Medir as propriedades mecânicas das células vivas Usando Microscopia de Força Atômica

Summary

Este documento revela um protocolo para caracterizar as propriedades mecânicas de células vivas por meio de microindentação utilizando um microscópio de força atómica (AFM).

Abstract

As propriedades mecânicas das células e da matriz extracelular (ECM) desempenham papéis importantes em muitos processos biológicos, incluindo a diferenciação de células estaminais, a formação de tumores e cicatrização de feridas. Alterações na rigidez de células e de ECM são frequentemente sinais de alterações na fisiologia da célula ou doenças em tecidos. Assim, a rigidez da célula é um índice para avaliar a qualidade de culturas de células. Entre a multiplicidade de métodos aplicados para medir a rigidez das células e tecidos, micro-recuo usando um Microscópio de Força Atômica (AFM) fornece uma maneira de medir de forma confiável a rigidez das células vivas. Este método tem sido amplamente utilizado para caracterizar a rigidez em micro-escala de uma variedade de materiais que vão desde as superfícies metálicas para os tecidos moles e as células biológicas. O princípio básico deste método é recuar um celular com uma ponta do AFM da geometria selecionada e medir a força aplicada a partir da flexão do cantilever AFM. Montagem da curva força-recuo para o modo de Hertzl para a geometria da ponta correspondente pode dar medições quantitativas de rigidez do material. Este documento revela o procedimento para caracterizar a rigidez de células vivas utilizando AFM. Etapas-chave, incluindo o processo de AFM calibração, aquisição de força curva, e análise de dados usando uma rotina MATLAB são demonstrados. As limitações deste método também são discutidos.

Introduction

As propriedades mecânicas, em especial a rigidez, de células individuais e as suas áreas de matrizes extracelulares (ECM) são críticos para muitos processos biológicos incluindo o crescimento celular, motilidade, divisão, diferenciação e na homeostase de tecido. ^Uma Foi demonstrado que a rigidez mecânica da célula é determinada principalmente pela do citoesqueleto, em particular as redes de filamentos de actina e intermédios e outras proteínas associadas a eles. ² Resultados dos testes mecânicos nas redes em in vitro de filamentos de actina e intermediários sugerem que os mecanismos celulares é em grande parte dependente da estrutura do citoesqueleto e a pré-tensão no o citoesqueleto. ^3-5 Rigidez de células vivas é então considerado como um índice para avaliar a estrutura do citoesqueleto ^{6, 7} e actividade miosina muitos outros processos celulares. Mais importante ainda, as alterações nas propriedades mecânicas das células são também frequentemente encontrado para ser estreitamente associadaciado a várias condições de doença, tais como a formação de tumores e metástases ^8-10 Controlo da rigidez mecânica de células vivas podem, portanto, proporcionar uma nova forma de controlar a fisiologia da célula,. de detectar e diagnosticar doenças ^8,. e para avaliar a eficácia dos tratamentos com medicamentos ^{11 , 12}

