomar ^8,. samt att utvärdera effektiviteten av läkemedelsbehandling ^{11 , 12}

Flera metoder inklusive partikel-tracking microrheology, ^13-16 magnetisk vridning cytometri, ¹⁷ mikropipett aspiration ^18,19 och mikrointryckt ^20-22 har tagits fram för att mäta elasticiteten i cellerna. Particle tracking microrheology spårar termiska vibrationer av antingen submikrona fluorescerande partiklar injiceras i celler eller referensmärken markörer inuti cellen cytoskelettet. ²³ Elastiska och viskösa egenskaper hos celler är beräknade från de uppmätta partikel förskjutningar med hjälp av fluktuation-försvinnande sats. ^14,23 Denna metod medger samtidiga mätningar av lokalmekaniska egenskaper med hög rumslig upplösning på olika platser i en cell. Dock kan injicera fluorescerande partiklar i celler leda till förändringar i cellulär funktion, cytoskeleton struktur, och därmed även mekanik cell. Den mikropipett aspiration metoden gäller undertryck i en mikropipett med en diameter varierande från 1 till 5 um för att suga en liten bit av cellmembranet in i pipetten. Cell styvhet beräknas från den tillämpade undertryck och cellmembranet deformation. ¹⁸ Denna metod är dock inte kan detektera ojämn fördelning av stelhet över cellen. Magnetisk vridning cytometri (MTC) gäller magnetfält för att generera vridmoment på super paramagnetiska kulor fästa till cellmembranet. ¹⁷ Cell styvhet härleds i denna metod från sambandet mellan det applicerade momentet och den vridande deformation av cellmembranet. Det är svårt att kontrollera placeringen av magnetiska pärlor i MTC metoden, och det är också challenging att karakterisera vridande deformation med hög upplösning. Mikrointryckt tillämpar en indenter med väldefinierad geometri att stansa in i cellen. Den tandade kraft och den resulterande fördjupning i celler följer ofta förutsägelsen av Hertz modellen. Youngs moduler av celler kan beräknas ur kraft-indrag kurvor genom att montera dem till Hertz modellen. Denna metod har i stor utsträckning för att testa de mekaniska egenskaperna hos vävnader och celler trots av dess begränsningar såsom osäkerhet i kontaktpunkt bestämning, tillämpligheten av Hertz-modellen, och potentialen att fysikaliskt skada cellerna. Bland de många anordningar för microindentaion ^20, är den atomkraftsmikroskop (AFM) kommersiellt tillgängliga och har i stor utsträckning för att karakterisera mekaniska egenskaper hos levande celler och vävnader ^21,24-27.

Denna uppsats visar förfarandet med att använda en asyl-MFP3D-Bio AFM att karakterisera cell mekanik. AFM inte påly ger hög upplösning topografi av celler men också har i stor utsträckning för att karakterisera de mekaniska egenskaperna hos vävnadsceller. Principen för AFM fördjupning illustreras i figur 1. AFM fribärande närmar cellen från några få mikrometer uppåt, kommer i kontakt med cellen; strecksatserna cellen så att den fribärande avböjning når en förvald uppsättning punkt, och drar bort från cellen. Under denna process fribärande avböjning registreras som en funktion av dess läge som visas i figur 1. Innan kontakt med cellen, förflyttar fribärande i mediet utan någon påtaglig avböjning. När indrag på cellen, de böjer fribärande och deformationen ökar signal. De utliggare modelleras som elastiska balkar så att deras böjning är proportionell mot kraften som anbringas på cellen. Genom att ställa in den maximala fribärande böjning, är den maximala storleken på kraft på provet begränsas för att undvika dAmage till celler. Den del av den kraft kurvan från punkt B till punkt C i Fig. 1, där spetsen strecksatserna in i cellen, är lämplig att den hertz modellen att extrahera cellen styvhet.

