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Bioengineering

Misurare le proprietà meccaniche del Living cellule utilizzando microscopia a forza atomica

Published: June 27, 2013 doi: 10.3791/50497
Automatic Translation
1, 1, 2, 1
1Department of Physics, Worcester Polytechnic Institute, 2Department of Chemical Engineering, Worcester Polytechnic Institute

Summary

Questo documento illustra un protocollo per caratterizzare le proprietà meccaniche di cellule viventi mediante micropenetrazione utilizzando un microscopio a forza atomica (AFM).

Abstract

Proprietà meccaniche delle cellule e la matrice extracellulare (ECM) svolgono un ruolo importante in molti processi biologici tra cui la differenziazione di cellule staminali, la formazione del tumore, e la guarigione delle ferite. Cambiamenti nella rigidità delle cellule e ECM sono spesso segni di cambiamenti nella fisiologia o malattie nei tessuti delle cellule. Quindi, rigidità cellula è un indice per valutare lo stato di colture cellulari. Tra la moltitudine di metodi applicati per misurare la rigidità di cellule e tessuti, micro-indentazione usando un microscopio a forza atomica (AFM) fornisce un modo per misurare in modo affidabile la rigidità delle cellule viventi. Questo metodo è stato ampiamente applicato per caratterizzare la rigidezza micro-scala per una varietà di materiali, tra cui superfici metalliche a tessuti biologici molli e cellule. Il principio di base di questo metodo è di rientrare una cella con una punta AFM di geometria selezionata e misurare la forza applicata dalla flessione del cantilever AFM. Montaggio della curva forza-indentazione per la modalità di Hertzl per la corrispondente geometria della punta può dare misure quantitative di rigidezza materiale. Questo documento illustra la procedura per caratterizzare la rigidezza delle cellule viventi mediante AFM. Passaggi chiave, tra cui il processo di AFM calibrazione, acquisizione forza-curva, e l'analisi dei dati utilizzando una routine di MATLAB sono dimostrati. Vengono anche discussi limiti di questo metodo.

Introduction

Proprietà meccaniche, in particolare rigidità, di singole cellule e loro matrici extracellulari circostanti (ECM) sono fondamentali per molti processi biologici che comprendono la crescita cellulare, la motilità, divisione, differenziazione e omeostasi tissutale. 1 È stato dimostrato che cellule rigidità meccanica è determinata principalmente dalla il citoscheletro, specialmente le reti di actina e filamenti intermedi e altre proteine ​​ad essi associati. 2 risultati di prove meccaniche su reti in vitro di actina e filamenti intermedi suggeriscono che la meccanica delle cellule dipende in gran parte la struttura del citoscheletro e la pre-stress in il citoscheletro. 3-5 Rigidità di cellule vive è quindi considerato come un indice per valutare la struttura del citoscheletro 6, 7 attività miosina e molti altri processi cellulari. Ancora più importante, i cambiamenti nelle proprietà meccaniche delle cellule sono spesso trovati ad essere strettamente associatiato con diverse condizioni di malattia come la formazione di tumori e metastasi 8-10 Monitoraggio della rigidità meccanica delle cellule viventi può quindi fornire un nuovo modo di monitorare la fisiologia cellulare,. di rilevare e diagnosticare le malattie 8;. ed a valutare l'efficacia dei trattamenti farmacologici 11 , 12