Vários métodos, incluindo microrheology partícula de rastreamento, ^13-16 citometria de torção magnética, ¹⁷ micropipeta aspiração microindentação ^18,19 e ^20-22 foram desenvolvidos para medir a elasticidade das células. Partícula de rastreamento microrheology traça as vibrações térmicas, tanto de partículas submicrométricas fluorescentes injectados em células ou marcadores fiduciais dentro do citoesqueleto celular. ²³ propriedades elásticas e viscosas de células são calculados a partir dos deslocamentos de partículas medidos usando o teorema de dissipação de flutuação. ^14,23 Este método permite medições simultâneas de locaispropriedades mecânicas com alta resolução espacial em diferentes lugares em uma célula. No entanto, a injeção de partículas fluorescentes em células pode levar a alterações na função celular, a estrutura do citoesqueleto, e, portanto, a mecânica da célula. O método aplica-se a aspiração de pressão negativa micropipeta em uma micropipeta de diâmetro variando entre 1 e 5 um para chupar um pequeno pedaço de membrana celular para a pipeta. Rigidez das células é calculada a partir da pressão negativa aplicada e deformação da membrana celular. ¹⁸ Este método, no entanto, não é possível detectar a distribuição heterogénea da rigidez em toda a célula. Citometria de torção magnética (MTC) se aplica o campo magnético para gerar binário em grânulos super-paramagnéticas ligadas à membrana celular. Celular rigidez ¹⁷ é derivado no presente método a partir da relação entre o binário aplicado e a deformação de torção da membrana celular. É difícil controlar a localização das esferas magnéticas no método MTC, e é também challenging a caracterizar a deformação de torção, com alta resolução. Microindentação aplica um penetrador com uma geometria bem definida, para perfurar na célula. A força de recuo e o recuo, resultando em células seguem frequentemente a previsão do modelo Hertz. Módulos de Young de células pode ser calculada a partir das curvas de força de recuo, equipando-os com o modelo Hertz. Este método tem sido amplamente utilizado para testar as propriedades mecânicas do tecido, e as células, apesar de as suas limitações, tais como a incerteza na determinação do ponto de contacto, a aplicabilidade do modelo de Hertz, e o potencial para danificar fisicamente as células. Entre os muitos dispositivos para microindentaion ^20, o Microscópio de Força Atômica (AFM) está disponível comercialmente e tem sido amplamente aplicada para caracterizar as propriedades mecânicas das células vivas e tecidos ^21,24-27.

Este trabalho demonstra o procedimento de usar um Asylum MFP3D-Bio AFM para caracterizar mecânica celulares. AFM não emly fornece topografia de alta resolução das células, mas também tem sido amplamente aplicada para caracterizar as propriedades mecânicas das células dos tecidos. O princípio da AFM recuo é ilustrada na Figura 1. O braço de suporte de AFM se aproxima da pilha de alguns micrómetros acima; faz contacto com a célula, travessões, a célula de modo que a deformação do cantilever atinge um ponto de ajuste pré-seleccionado, e puxa para fora da célula. Durante este processo, a deformação do cantilever é registada como uma função da sua posição, como mostrado na Figura 1. Antes de fazer o contacto com a célula, o cantilever se move no meio sem qualquer deflexão aparente. Quando recuo sobre a célula, as curvas em cantilever e os aumentos de sinal de deflexão. As vigas são modeladas como vigas elásticas, de modo que a sua deformação é proporcional à força aplicada à célula. Ao definir a deflexão máxima cantiléver, a magnitude da força máxima aplicada à amostra é limitado para evitar dAmage às células. A parte da curva de força a partir do ponto b ao ponto C na Figura 1, onde os travessões da ponta para dentro da célula, está apto para o modelo hertz para extrair a rigidez da célula.

Figura 1. Ilustração da AFM microindentação e interpretação da curva de força. O painel superior mostra o movimento de AFM cantilever impulsionado pelo scanner piezo. A localização vertical do braço de suporte e o braço de suporte z deflexão d sinal é registado durante o processo. O braço de suporte começa a partir de um ponto, alguns micrómetros acima da célula. Ao aproximarem-se da célula, o recuo δ amostra permanece zero até atingir o ponto b, onde a ponta entra em contacto com a célula. As coordenadas do ponto b no gráfico são os valores críticospara a análise de dados, indicado por (z _0, d _0>). De b para c, os travessões cantilever na célula até que a deflexão do cantilever atinge um ponto de ajuste, que é definido como sendo a relação entre a força de recuo máximo alvo ea constante da mola cantilever. Uma vez que o sinal de deflexão atinge o valor máximo pré-definido, o cantilever é então retirado a partir da célula até ao ponto d, em que, muitas vezes, ser puxado para baixo devido à adesão de ponta-amostra, destaca a partir da célula e retorna à sua posição inicial em E. O painel da direita mostra a relação entre a reentrância e o sinal gravado e z d. Em no painel inferior esquerdo é um gráfico de uma curva representativa de força, o recuo máximo de um braço de suporte, das quais a constante de mola é medido para ser 0.07N / m, é ajustado para ser de 17 nm, de modo que a máxima força de recuo aplicada ao amostra é de 1,2 nN. Os locais-chave durante o recuo são marcadas.