Figur 1. Illustration av AFM mikrointryckt och tolkning av kraftkurvan. Den övre panelen visar rörelsen hos AFM fribärande driven av den piezo skannern. Den vertikala placeringen av fribärande z och den fribärande avböjningssignalen d registreras under processen. Den fribärande startar från punkt a, några mikrometer ovanför cellen. Samtidigt närmar cellen, förblir provet indrag δ noll tills den når punkt b, där spetsen kommer i kontakt med cellen. Koordinaterna för punkten B i komplotten är kritiska värdenför dataanalys, betecknat med (z _0, d _0>). Från B till C, konsolpartierna strecksatserna in i cellen tills den fribärande avböjning når ett börvärde, som är satt att vara kvoten mellan den riktade maximal indraget kraft och den fribärande fjäderkonstant. När avböjningssignalen når det förinställda maximala värdet är fribärande sedan bort från cellen till led d, där det ofta dras nedåt, på grund tip-prov vidhäftning, lossnar från cellen och återgår till sin ursprungliga plats på e. Den högra panelen visar förhållandet mellan fördjupningen och den inspelade z och d-signal. I den nedre vänstra panelen är en plot av en representativ kraftkurva den maximala fördjupningen av en konsol, där fjäderkonstanten mäts vara 0.07N / m, är inställd på att vara 17 nm så att den maximala indraget kraft tillämpas på provet är 1,2 nN. De viktigaste platserna under fördjupningen är markerade.

Protocol

Ett. Kalibrera fjäderkonstanten hos Cantilever

1. Ladda fribärande i AFM enligt tillverkarens anvisningar. Det är nödvändigt att rengöra fribärande hållare med etanol innan några experiment. Detta kommer att bidra till att begränsa bakteriell kontamination till kultur under AFM mätningarna.
2. Kalibrera InvOLS (Inverse Optical Lever Känslighet). Denna parameter beskriver mängden fotodiod respons (volt) per nanometer av fribärande böjning.
3. Ladda en ren glasskiva på provet scenen, sedan installera AFM huvudet och justera laserstrålen och inställningen enligt tillverkarens instruktioner. Engagera AFM spets på glasskivan.
4. Med piezo återkallas, justera spegeln till en fotodiod läsning av -2 V. Utför en mätning kraft spektroskopi med en brytpunkt (max fotodiod respons) av 2 V.
5. Med piezo återkallas, justera spegeln till en fotodiod läsning av -2 V. Utför en force spektroskopi mätning med en brytpunkt (max fotodiod respons) av +2 V. Obs: Spänningsvärden här är specifika för asyl AFM. Detta värde ska ställas in i enlighet med de specifikationer som tillhandahålls av tillverkaren.
   Efter datainsamling är klar, zooma in till företaget-kontakt regionen av kraftkurvan. Utför en linjär anpassning till denna region för att hitta den lutning, som kommer att vara i V / nm. Den ömsesidiga av detta värde beskriver den optiska känsligheten för fribärande fotodiod ensemble.
6. Återställ spegeln anpassning till en fri böjning av 0 V.
7. Kalibrera den fribärande fjäderkonstant. En termisk-tune metoden används för att bestämma fjäderkonstanten hos konsolen ^28.
8. Efter kalibrering av InvOLS, höja skannern bort från provet scenen så att det inte finns några interaktioner mellan spetsen och provet.
9. Börja fånga termiska data. Under denna process, är den termiska vibrationen av konsolbalken Recorded.. AFM programvara analyserar en power-spektrum av en sådan termisk vibration och markerar den i en data-fönstret.
10. Efter några sekunder av datainsamling, utför en passning till datasegmentet centrerad vid för den lägsta frekvensen (fundamental resonans) topp för att bestämma fjäderkonstant.