Metodi multipli comprese microrheology particella-tracking, 13-16 torsione magnetica citometria, 17 micropipetta aspirazione 18,19 e micropenetrazione 20-22 sono stati sviluppati per misurare l'elasticità delle cellule. Particella di monitoraggio microrheology ripercorre le vibrazioni termiche di entrambi particelle fluorescenti inferiori al micron iniettati in cellule o marcatori fiduciali all'interno del citoscheletro delle cellule. 23 proprietà elastiche e viscose di cellule sono calcolati gli spostamenti delle particelle misurate usando il teorema di fluttuazione-dissipazione. 14,23 Questo metodo permette di misurazioni simultanee di localeproprietà meccaniche con alta risoluzione spaziale in luoghi diversi in una cella. Tuttavia, l'iniezione di particelle fluorescenti in cellule può portare a cambiamenti nella funzione cellulare, la struttura del citoscheletro, e quindi la meccanica delle cellule. Il metodo di aspirazione micropipetta applica pressione negativa in una micropipetta di diametro compreso tra 1 e 5 um succhiare un piccolo pezzo di membrana cellulare nella pipetta. Cella rigidezza viene calcolata dalla pressione negativa applicata e deformazione della membrana cellulare. 18 Questo metodo, tuttavia, non può rilevare la distribuzione eterogenea della rigidezza attraverso la cella. Citometria torsione magnetica (MTC) applica campo magnetico per generare coppia sulla super-perline paramagnetiche attaccati alla membrana cellulare. 17 Cella rigidezza è derivato in questo metodo dal rapporto tra la coppia applicata e la deformazione torsione della membrana cellulare. È difficile controllare la posizione di perline magnetiche nel metodo MTC, ed è anche challenging per caratterizzare la deformazione torsione con alta risoluzione. Micropenetrazione applica un penetratore con geometrie ben definite a pugni nella cella. La forza di rientro e il rientro risultato cellule seguono spesso la previsione del modello Hertz. Di Young dei moduli delle celle può essere calcolata dalle curve forza indentazione dotandoli al modello Hertz. Questo metodo è stato ampiamente applicato per testare le proprietà meccaniche del tessuto e di cellule dispetto delle sue limitazioni quali l'incertezza nella determinazione contatto puntiforme, applicabilità del modello Hertz, e il potenziale di danneggiare fisicamente le cellule. Tra i molti dispositivi per microindentaion 20, il microscopio a forza atomica (AFM) è disponibile in commercio ed è stato ampiamente applicato per caratterizzare le proprietà meccaniche di cellule e tessuti viventi 21,24-27.

Questo documento dimostra la procedura di utilizzo di un asilo MFP3D-Bio AFM per la caratterizzazione meccanica delle cellule. AFM non suly fornisce topografia ad alta risoluzione di cellule, ma anche è stato ampiamente applicato per caratterizzare le proprietà meccaniche delle cellule dei tessuti. Il principio della AFM indentazione è illustrato in Figura 1. Il cantilever AFM avvicina alla cella da pochi micrometri sopra; fa contatto con la cellula; trattini la cella in modo che la flessione della leva raggiunge un punto di regolazione preselezionata; e tira via dalla cella. Durante questo processo la flessione della leva viene registrata come funzione della sua posizione come mostrato nella Figura 1. Prima di prendere contatto con la cellula, il cantilever muove nel medio senza alcuna deviazione apparente. Quando rientro in cella, le curve a sbalzo e di aumento del segnale di deflessione. I cantilever sono modellati come travi elastica in modo che la loro deflessione è proporzionale alla forza applicata alla cella. Impostando la massima flessione della leva, la grandezza massima della forza applicata al campione viene limitata per evitare dAMAGE alle cellule. La porzione della curva di forza dal punto B al punto C in figura 1, dove i trattini punta nella cellula, viene adattata al modello hertz per estrarre la rigidità cella.

Figura 1
Figura 1. Illustrazione di AFM micropenetrazione e l'interpretazione della curva di forza. Il pannello superiore mostra il movimento del cantilever AFM guidato dallo scanner piezoelettrico. La posizione verticale della mensola z e flessione della leva segnale d viene registrato durante il processo. Il cantilever parte da un punto, di pochi micrometri sopra la cella. Mentre si avvicina la cella, la rientranza δ campione rimane zero fino a raggiungere il punto b, in cui la punta viene a contatto con la cellula. Le coordinate del punto b nel grafico sono valori criticiper l'analisi dei dati, indicato con (z 0, d 0>). Da B a C, i trattini sbalzo nella cella finché flessione della leva raggiunge un punto di regolazione, che è impostato per essere il rapporto tra la forza massima indentazione mirata e la costante elastica cantilever. Una volta che il segnale di deflessione raggiunge il valore massimo prestabilito, il cantilever viene poi ritirato dalla cella a punto d, dove spesso viene tirata verso il basso a causa di punta-campione adesione, stacca dalla cella e ritorna alla sua posizione iniziale a e. Il pannello destro mostra la relazione tra la rientranza e la z registrata e segnale d. In sul pannello di sinistra inferiore è un diagramma di una curva rappresentativa forza, il rientro massimo di un cantilever, la cui costante elastica è misurata essere 0.07N / m, è impostato per essere 17 nm, in modo che la forza massima applicata al rientro campione è 1,2 nN. Le posizioni chiave durante il rientro sono contrassegnati.