Protocol

1. Calibrar a constante da mola do cantilever

1. Carregar o cantilever na AFM de acordo com as instruções do fabricante. É necessário limpar o titular do cantilever com etanol antes de todas as experiências. Isto irá ajudar a limitar a contaminação da cultura bacteriana durante as medidas de AFM.
2. Calibrar InvOLS (sensibilidade Lever Optical Inverse). Este parâmetro descreve a quantidade de resposta do fotodiodo (Volts) por nanómetro de deflexão do cantilever.
3. Coloque uma lâmina de vidro limpa para o estágio da amostra, em seguida, instala na cabeça AFM e ajustar o alinhamento do feixe de laser e de acordo com as instruções do fabricante. Envolver a ponta do AFM sobre a lâmina de vidro.
4. Com o piezo retirado, realinhar o espelho para uma leitura fotodiodo de -2 V. realizar uma medição de espectroscopia de força com um ponto de disparo (resposta máxima fotodiodo) de 2 V.
5. Com o piezo retirado, realinhar o espelho para uma leitura fotodiodo de -2 V. Realizar uma force medição espectroscopia com um ponto de disparo (resposta máxima fotodiodo) de 2 V. Nota: Os valores de tensão aqui são específicas para o Asilo AFM. Esse valor deve ser definido de acordo com as especificações fornecidas pelo fabricante.
   Após a aquisição de dados está completa, o zoom para a região de contacto de firme a curva da força. Realizar um ajuste linear a esta região para encontrar o declive, o que irá estar em V / nm. O valor recíproco da presente descreve a sensibilidade óptica do conjunto cantilever fotodiodo.
6. Redefinir o alinhamento espelho para uma deflexão livre de 0 V.
7. Calibrar a mola cantilever constante. Um método térmico de sintonia é usado para determinar a constante de mola cantilever ^28.
8. Após calibragem dos InvOLS, aumentar o scanner afastada da fase da amostra de tal modo que não há interacções entre a ponta ea amostra.
9. Começar a capturar dados térmicos. Durante este processo, a vibração térmica do cantilever é Recorded. O software AFM analisa um espectro de uma vibração e parcelas em uma janela de dados térmica tal poder.
10. Depois de alguns segundos de aquisição de dados, executar um ajuste para o segmento de dados centralizada ao menor frequência (ressonância fundamental), pico de determinar a constante da mola.

2. Carregando o Sample

1. Instale o acessório aquecedor Dish no palco AFM, se já não estiver equipada.
2. Ajustar a temperatura para 37 ° C, e esperar, durante 20 minutos para que o sistema atinja um equilíbrio térmico estável.
3. Colocar a placa de cultura na fase de AFM e fixá-lo usando a braçadeira fornecida com o aquecedor de prato. É importante minimizar o tempo entre a remoção do prato da incubadora e colocando-o sobre o palco, para evitar o trauma para as células. Para medições mais longos do que 30 minutos, ₂ médias independentes CO deveria ser utilizada para substituir o meio de cultura normal.
4. Aplicar uma pequena gota de 37 ° C, meio de cultura para a ponta de tele AFM cantilever, e baixar a cabeça até a ponta do AFM é apenas submerso no líquido.
5. Utilizando a câmara superior com vista CCD, realinhar o feixe de laser sobre o braço de suporte (o alinhamento no estado líquido irá ser diferente do que no ar, devido à alteração no índice de refracção do meio).
6. Envolver a ponta do AFM em uma área limpa da placa de cultura.
7. Executar a calibragem dos InvOLS como acima descrito, para a sensibilidade do cantilever no meio líquido.