2. Fylla på prov

1. Installera tillbehöret Dish Värmare på AFM scenen, om de inte redan har.
2. Ställ in temperaturen på 37 ° C, och vänta 20 min för systemet att uppnå en stabil termisk jämvikt.
3. Placera kulturen skålen på AFM scenen och fäst den med klämman som medföljer skålen värmaren. Det är viktigt att minimera tiden mellan avlägsnande av skålen från kuvösen och placerat den på scenen, för att undvika trauma till cellerna. För mätningar längre än 30 min, bör CO ₂ oberoende mediet användas för att ersätta den normala odlingsmedium.
4. Applicera en liten droppe av 37 ° C odlingsmedium till spetsen av tHan AFM fribärande, och sänk AFM huvudet tills spetsen är bara nedsänkt i vätska.
5. Använda toppvy CCD-kamera, rikta laserstrålen på fribärande (anpassningen i vätskan kommer att vara annorlunda än i luft, på grund av förändringen i brytningsindex hos mediet).
6. Engagera AFM spets på en ren yta av kulturen skålen.
7. Utför kalibrering av InvOLS såsom beskrivits ovan, för den fribärande känslighet i den flytande miljön.

Anm: a) Om celler odlas på hydrogeler bör kalibreringen av InvOLS utföras i förväg mot bottenytan av en odlingsskål fylld med cellodlingsmedia. Vid byte till cellprover, har särskild uppmärksamhet ägnas åt att inte ändra justeringen laserstrålen med fribärande. b) InvOLS måste kalibreras varje gång det föreligger en förändring i laserinriktning. c) Det rekommenderas också att ta InvOLS som genomsnittet av värdet från flera kalibreringskurvor, sedan varje kalibrering genererar en olika InvOLS. Variationen i InvOLS är emellertid liten jämföra med medelvärdet. Exempelvis kalibrering av ett Bruker DNP-10 fribärande med fjäderkonstanten 0,06 N / m i vätska genom hundra gånger producera ett medelvärde InvOLS värde av 66,3 nm / V, med standardavvikelse av endast 0,5 nm / V.

Tre. Samla Force Kurvor för Cell Indentation

1. Markera en cell för indrag. Med hjälp av den optiska mikroskop, flytta scenen för att placera fribärande ovanför cellen så att spetsen ligger i peri-kärnor region. Exakt justering av den fribärande positionen kan åstadkommas genom att applicera till offset till X-och Y-skannrar.
   Obs: AFM fribärande måste dras tillbaka från provytan medan du flyttar provet scenen för att välja ett mål cell. Detta skyddar konsolen från att knacka in i provet, eftersom provytan inte kan vara plan.
2. Växla till Force spektroskopi läget. Ställ Indraghastighet till inom området av 1-10 | im / sek, låg nog för att undvika hydrodynamiska effekter.
3. Ställ den punkt avböjning trigger, vilket begränsar den maximala indraget kraft för att undvika skador på celler. Välj Relativ utlösande alternativet, vilket kommer att korrigera för eventuell drift i avböjningssignalen. En maximal kraft 2 nN är en bra utgångspunkt för de flesta prover. Detta värde, bör dock justeras enligt provets styvhet. För mjuka prover ett lägre värde bör användas för att undvika överdriven indrag till provet. För styva prover ett högt värde bör användas för att generera mätbara indrag.
4. Ställ den kraft avstånd tillräckligt stor för att säkerställa att spetsen kommer att vara fullt lösgöras från cellen mellan kraftmätningar. Vanligtvis är den kraft avstånd satt till 5 um.
5. Befalla AFM att ta en enda kraft kurva.
6. Samla minst tre kraft kurvor på olika platser i peri-kärnorna region i varje cell. Även om det är fördelaktigt att ta multipelkurvor på varje cell för tillförlitlig statistik, med alltför många kraft kurvorna kan leda till förändringar i cellens styvhet på grund av stress från AFM sonden.
7. När datainsamlingen är klar, dra spetsen, och upprepa steg 3,1-3,6 för så många celler som behövs för goda statistiska uppgifter om cell styvhet under ett visst prov tillstånd. Vanligtvis är 30 celler mäts för varje tillstånd.