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Protocol

1. Calibrare la Costante molla di sbalzo

  1. Caricare il cantilever in AFM in base alle istruzioni del produttore. È necessario pulire il supporto a sbalzo con etanolo prima di qualsiasi esperimenti. Ciò contribuirà a limitare la contaminazione batterica di cultura durante le misurazioni AFM.
  2. Calibrare InvOLS (Inverse Leva Sensibilità ottica). Questo parametro indica la quantità di risposta fotodiodo (Volt) per nanometro di sbalzo deflessione.
  3. Caricare un vetrino pulito sul palco del campione, quindi installare la testa AFM e regolare il raggio laser e l'allineamento in base alle istruzioni del produttore. Inserire la punta AFM sul vetrino.
  4. Con il piezo ritirata, riallineare lo specchio di una lettura fotodiodo di -2 V. Eseguire una misurazione spettroscopia forza con un trigger point (risposta massima fotodiodo) di 2 V.
  5. Con il piezo ritirata, riallineare lo specchio di una lettura fotodiodo di -2 V. Effettuare un foRCE misura spettroscopia con un trigger point (risposta massima fotodiodo) di 2 V. Nota: I valori di tensione qui sono specifici per l'asilo AFM. Questo valore deve essere impostato in base alle specifiche fornite dal produttore.
    Dopo l'acquisizione dei dati è completa, lo zoom alla regione ferma-contatto della curva di forza. Eseguire un adattamento lineare a questa regione per trovare la pendenza, che sarà in V / nm. Il reciproco di questo valore descrive la sensibilità ottica dell'insieme cantilever-fotodiodo.
  6. Ripristinare l'allineamento specchio per una deviazione libero di 0 V.
  7. Calibrare la costante della molla a sbalzo. Un metodo termico-tune viene utilizzato per determinare la costante di molla a sbalzo 28.
  8. Dopo aver calibrato i InvOLS, sollevare lo scanner lontano dal palco campione tale che non ci sono interazioni tra la punta e il campione.
  9. Iniziare l'acquisizione di dati termici. Durante questo processo, la vibrazione termica della trave a sbalzo è Recorded. Il software AFM analizza uno spettro di potenza di un tale vibrazione termica e trame in una finestra di dati.
  10. Dopo alcuni secondi di acquisizione dati, eseguire un adattamento per il segmento di dati centrata alla frequenza fondamentale più bassa (risonanza fondamentale) picco per determinare la costante della molla.

2. Caricamento del campione

  1. Installare il riscaldatore accessorio Piatto sul palco AFM, se non è già dotato.
  2. Impostare la temperatura a 37 ° C, e attendere 20 min per il sistema di raggiungere un equilibrio termico stabile.
  3. Posizionare il piatto cultura sul palcoscenico AFM e fissarlo utilizzando il morsetto con il riscaldatore piatto. È importante minimizzare il tempo tra la rimozione del piatto dall'incubatore e posizionandolo sulla scena, per evitare traumi alle cellule. Per misurazioni più lunghi di 30 min, CO 2 medi indipendente dovrebbe essere usato per sostituire il normale mezzo di coltura.
  4. Applicare una piccola goccia di 37 ° C terreno di coltura alla punta di tegli cantilever AFM, e abbassare la testa AFM finché la punta è appena immerso in un liquido.
  5. Utilizzo della fotocamera top-view CCD, riallineare il fascio laser sul cantilever (l'allineamento nel liquido sarà diversa in aria, a causa della variazione dell'indice di rifrazione del mezzo).
  6. Inserire la punta AFM in una zona pulita del piatto cultura.
  7. Eseguire la calibrazione dei InvOLS come descritto sopra, per la sensibilità cantilever nell'ambiente liquido.