Nota: a) Se as células são cultivadas em hidrogéis, a calibração de InvOLS devem ser realizados em avanço contra a superfície de fundo de um prato de cultura cheio com meio de cultura celular. Ao mudar para amostras de células, uma atenção especial deve ser dada para não mudar o alinhamento do feixe de laser com o cantilever. b) InvOLS tem de ser recalibrada sempre que houver uma alteração no alinhamento do laser. c) Recomenda-se também a tomar InvOLS como a média de valor de várias curvas de calibração, sesde a cada calibração que gera um diferente InvOLS. A variação no InvOLS é, contudo, pequena em comparação com o valor médio. Por exemplo, calibrar um Bruker DNP-10 cantilever com constante de 0,06 N / m em líquido por 100 vezes primavera produzir um valor médio InvOLS de 66,3 nm / V, com desvio padrão de apenas 0,5 nm / V.

3. Coleta de curvas força de recuo celular

1. Selecione uma célula para recuo. Com o auxílio do microscópio óptico, a fase de mover a posição do braço de suporte acima da pilha de modo que a ponta está situada na região peri-núcleos. Ajuste preciso da posição do braço de suporte pode ser conseguida através da aplicação de deslocamentos para o X e Y scanners.
   Nota: O cantilever AFM tem de ser retirado da superfície da amostra, enquanto se deslocam a fase de amostra para seleccionar uma célula alvo. Isso protege o cantilever de bater na amostra, uma vez que a superfície da amostra não pode ser plana.
2. Mudar para forçar o modo de Espectroscopia. Definir o recuotaxa dentro da gama de 1-10 mM / seg, suficientemente baixa para evitar efeitos hidrodinâmicos.
3. Definir o ponto de disparo de deflexão, que limita a força de recuo máximo para evitar danos para as células. Seleccione a opção de disparo relativo, que irá corrigir qualquer desvio no sinal de deflexão. A força máxima de 2 nn é um bom ponto de partida para a maioria das amostras. Este valor, no entanto, devem ser ajustados de acordo com a rigidez da amostra. Para as amostras macias um valor mais baixo deve ser usado para evitar o recuo excessivo para a amostra. Para amostras rígidas um valor alto deve ser usado para gerar recuo mensurável.
4. Definir a distância força suficientemente grande para garantir que a ponta estará completamente separada da célula entre as medições de força. Geralmente, a distância força é fixado em 5 um.
5. Comandar o AFM para tomar uma curva de força única.
6. Recolher pelo menos três curvas de força em diferentes locais na região peri-núcleo de cada célula. Embora seja vantajoso ter múltiplascurvas em cada célula de dados estatísticos fiáveis, tendo muitas curvas de força pode levar a mudanças na rigidez da célula devido ao estresse da sonda AFM.
7. Quando a coleta de dados estiver concluída, retire a ponta, e repita os passos de 3,1-3,6 para o maior número de células, conforme necessário para bons dados estatísticos sobre a rigidez da célula sob uma determinada condição de amostra. Normalmente, as células 30 são medidos para cada condição.

Para caracterizar a distribuição de rigidez dentro de uma única célula, o modo de mapa de força é aplicada. No modo Force-mapa, definir um tamanho de digitalização para incluir a região de interesse, definir uma resolução adequada, definir os parâmetros de recuo como os selecionados para as curvas de força única, o AFM será então raster em toda a área da amostra definida e ter curvas única força em cada pixel na região da amostra.