Att karaktärisera fördelningen av styvheten i en enda cell, är kraft-map-läge tillämpas. I Force-kartan, ställ en scanningsstorleken att omfatta regionen av intresse, fastställa en lämplig upplösning, ange indrag parametrar som de som valts för enad kraft kurvor, AFM kommer då raster över definierade provområde och ta enad kraft kurvor vid varje pixel i provregionen.

4. Data Analysis

De inspelade kraft kurvorna analyseras med hjälp av en anpassad MATLAB procedur för att beräkna cellen styvhet. Nedan följer en kort beskrivning av MATLAB förfarande:

1. MATLAB-programmet identifierar kontaktpunkt samordnar z0 och d0 (se figur 1) med hjälp av en algoritm som antagits av en publicerad metod Lin et al ^29.:
2. För varje datapunkt i kraftkurva utföra en linjär anpassning av data till vänster om den punkt av intresse, och en Hertz modell passar till höger (med den valda punkten som den första kontaktpunkten), upp till den inställda maximal inbuktning (200-300 nm rekommenderas).
3. För varje punkt, beräkna den relativa RMS fel både anfall och summera dessa värden.
4. Den punkt som uppnår den minsta totala passande felet är vald som första kontaktpunkten.
   Obs Computation tid kan minskas genom att genomföra en gyllene-avsnitt sök snarare än linjärt skanna hela kraftkurvan.
5. Prov deformation δ och indrag kraften F beräknas som:
   
6. En minsta kvadrat montering appliceras passa F vs δ data i den post-kontaktområdet, z ≥ z _0, till Hertz modell för att extrahera Youngs modul, E av cellen:
   
   , Där v är Poissons tal.
   Obs: När δ är mer än 10% av provets tjocklek (cell höjd), är den uppmätta cell styvhet påverkas av substratet styvhet. Tjockleken av peri-nukleära regionen är vanligtvis i storleksordningen några få mikrometer. Därför är bara de första 200-300 nm i F-δ kurva passar till Hertz modellen.

Representative Results

Figur 2a visar tre kurvor representativ kraft tas från 3T3-fibroblaster odlade på plastyta, polyakrylamidgel av Youngs moduler 3.000 Pa och 17.000 Pa, respektive. Efter att noggrant identifiera kontaktpunkter i kurvorna är indraget kraften som funktion av cellens deformation plottas i figur 2b. Under en kraft storleksordning mindre än 0,3 nN, pyramidform tips strecksatserna 3 mikrometer i en cell odlad på en 3 kPa polyakrylamidgel. Däremot är en kraft mer än 1,6 nN krävs att indentera 500 nanometer in i cellen som odlas på vanligt odlingsskål med samma dricks. Det framgår av detta diagram att cellen odlades på mjuk polyakrylamidgel är mjukare än cellen odlades på den styva odling skålen. Montering av första segmentet (δ <30 nm) av kraft-δ kurvor till Hertz modellen ger Youngs moduler av dessa tre celler som 10 kPa, 1,2 kPa, och 1,10 kPa resp. Celler på culture skålen är 100 gånger styvare än celler odlade på polyakrylamidgeler. Solon et al. Har rapporterat liknande resultat ^25. De fann att fibroblaster aktivt skärper sin cytoskeletons att matcha styvheten av substrat de följer. Många andra celltyper har också rapporterats att bli hårdare när de odlas på styvare substrat ^30.