Nota: a) Se le cellule sono coltivate su idrogel, la calibrazione di InvOLS dovrebbe essere eseguita in anticipo contro la superficie inferiore di una piastra di coltura riempito di mezzi di coltura cellulare. Quando si passa a campioni di cellule, una particolare attenzione deve essere pagato per non modificare l'allineamento del fascio laser con il cantilever. b) InvOLS deve essere ricalibrato ogni volta che c'è un cambiamento nella allineamento laser. c) Si raccomanda inoltre di prendere InvOLS come media di valore da diverse curve di calibrazione, since ogni calibrazione genera un diverso InvOLS. La variazione InvOLS è, tuttavia, piccolo rispetto al valore medio. Ad esempio, la calibrazione di un Bruker DNP-10 a sbalzo con la costante 0,06 N / m di liquido da 100 volte primavera produrre un valore medio InvOLS di 66,3 nm / V, con deviazione standard di soli 0,5 nm / V.

3. Raccolta Forza Curve di cellulare indentazione

  1. Selezionare una cella per il rientro. Con l'ausilio del microscopio ottico, spostare la fase di posizionare il cantilever sopra la cella in modo che la punta si trova nella regione peri-nuclei. Regolazione precisa della posizione a sbalzo può essere realizzato mediante l'applicazione di offset per il scanner X e Y.
    Nota: Il cantilever AFM deve essere ritirato dalla superficie del campione, mentre spostando la fase di campionamento per selezionare una cella di destinazione. Questo protegge il cantilever urti tra il campione, poiché la superficie del campione non può essere piatta.
  2. Passare a forzare la modalità Spettroscopia. Impostare il rientrotasso nell'intervallo di 1-10 micron / sec, sufficientemente basso da evitare effetti idrodinamici.
  3. Impostare il punto di innesco di deflessione, che limita la forza massima indentazione per evitare danni alle cellule. Selezionare l'opzione triggering relativa, che correggerà eventuali derive nel segnale di deflessione. Una forza massima di 2 nn è un buon punto di partenza per la maggior parte dei campioni. Questo valore, tuttavia, dovrebbe essere regolata in base alla rigidità del campione. Per campioni morbidi un valore inferiore deve essere utilizzato per evitare un eccesso di indentazioni al campione. Per campioni rigidi un valore elevato dovrebbero essere utilizzati per generare indentazione misurabili.
  4. Impostare la distanza forza sufficientemente grande da garantire che la punta sarà completamente staccato dalla cella tra le misurazioni di forza. Solitamente, la distanza di forza è fissato a 5 micron.
  5. Comandare l'AFM per prendere una singola curva forza.
  6. Raccogliere almeno tre curve di forza in diverse località della regione peri-nuclei di ogni cellula. Anche se è utile per prendere multiplacurve su ogni cella di dati statistici affidabili, prendendo troppe curve di forza possono portare a cambiamenti nella rigidità delle cellule a causa di stress dalla sonda AFM.
  7. Quando la raccolta dei dati è completa, ritirare la punta, e ripetere i passaggi 3,1-3,6 per le celle come necessario per i buoni dati statistici sulla rigidità delle cellule in una determinata condizione di esempio. Solitamente, 30 celle sono misurati per ogni condizione.

Per caratterizzare la distribuzione di rigidezza all'interno di una singola cellula, viene applicata la modalità forza-map. Nella modalità Forza-mappa, impostare un formato di scansione per includere la regione di interesse; impostare una risoluzione appropriata, impostare i parametri di rientro di quelli selezionati per curve di spinta singoli; l'AFM sarà poi raster in tutta l'area del campione definito e prendere curve di spinta singoli ad ogni pixel nella regione campione.