4. Análise de Dados

As curvas de força registados são analisados ​​utilizando um procedimento MATLAB personalizado para calcular a rigidez da célula. A seguir, uma breve descrição do procedimento MATLAB:

1. O programa Matlab identifica o ponto de contacto coordenadas z0 e d0 (ver figura 1), utilizando um algoritmo adoptada a partir de um método publicado por Lin et al ^29.:
2. Para cada ponto de dados da curva de força, realizar um ajustamento linear dos dados para a esquerda do ponto de interesse, e um modelo de Hertz apto para a direita (com o ponto seleccionado como o ponto de contacto inicial), até o conjunto recuo máximo (200-300 nm recomendado).
3. Para cada ponto, calcular o erro RMS relativa de ambas as convulsões e somar esses valores.
4. O ponto que atinge o erro total mínimo adequado é selecionado como o ponto inicial de contato.
   Nota: O tempo de cálculo pode ser reduzida através da aplicação de uma pesquisa de secção dourada, em vez de digitalização linear da curva de força inteira.
5. Amostra δ deformação e recuo força F é calculado como:
   
6. Um quadrados de montagem é aplicada a pelo menos encaixar a F vs δ dados na região pós-contacto, z ≥ z _0, para o modelo de Hertz para extrair o módulo de Young, E da célula:
   
   , Onde v é o coeficiente de Poisson.
   Nota: Quando δ é mais do que 10% da espessura da amostra (altura da célula), a rigidez da célula medida é afectada pela rigidez do substrato. A espessura da região peri-nuclear é geralmente na ordem de alguns micrómetros. Portanto, somente os primeiros 200-300 nm de F-δ curva está apto para o modelo de Hertz.

Representative Results

A Figura 2a mostra três curvas representativas força tomadas a partir de fibroblastos 3T3 cultivadas na superfície de plástico, em gel de poliacrilamida de módulos de Young 3000 Pa e 17.000 Pa, respectivamente. Depois de identificar cuidadosamente os pontos de contacto nas curvas, a força de recuo em função da deformação celular está representada na Figura 2b. Sob uma força de magnitude menor do que 0,3 nN, uma pirâmide de forma da ponta travessões 3 micrômetros em uma célula cultivadas em um 3 kPa gel de poliacrilamida. Em contraste, uma força de mais de 1,6 nN é obrigado a recuar 500 nanómetros para dentro da célula cultivada em placa de cultura normal, utilizando a mesma ponta. É claro a partir deste gráfico que a célula cultivados em gel de poliacrilamida macia é mais suave do que a célula cultivada no prato de cultura rígida. Ajustar o primeiro segmento (δ <30 nm) para as curvas força-δ ao modelo Hertz dá módulos de Young destes três células como 10 kPa, 1,2 kPa e 1,10 kPa, respectivamente. Células na culture prato são 100 vezes mais duro do que as células cultivadas em gel de poliacrilamida. Solon et al. Relataram resultados semelhantes ^25. Eles encontraram que os fibroblastos endurecer activamente as suas citoesqueleto para combinar a rigidez dos substratos que adiram. Muitos outros tipos de células têm também sido relatados para tornar mais rígida quando cultivadas em substratos mais rígidos ^30.

É importante notar que a reentrância pode causar deformação plástica nas células, o que resulta dobras como ilustrado na curva de roxo. Normalmente, tais curvas devem ser excluídos da análise dos dados. No entanto, a curva pode ainda ser usado para calcular a rigidez da célula, se a torção está fora do alcance de ajuste dos dados. Por exemplo, a torção na curva roxo ocorre em cerca de 400 nm. Esta curva pode ainda ser analisada pelo ajuste dos dados apenas até δ = 30 nm para o modelo de Hertz para se obter um valor da rigidez de 1,2 kPa. Também é importante ajustar o "ponto de desencadeamento", de acordo com thrigidez da amostra e. Por exemplo, a curva azul é feita a partir de uma célula suave cultivadas num gel de poliacrilamida a 3 kPa. Definir o ponto de disparo deflexão relativa a 5 nm, a ponta recuos AFM 3 micrômetros na célula. Tais um grande recorte deve ser evitada durante a medição de rigidez de células, uma vez que pode romper a membrana celular e matar a célula. Muitos outros fatores, incluindo a velocidade ea taxa de aquisição de dados de ponta durante a aquisição da curva de força pode afetar a qualidade das curvas de força adquiridas e, consequentemente, a rigidez resultante de células ^31. Para fazer medições confiáveis ​​é necessário ajustar os todos estes parâmetros para adquirir "limpas" curvas de força, como a curva de vermelho mostrado na Figura 2a, que tem uma parte pré-contato plana seguido por um aumento não-linear parte pós-contato.