Det är viktigt att notera att fördjupningen kan orsaka plastisk deformation i celler, vilket resulterar kinks såsom illustreras i den lila kurvan. Normalt skall sådana kurvor uteslutas från dataanalysen. Däremot kan kurvan fortfarande användas för att beräkna cell styvhet om kink är utanför intervallet passande uppgifter. Till exempel uppstår den kink i den lila kurvan vid ca 400 nm. Denna kurva kan fortfarande analyseras genom anpassning av data endast upp till δ = 30 nm till Hertz modellen för att ge ett styvhetsvärde av 1,2 kPa. Det är också viktigt att justera "utlösande punkten" enligt the prov stelhet. Till exempel är den blå kurvan tas från en mjuk cell odling på ett 3 kPa polyakrylamidgel. Inställning av relativa punkt avböjning trigger på 5 nm, AFM spets indrag 3 mikrometer in i cellen. En så stor inbuktning bör förhindras under mätningarna cell stelhet, eftersom det kan brista cellmembranet och döda cellen. Många andra faktorer, inklusive spetsen hastighet och datainsamling takt under kraftkurvan förvärvet kan påverka kvaliteten på laga kraft kurvor och därmed den resulterande styvhet av celler ^31. För att göra tillförlitliga mätningar är det nödvändigt att justera alla dessa parametrar för att skaffa "rena" kraft kurvor som den röda kurvan visas i figur 2a, som har en plan pre-kontakt delen följt av en icke-linjär ökning post-kontakt ingår.

Figur 3a visar en fluorescens bild från en 3T3-fibroblast på en cellodlingsskål. Cellen är transfekterad med GFP vimentin,en typ av intermediära filament. AFM Force-kartläggning har utförts i detta 80 pm med 80 um område, med en upplösning på 32 x 32 pixlar. Den resulterande styvhet kartan visas i figur 3b. Styvheten varierar över cellen. Och, är det lamellipodium regionen styvare och mer heterogen än den peri-nukleära området som omger den styva kärnan.

Figur 2. Kraftkurva data och analyserade kraft-indrag kurva. A) En uppsättning av tre kurva representativa kraftdata förvärvats för 3T3 fibroblaster odlade på glas (rött), 17 kPa polyakrylamidgel (lila), och 3 kPa polyakrylamidgel (blå). Kurvorna skiftas så att kontaktpunkten (z _0, d ₀₎ är belägen vid origo (0,0) för koordinaternasystemet. b) De indrag-force kurvor beräknas från a) och montering av fördjupningen data till Hertz modell med endast de första 300 nm indrag. Inset i b) visar godhet passar till Hertz modell för de första 300 nm av indrag, cirklar är experimentella data, linjerna representerar de passar data. Fjäderkonstanten av fribärande är 0,062 N / m i det här fallet.

Figur 3. a) Fluorescens bild av en 3T3 fibroblast transfekterad med GFP vimentin. Endast en del av cellen visas i bilden. Skala stapel representerar 20 mikrometer. B) Ett 32 x 32 bildpunkter styvhet karta över samma område. Varje pixel representerar 2,5 um.

Discussion

AFM indrag metod har sina fördelar att karakterisera mekaniska egenskaper hos levande celler. Än mindre känslig än den magnetiska vrida cytometry och optisk pincett, som kan mäta krafter på piconewton nivå ^32, kan AFM upptäcka motståndet kraft från prover som sträcker sig från tiotals pico-Newton till hundratals nano-Newton, jämförbara med allt våld som kan tillämpas på celler med användning av en mikropipett ^19. Denna serie av våld passar behoven att skapa mätbara deformationer i alla typer av celler ^19. Den hög rumslig upplösning gör det möjligt att karakterisera på submikron nivå de heterogeniteter i vävnad och inom enskilda celler ^33. Det gör också realtid levande cell mätningar. Flera AFM modeller för biologiska prover kan fungera i en flytande miljö och är utrustade med uppvärmda prov stadier, som ger exakt temperaturkontroll, vilket gör det möjligt att upprätthålla en fysiologisk miljöjön för levande celler under mätningarna. AFM fördjupning har framgångsrikt tillämpats för att mäta de mekaniska egenskaperna hos en rad olika celltyper, ^25,34-36 och har använts i stor utsträckning för att utvärdera förändringar i mekaniska egenskaper hos celler associerade med cellulär differentiering och i olika diseased sammanhang. ^30,37