4. Analisi dei dati

Le curve di forza registrati vengono analizzati utilizzando una procedura MATLAB personalizzato per calcolare la rigidezza cella. Quello che segue è una breve descrizione del procedimento MATLAB:

  1. Il programma MATLAB identifica il punto di contatto e coordinate z0 d0 (vedi Figura 1) usando un algoritmo adottato da un metodo pubblicato da Lin et al 29.:
  2. Per ciascun punto di dati nella curva di forza, eseguire un adattamento lineare dei dati alla sinistra del punto di interesse, e un modello Hertz adatta a destra (utilizzando il punto selezionato come punto iniziale di contatto), fino al set massima indentazione (200-300 nm consigliati).
  3. Per ogni punto, calcolare l'errore relativo RMS di entrambi convulsioni ed sommare questi valori.
  4. Il punto che raggiunge l'errore totale minimo raccordo viene selezionata come punto iniziale di contatto.
    Nota: il tempo di calcolo può essere ridotto mediante l'attuazione di una ricerca d'oro-sezione piuttosto che la scansione lineare tutta la curva forza.
  5. Esempio di deformazione δ e rientro forza F sono calcolate come:
    Equazione 1
  6. Un raccordo minimi quadrati viene applicato per adattarsi alla F vs dati δ nella regione post-contatto, z ≥ z 0, al modello Hertz per estrarre il modulo di Young, E della cella:
    Equazione 2
    , Dove v è il modulo di Poisson.
    Nota: Quando δ è superiore al 10% dello spessore del campione (altezza cella), la rigidezza cella misurata viene influenzato dalla rigidità del substrato. Lo spessore della regione peri-nucleare è solitamente dell'ordine di pochi micrometri. Pertanto, solo i primi 200-300 nm di F-δ curva si adattano al modello di Hertz.

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Representative Results

La figura 2a mostra tre curve di forza rappresentativi tratti da fibroblasti 3T3 in coltura su superficie di plastica, gel di poliacrilammide di moduli di Young 3.000 Pa e 17.000 Pa, rispettivamente. Dopo aver identificato con attenzione i punti di contatto delle curve, la forza di rientro in funzione della deformazione delle cellule è tracciata in Figura 2b. Sotto una forza di grandezza inferiore a 0,3 nN, una piramide forma della punta del trattini 3 micrometri in una cellula in coltura su un kPa gel 3 poliacrilammide. Al contrario, una forza più di 1,6 nN è necessaria per far rientrare 500 nanometri nella cella coltivate su piastra di coltura semplice utilizzando la stessa punta. E 'chiaro da questo grafico che la cellula in coltura su gel di poliacrilammide soft è più morbida rispetto alla cellulari coltivate sul piatto di coltura rigida. Montaggio del primo segmento (δ <30 nm) delle curve forza δ al modello Hertz dà di moduli di Young di queste tre celle come 10 kPa, 1,2 kPa, e 1,10 kPa, rispettivamente. Cellule sulla culture piatto sono 100 volte più rigido cellule coltivate su gel di poliacrilammide. Solone et al. Hanno riportato risultati simili 25. Essi hanno scoperto che i fibroblasti si irrigidiscono attivamente i loro citoscheletro per abbinare la rigidità dei substrati cui aderiscono. Sono stati segnalati anche molti altri tipi di cellule a diventare più rigido quando coltivate su substrati rigidi 30.

È importante notare che il rientro può causare deformazione plastica in celle, che risulta pieghe come illustrato nella curva viola. Normalmente, tali curve dovrebbero essere esclusi dall'analisi dei dati. Tuttavia, la curva può ancora essere utilizzato per calcolare la rigidezza cella se il nodo è al di là della gamma dei dati di fitting. Per esempio, la piegatura nella curva viola avviene a circa 400 nm. Questa curva può ancora essere analizzato inserendo i dati solo fino a δ = 30 nm al modello Hertz per produrre un valore di rigidezza 1,2 kPa. E 'anche importante regolare il "punto trigger" secondo thcampione e rigidità. Per esempio, la curva blu è preso da una cella morbido coltivati ​​su un kPa gel di poliacrilammide 3. Impostare il relativo punto di trigger deflessione 5 nm, l'AFM punta trattini 3 micrometri nella cellula. Tale grande rientranza deve essere impedito durante le misurazioni rigidità cella, poiché potrebbe rottura della membrana cellulare e uccidere la cellula. Molti altri fattori tra cui la velocità e dati velocità di acquisizione della punta durante l'acquisizione curva di forza possono influenzare la qualità delle curve di forza acquisiti e quindi la rigidità risultante di cellule 31. Per effettuare misurazioni affidabili è necessario regolare i tutti questi parametri per acquisire curve di forza "puliti" come la curva rossa mostrata in figura 2a, che ha una parte di pre-contatto piana seguita da una parte non lineare aumentando post-contatto.