A Figura 3a mostra uma imagem de fluorescência de um fibroblasto 3T3 numa placa de cultura celular. A célula é transfectada com GFP vimentinaum tipo de filamentos intermediários. AFM Força de mapeamento foi realizado neste 80 um por 80 mM área, com uma resolução de 32 x 32 pixels. O mapa de rigidez resultante é mostrada na Figura 3b. A rigidez varia ao longo da célula. E, a região lamellipodium é mais duro e mais heterogénea do que a região peri-nuclear, que envolve o núcleo duro.

Figura 2. Dados da curva de força ea curva força-recuo analisado. A) Um conjunto de três dados da curva de força representativas adquiridos para fibroblastos 3T3 cultivadas em vidro (vermelho), 17 kPa gel de poliacrilamida (roxo) e 3 gel de poliacrilamida kPa (azul). As curvas são deslocados de modo a que o ponto de contacto (z _{0, 0} d) situa-se na origem (0,0) da coordenadasistema. b) As curvas de força-recuo calculado a partir de uma) e à remodelação dos dados ao modelo de recuo Hertz, utilizando apenas os primeiros 300 nm de recuo. Inset em b) mostra a bondade de ajuste para o modelo de Hertz para os primeiros 300 nm de recuo; círculos são dados experimentais, as linhas representam os dados de ajuste. A constante de mola cantilever é 0,062 N / m no caso presente.

Figura 3. a) uma imagem de fluorescência de fibroblastos 3T3 transfectados com GFP vimentina. Apenas uma parte da célula é mostrada na imagem. Barra de escala representa 20 um. B) A 32 x 32 pixel mapa rigidez da mesma área. Cada pixel representa 2,5 mM.

Discussion

O método de recuo AFM tem vantagens para caracterizar as propriedades mecânicas de células vivas. Embora menos sensível do que a citometria de torção magnética e pinças ópticas, que pode medir forças no nível piconewton ^32, o AFM pode detectar a força de resistência de amostras variando de dezenas de pico-Newton para centenas de nano-Newton, comparáveis ​​a gama de força que pode ser aplicado a células utilizando uma micropipeta ^19. Esta gama de força se adapta às necessidades de criar deformações mensuráveis ​​em todos os tipos de células ^19. A resolução espacial elevada faz com que seja possível a caracterização a nível submicrónico as heterogeneidades em tecidos e no interior das células individuais ^33. Ele também permite medições de células vivas em tempo real. Vários modelos de AFM desenhados para amostras biológicas pode operar em um ambiente fluido e estão equipadas com as fases de amostragem aquecida, que proporcionam um controlo preciso da temperatura, o que torna possível manter um ambien fisiológicobiente para as células vivas durante as medições. AFM recuo tem sido aplicado com sucesso para medir as propriedades mecânicas de uma variedade de tipos de células, ^25,34-36 e tem sido utilizado extensivamente para avaliar as alterações nas propriedades mecânicas de células associadas com a diferenciação celular e em vários contextos de doentes. ^30,37