Ett viktigt steg för att beräkna styvheten från kraft-kurvan är att identifiera den punkt där spetsen först kommer i kontakt med cellen. Osäkerheten i kontaktpunkten kan påverka elasticitetsmodulen ^31. För styva material, ökar avböjningssignalen abrupt efter spetsen-sample kontakt, och kontaktpunkten lätt identifieras som vändpunkt i kurvorna. En sådan kraftig vändpunkt, men ofta inte förekommer i kraft-kurvor från celler, på grund av den låga cellen styvhet (se figur 2). Ett MATLAB-kod är utvecklat för att exakt hitta kontaktpunkterna i kraft kurvorfrån mjuka prover med användning av algoritmen föreslås av Lin et al. ²⁹ Koden kan hantera kraft kurvorna från mjuka prover, vilket gör att vi kan automatisera processen för dataanalys genom att automatiskt söka efter kontaktpunkten och inpassning av indrag data till Hertz modell. MATLAB-koden används för att bestämma kontaktpunkterna i 60 tvingar kurvor tagna på samma plats för en polyakrylamidgel, där styvheten var åtgärden att vara 7,2 kPa från bulk reologi mätningar. Koden upptäckt kontaktpunkter i dessa kurvor. Utbudet av variationen i kontaktpunkten läge är mindre än 15 nm. Utifrån dessa kontaktpunkter, är den beräknade genomsnittliga styvheten 6,9 kPa, är standardavvikelsen 0,2 kPa, och den maximala variationen 0,6 kPa. Resultat från detta experiment ger ett mått för att utvärdera osäkerheten i den uppmätta styvheten. Den 15 nm osäkerheten i resultaten kontaktpunkt i en osäkerhet i styvhet, vilket är mindre än 10% av medelvärdet värderingse. För mjukare geler med mycket låg nivå av avböjningssignalen, kan osäkerheten i kontaktpunkten vara så hög som 30 nm, vilket leder till en osäkerhet i styvhet så hög som 30%. Koden finns som ett komplement till den här artikeln.

AFM kan tillförlitligt mäta styvheten varierar från mindre än 100 Pa till 10 ⁶ Pa, som täcker olika styvhet för de flesta vävnader och celler. För tillförlitliga mätningar, är det viktigt att välja AFM utliggare med fjäderkonstanterna väl matchade till provet styvhet. När den fribärande är alltför styv, är dess avböjning för liten för att detektera och det kan skada cellen, om den fribärande är för mjuk, kommer det inte strecksatsen cellen tillräckligt för att erhålla tillförlitliga materialegenskaper och dess termiska vibrationer kan dominera kraftkurvan. Utliggare av 0,06 N / m med en pyramid tips gäller för de flesta celltyper odlade på styva kultur rätter. Dessa konsoler är dock inte tillämplig för att mäta celler odlade påmjuka substrat. Såsom visas i figur 2, är cellen odlades på en 3000 Pa polyakrylamidgel så mjuka att en 3 xm inbuktning krävs för att generera en 5 nm nedböjning i den fribärande. Kraften kurvan är så platt att det är mycket liten skillnad mellan den pre-kontakt och efter kontakt region. Detta leder till stora osäkerheten i kontaktpunkten och därmed de resulterande värdena stelhet. Använda en mjukare fribärande endast något förbättrar kontrasten mellan den pre-kontakt och efter kontakt regioner. Att mäta sådana mjuka material, utliggare med stora sfäriska spets rekommenderas. A 0,06 N / m fribärande med en sfärisk spets 10 mikrometer i diameter kan tillämpas för att mäta prover med styvhet lägre än 100 Pa utliggare med sfärisk spets är kommersiellt tillgängliga från många leverantörer. De kan också vara specialtillverkad vid limning mikrosfärer till tipless utliggare. De sfäriska tips ger större avböjningssignalen och förhindra skador på cellmembranet. However, är de inte tillämpliga för högupplösta styvhet kartläggning på grund av sin stora kontaktyta med cellerna. Tabell 1 innehåller en förteckning över AFM sonder rekommenderas för mätningar cell stelhet.