La figura 3a mostra una immagine di fluorescenza da una fibroblasti 3T3 su un piatto di coltura cellulare. La cella è trasfettate con GFP vimentina,un tipo di filamenti intermedi. AFM Forza-mappatura è stata eseguita in questo 80 micron da 80 micron zona, con una risoluzione di 32 x 32 pixel. La mappa rigidità risultante è mostrato in Figura 3b. La rigidità varia attraverso la cella. E, la regione lamellipodium è più rigido e più eterogenea rispetto alla regione peri-nucleare che circonda il nucleo rigido.

Figura 2
Figura 2. Dati curva di forza e la curva forza-indentazione analizzato. A) Un insieme di tre forze dati curva rappresentativa acquisiti per i fibroblasti 3T3 coltivate su vetro (rosso), 17 kPa gel di poliacrilammide (viola), e 3 kPa gel di poliacrilammide (blu). Le curve sono spostati in modo che il punto di contatto (z 0, 0 d) si trova all'origine (0,0) della coordinatasistema. b) Le curve indentazione-forza calcolati a) e fitting dei dati indentazione al modello Hertz utilizzando solo i primi 300 nm di indentazione. Inserto in b) mostra la bontà di adattamento al modello Hertz per i primi 300 nm di indentazione; cerchi sono dati sperimentali, linee rappresentano i dati di adattamento. La costante di molla a sbalzo è 0.062 N / m in questo caso.

Figura 3
Figura 3. a) Fluorescenza immagine di un fibroblasti 3T3 trasfettate con GFP vimentina. Solo una parte della cella è mostrato nell'immagine. Barra di scala rappresenta 20 micron. B) A 32 x 32 pixel rigidità mappa della stessa area. Ogni pixel rappresenta il 2,5 micron.

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Discussion

Il metodo di indentazione AFM ha vantaggi per caratterizzare le proprietà meccaniche di cellule viventi. Seppur meno sensibile della citometria a torsione magnetica e pinzette ottiche, in grado di misurare le forze a livello piconewton 32, l'AFM in grado di rilevare la forza di resistenza da campioni che vanno da decine di pico-Newton a centinaia di nano-Newton, paragonabili a spaziare di forza che può essere applicato a cellule usando una micropipetta 19. Questo intervallo di forza adatta alle esigenze per creare deformazioni misurabili in tutti i tipi di cellule 19. L'elevata risoluzione spaziale consente di caratterizzare a livello submicron le eterogeneità nei tessuti e nelle cellule singole 33. Permette anche in tempo reale misurazioni cellule vive. Diversi modelli AFM progettati per campioni biologici possono operare in un ambiente fluido e sono equipaggiate con fasi di prelievo riscaldato, che forniscono il controllo preciso della temperatura, consentendo di mantenere un ambien fisiologicabiente per le cellule viventi durante le misurazioni. AFM indentazione è stato applicato con successo per misurare le proprietà meccaniche di una gamma di tipi di cellule, 25,34-36 ed è stato ampiamente utilizzato per valutare i cambiamenti nelle proprietà meccaniche delle cellule associate con la differenziazione cellulare e in vari contesti malate. 30,37