Um passo importante para calcular a rigidez da curva de força-se identificar o ponto onde a ponta primeiro faz contacto com a célula. A incerteza em ponto de contato pode afetar o módulo de elasticidade ^31. Para materiais duros, o sinal de deflexão aumenta abruptamente após o contato ponta-amostra, eo ponto de contacto é prontamente identificada como ponto de viragem nas curvas. Tal ponto de viragem acentuada, no entanto, muitas vezes não aparecem nos força a partir de células-curvas, devido à baixa rigidez da célula (ver Figura 2). Um código MATLAB é desenvolvido para localizar com precisão os pontos de contato em curvas de forçaa partir de amostras mole utilizando o algoritmo proposto por Lin et al. ²⁹ O código pode lidar com as curvas da força de amostras macias, o que nos permite automatizar o processo de análise de dados por pesquisa automática para o ponto de contacto e ajustando os dados recuo para modelo Hertz. O código MATLAB é aplicado para determinar os pontos de contacto de 60 curvas de força feita no mesmo local de um gel de poliacrilamida, de que a rigidez foi medida para ser 7.2 kPa, através de medições de reologia a granel. O código detectados pontos de contacto destas curvas. A gama de variação na posição do ponto de contacto é menor do que 15 nm. Com base nesses pontos de contacto, a rigidez média calculada é de 6,9 ​​kPa, o desvio padrão é de 0,2 kPa, eo intervalo máximo de variação de 0,6 kPa. Os resultados desta experiência fornecem uma medida para avaliar a incerteza da rigidez medido. A incerteza de 15 nm, os resultados dos pontos de contacto em uma incerteza na rigidez, o que é menos do que 10% da média vale. Para géis macios, com um nível muito baixo de sinal de deflexão, a incerteza no ponto de contacto pode ser tão elevada como 30 nm, o que conduz a uma incerteza na rigidez tão alta quanto 30%. O código está disponível como um complemento a este artigo.

A AFM pode medir com segurança a rigidez que vão desde menos de 100 Pa a 10 ⁶ Pa, abrangendo a gama de rigidez para a maioria dos tecidos e células. Para medições fiáveis, é importante para selecionar os cantilevers de AFM com constantes de mola bem adaptado à rigidez da amostra. Quando o cantilever é muito rígida, a sua deflexão é demasiado pequena para detectar e que poderia danificar a célula, se o braço de suporte é muito macio, não vai recuar o suficiente de células para obter propriedades físicas fiáveis ​​e suas vibrações térmicas pode dominar a curva de força. Cantilevers de 0,06 N / m, com uma ponta de pirâmide são aplicáveis ​​para a maioria dos tipos de células cultivadas em placas de cultura duras. Estas consolas, contudo, não são aplicáveis ​​para medir as células cultivadas sobresubstratos moles. Como mostrado na Figura 2, a células cultivadas sobre um gel de poliacrilamida a 3000 Pa é tão suave que um recorte de 3 um é requerido para gerar um desvio de 5 nm no cantilever. A curva de força é tão plana que há muito pouca diferença entre o pré-contato e região pós-contato. Isso leva a grande incerteza no ponto de contato e, portanto, os valores de rigidez resultantes. Usando um cantilever apenas ligeiramente mais suave melhora o contraste entre o pré-contato e regiões pós-contato. Para medição de tais materiais macios, cantilevers com grande ponta esférica são recomendados. D 0,06 N / m com um braço de suporte da ponta esférica de 10 micrómetros de diâmetro, pode ser aplicado para medir amostras com dureza inferior a 100 Pa. Cantilevers com ponta esférica estão disponíveis comercialmente a partir de vários fornecedores. Eles também podem ser feitos sob medida por meio de colagem microesferas para consolas Cantilever sem. As pontas esféricas proporcionam maior sinal de deflexão e evitar danos na membrana da célula. However, eles não são aplicáveis ​​para o mapeamento de alta resolução rigidez devido à sua grande área de contacto com as células. Tabela 1 fornece uma lista de sondas AFM recomendadas para as medições da rigidez das células.