Modell	Spring konstant (N / m)	Tip Type	Spetsradie (nm)
Bruker DNP10-D	0,06	Pyramid	20
Bruker MLCT-B/C/E	0.01/0.02/0.03	Pyramid	20
Novascan PT.GS	0.01/0.03/0.06	Glaskula	2,000 / 5,000 / 10,000
Novascan PT.PS	0.01/0.03/0.06	Polystyren Sphere	1,000 / 4,500 / 10,000

Tabell 1. A SEling av AFM sonder med gällande fjäderkonstant och dricks geometri för cell indrag.

Begränsningarna av den presenterade metoden bör också märkas. Hertz modell som har tillämpats för att passa indraget uppgifterna är en förenklad modell. Det förutspår kraft-indrag relation för oändligt små fördjupningar rent elastiska material genom axialsymmetriska indentorer. Några av antagandena i Hertz modellen gäller inte cellen indraget.

Hertz Modellen förutsätter homogent och linjärt elastiskt material, medan en cell är heterogen (se figur 3) och icke-linjärt elastiskt. I lamellipodium regionen, är det ganska inhomogen på grund av den heterogena struktur actincytoskeletonen. Den mekaniska styvheten hos en cell redovisas som den genomsnittliga styvheten ur tre eller mer kraft kurvor förvärvats från den relativt homogena perinukleära området. ^25,36 Färdigberedd nätverksinställningarks av aktin och mellanliggande filament är stam-styva material, dvs de är styvare vid större deformationer. ^38,39 sådan olinjär elasticitet har observerats för levande celler, men inte redovisas i Hertz modellen. För att begränsa effekten av olinjära elasticitet på rapporterade cellen styvhet, är bara de första 300 nm av indrag uppgifter passar till Hertz modellen.

Det antas också i Hertz modellen att materialen är rent elastisk. Men celler och deras cytoskeleton är viskoelastiska material med stelhet beroende på tidsskalan för mätningarna. Vid kortare tidshorisont, kommer den fribärande deformationen huvudsakligen från den elastiska respons av celler. På lång tidsskala, dock kryper provet och ger en mjukare respons. Tidsskalan för AFM indrag styrs av spets hastighet. Därför är den observerade skillnaden i cell stelhet endast meningsfull när den kraft kurvorna förvärvas med samma indrag velostad. För att kvantitativt utvinna frekvensberoende viskoelasticiteten av celler, har AFM "force modulation" metod utvecklats genom tillämpning av högfrekventa små amplitud svängningar på en större fördjupning ^21,27.

Antagandet av oändlig provtjockleken i Hertz modellen gäller inte för celler. Cellerna är vanligen några mikrometer tjock i perinukleära regionen, och ett par hundra nanometer tjocka hinnan regionen. Korrigeringar har gjorts för att ta hänsyn till den finita provtjockleken. ^31,40 Data som förvärvats från kraft-mapping innehåller både indrag data och celldata höjd. Lokala provtjockleken kan beräknas ur höjddata. Framtida arbete krävs för att genomföra korrigeringar provtjocklek i analysen för kraft-kartdata.

Sammanfattningsvis visar denna uppsats ett protokoll för att karakterisera den mekaniska styvheten av levande celler med hjälp av en Asylum MFP3D-Bio atomic force MICRoscope. Principerna för AFM drift och MATLAB dataanalys förfarande gäller för alla andra AFM-modeller. Under de senaste åren har optisk mikroskopi tekniker inklusive ljusa fält, konfokalmikroskopi, och total intern reflektion fluorescens mikroskopi (TIRF) kombinerats med AFM i realtid avbildning av celler till mekaniska stimuli. ^41,42 Dessa inställningar också möjliggöra samtidiga mätningar av cell mekanik och avbildning av cytoskelettala komponenter. Korrelera den lokala styvheten data till distribution av lokala cytoskeletal komponenter kommer att ge viktig information om hur de cytoskelettala komponenter bidrar till cell mekanik.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Atomic Force Microscope	Asylum Research	MFP3D-BIO