Un passo importante calcolare rigidità da forza-curva è identificare il punto in cui la punta prima entra in contatto con la cellula. L'incertezza nel punto di contatto può influenzare il modulo elastico 31. Per i materiali rigidi, il segnale di deflessione aumenta bruscamente dopo il contatto punta-campione, e il punto di contatto è facilmente identificato come punto di svolta nelle curve. Tale svolta tagliente, tuttavia, spesso non compare nella Forza-curve da cellule, a causa della rigidità delle cellule basso (vedi Figura 2). Un codice MATLAB è stato sviluppato per individuare con precisione i punti di contatto a curve di forzada campioni morbido utilizzando l'algoritmo proposto da Lin et al. 29 Il codice in grado di gestire le curve di forza dei campioni morbidi, che ci permette di automatizzare il processo di analisi dei dati con la ricerca automatica del punto di contatto ed il montaggio dei dati di indentazione per modello di Hertz. Il codice MATLAB viene applicato per determinare i punti di contatto 60 curve di forza prese nella stessa posizione di un gel di poliacrilammide, di cui la rigidità era misura sia 7,2 kPa da misurazioni reologiche rinfusa. Il codice rilevato punti di contatto in queste curve. La gamma di variazione di posizione del punto di contatto è minore di 15 nm. Sulla base di questi punti di contatto, la rigidezza medio calcolato è 6,9 kPa, la deviazione standard è 0,2 kPa, e la portata massima di variazione 0,6 kPa. Risultati di questo esperimento forniscono una misura per valutare l'incertezza della rigidità misurata. Il 15 nm incertezza nei risultati punti di contatto in una incertezza in rigidità, che è inferiore al 10% della media Value. Per i gel più morbido con bassissimo livello di segnale di deviazione, l'incertezza nel punto di contatto può essere alto come 30 nm, che porta ad una incertezza nella rigidità fino al 30%. Il codice è disponibile come supplemento a questo articolo.

AFM può attendibilmente rigidità da meno di 100 Pa a 10 6 Pa, che copre l'intervallo di rigidezza per la maggior parte dei tessuti e cellule. Per misurazioni affidabili, è importante selezionare i cantilever AFM con costante elastica ben abbinati alla rigidità del campione. Quando il cantilever è troppo rigida, la deflessione è troppo piccola per rilevare e potrebbe danneggiare la cella, se il cantilever è troppo morbido, non trattino la cella sufficientemente per ottenere proprietà materiali affidabili e sue vibrazioni termiche può dominare la curva di forza. Sbalzo di 0,06 N / m con una punta di piramide sono applicabili per la maggior parte dei tipi di cellule in coltura su piastre di coltura rigide. Questi cantilever, tuttavia, non sono applicabili a misurare cellule coltivate sulsubstrati molli. Come mostrato in figura 2, la cellula in coltura su un gel di poliacrilammide Pa 3000 è così morbido che un micron rientranza 3 è necessaria per generare una deflessione 5 nm a cantilever. La curva di forza è così piatto che vi è poca differenza tra il pre-contatto e regione post-contatto. Questo porta a grande incertezza nel punto di contatto e quindi i valori di rigidità risultanti. Utilizzando un cantilever migliora solo leggermente più morbida contrasto tra il pre-contatto e dopo i contatti. Per la misurazione di tali materiali morbidi, sono raccomandati cantilever con grande punta sferica. A 0,06 N / m sbalzo con una punta sferica di 10 micrometri di diametro può essere applicato per misurare campioni con rigidità inferiore a 100 Pa. Cantilevers con estremità sferica sono disponibili in commercio da molti fornitori. Essi possono anche essere su misura per incollaggio microsfere a cantilever tipless. Le punte sferiche forniscono segnali di deflessione più grande e prevenire i danni alla membrana cellulare. Huttavia, non sono applicabili per la mappatura rigidità ad alta risoluzione grazie alla loro grande superficie di contatto con le cellule. tabella 1 fornisce un elenco di sonde AFM consigliati per misurazioni di rigidità delle cellule.

Modello Costante della molla (N / m) Tipo di punta Raggio di punta (nm)
Bruker DNP10-D 0.06 Piramide 20
Bruker MLCT-B/C/E 0.01/0.02/0.03 Piramide 20
NovaScan PT.GS 0.01/0.03/0.06 Sfera di vetro 2,000 / 5,000 / 10,000
NovaScan PT.PS 0.01/0.03/0.06 Polistirene Sphere 1.000 / 4.500 / 10.000

Tabella 1. A SEcolta di sonde AFM con costante elastica applicabile e geometria della punta per il rientro delle cellule.