Modelo	Constante da mola (N / m)	Tipo ponta	Raio da ponta (nm)
Bruker DNP10-D	0.06	Pirâmide	20
Bruker MLCT-B/C/E	0.01/0.02/0.03	Pirâmide	20
Novascan PT.GS	0.01/0.03/0.06	Esfera de vidro	2.000 / 5.000 / 10.000
Novascan PT.PS	0.01/0.03/0.06	Sphere poliestireno	1.000 / 4.500 / 10.000

Tabela 1. ASElection de AFM sondas com constante da mola aplicável e geometria dica para recuo celular.

As limitações do método apresentado deve ser também marcou. O modelo de Hertz, que tem sido aplicado para ajustar os dados de recuo é um modelo simplista. Ele prevê que a relação força-recuo para irregularidades infinitesimais de materiais puramente elástico por penetradores axissimétricas. Alguns dos pressupostos do modelo Hertz não se aplicam ao recuo celular.

O modelo assume Hertz material homogéneo, e linear elástica, enquanto que uma célula é heterogénea (ver Figura 3), e de forma não linear elástica. Na região de lamellipodium, é bastante heterogênea, devido à estrutura heterogênea do citoesqueleto de actina. A rigidez mecânica de uma célula é referida como a rigidez média extraída de três ou mais curvas de força adquiridos a partir da região perinuclear relativamente homogénea. ^25,36 Reconstituído networks de filamentos de actina e intermediários são materiais strain-endurecimento, ou seja, eles são mais rígidos em deformações maiores. ^38,39 Essa elasticidade não-linear foi observado para as células vivas, mas não contabilizados no modelo de Hertz. Para limitar o efeito de elasticidade não-linear da rigidez célula relatado, apenas os primeiros 300 nm, os dados de recuo é ajustada ao modelo de Hertz.

Assume-se também no modelo de Hertz, que os materiais são puramente elástica. No entanto, as células e o seu citoesqueleto, são materiais viscoelásticos com rigidez depende da escala de tempo das medições. Na escala de tempo mais curto, a deformação do cantilever vem principalmente da resposta elástica de células. Na escala de tempo longo, no entanto, a amostra arrasta e dá uma resposta mais suave. A escala de tempo de AFM recuo é controlado pela velocidade de ponta. Assim, a diferença observada na rigidez celular só faz sentido quando as curvas de força são adquiridos com a mesma velo recuocidade. Para extrair quantitativamente a viscoelasticidade dependente da frequência de células, o método AFM "força modulação" foi desenvolvido através da aplicação de pequenas oscilações de alta frequência de amplitude em cima de um recuo maior ^21,27.

A suposição de espessura da amostra infinito no modelo Hertz não se aplica para as células. As células são tipicamente alguns micrômetros de espessura na região perinuclear, e algumas centenas de nanômetros de espessura na região da lamela. Correções foram feitas para explicar a espessura da amostra finita. ^31,40 Dados adquiridos da força de mapeamento contém dados de recuo e dados altura da célula. Espessura da amostra local pode ser calculada a partir dos dados da altura. O trabalho futuro é necessário para implementar as correções espessura da amostra na análise de dados de força de mapeamento.

Em resumo, este trabalho apresenta um protocolo para caracterizar a rigidez mecânica de células vivas usando um Asylum MFP3D-Bio micr força atômicaoscope. Os princípios da operação de AFM e o procedimento de análise de dados MATLAB são aplicáveis ​​a todos os outros modelos de AFM. Em anos recentes, as técnicas de microscopia de campo claro ópticos incluindo, microscopia confocal, microscopia de fluorescência e de reflexão interna total (TIRF) foram combinadas com a AFM para imagens em tempo real de células a estímulos mecânicos. ^41,42 Estas configurações também permitem medições simultâneas mecânica de células e de imagem dos componentes do citoesqueleto. Ao correlacionar os dados de rigidez locais para a distribuição dos componentes do citoesqueleto locais irá fornecer informações detalhadas sobre a forma como os componentes do citoesqueleto contribuir para a mecânica de células.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Atomic Force Microscope	Asylum Research	MFP3D-BIO