I limiti del metodo presentato devono essere contrassegnati anche. Il modello di Hertz che è stata applicata per adattare i dati di rientro è un modello semplicistico. Esso prevede il rapporto forza-indentazione per rientranze infinitesimali di materiali puramente elastici di penetratori assialsimmetrici. Alcune delle ipotesi del modello Hertz non si applicano al rientro cella.

Il modello assume Hertz materiale omogeneo e elastico lineare, mentre una cellula è eterogenea (vedi Figura 3) e non linearmente elastico. Nella regione lamellipodium, è piuttosto disomogeneo per la struttura eterogenea del citoscheletro actina. La rigidità meccanica di una cellula è riportato come la media rigidità estratto da tre o più curve di forza acquisiti dalla regione perinucleare relativamente omogenea. 25,36 ricostituita networks di actina e filamenti intermedi sono materiali ceppo-irrigidimento, vale a dire che sono più rigidi a deformazioni più grandi. 38,39 Tale elasticità non lineare è stata osservata per le cellule viventi, ma non contabilizzati nel modello di Hertz. Per limitare l'effetto di elasticità non lineare sulla rigidità cellula riportato, solo i primi 300 nm della rientranza dati viene adattata al modello Hertz.

Si assume anche nel modello Hertz che i materiali sono puramente elastico. Tuttavia, le cellule e il loro citoscheletro sono materiali viscoelastici con rigidità dipende dalla scala temporale di misurazione. A breve scala temporale, la flessione della leva deriva principalmente dalla reazione elastica delle cellule. A scala di molto tempo, però, il campione si insinua e dà una risposta più morbida. La scala temporale di AFM rientro è controllato da velocità punta. Quindi, la differenza osservata in rigidità cella è significativa solo quando le curve di forza sono acquisiti con la stessa velo indentazionecittà. Per estrarre la viscoelasticità quantitativamente dipendente dalla frequenza delle cellule, la "modulazione forza" metodo AFM è stato sviluppato applicando piccole oscillazioni di frequenza alta ampiezza su una indentazione maggiore 21,27.

L'assunzione di spessore del campione infinito nel modello Hertz non vale per le celle. Le cellule sono in genere di pochi micrometri di spessore nella regione perinucleare, e qualche centinaio di nanometri di spessore nella regione lamella. Le correzioni sono state fatte per spiegare lo spessore del campione finito. 31,40 I dati acquisiti da forza-mapping contiene sia i dati di indentazione e dati altezza della cella. Spessore del campione locale può essere calcolato dai dati di altezza. Il lavoro futuro è tenuto ad attuare le correzioni spessore del campione per l'analisi di dati di forza-mapping.

In sintesi, questo articolo presenta un protocollo per caratterizzare la rigidità meccanica delle cellule viventi usando un asilo MFP3D-Bio MICR forza atomicaoscope. I principi di funzionamento AFM e la procedura di analisi dei dati MATLAB sono applicabili a tutti gli altri modelli AFM. Negli ultimi anni, tecniche di microscopia ottica tra campo luminoso, microscopia confocale, e la riflessione interna totale microscopia a fluorescenza (TIRF) sono stati combinati con l'AFM per l'imaging in tempo reale delle cellule agli stimoli meccanici. 41,42 Queste configurazioni permettono anche misurazioni simultanee di la meccanica delle cellule e di imaging dei componenti del citoscheletro. Correlando i dati rigidezza locali per la distribuzione di componenti citoscheletrici locali fornirà informazioni penetranti su come i componenti citoscheletrici contribuiscono alla meccanica cellulari.

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Disclosures

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Acknowledgments

Gli autori ringraziano il Dott. Paolo Janmey presso l'Università della Pennsylvania per la fornitura di linee cellulari utilizzate in questo documento. QW anche riconoscere JF Byfield e Evan Anderson per le loro discussioni penetranti sulle tecniche di AFM.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Atomic Force Microscope Asylum Research MFP3D-BIO

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Misurare le proprietà meccaniche del Living cellule utilizzando microscopia a forza atomica
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Thomas, G., Burnham, N. A., Camesano, T. A., Wen, Q. Measuring the Mechanical Properties of Living Cells Using Atomic Force Microscopy. J. Vis. Exp. (76), e50497, doi:10.3791/50497 (2013).

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