Het verkrijgen van exemplaren met vertraagd, versneld en Reversed Aging in de Honey Bee Model

Summary

In honingbij werknemers, ouder worden, hangt af van sociaal gedrag in plaats van op chronologische leeftijd. Hier laten we zien hoe de werknemer-typen met zeer verschillende veroudering patronen kan worden verkregen en voor cellulaire veroudering geanalyseerd.

Abstract

Maatschappijen van zeer sociale dieren zijn voorzien van grote levensduur verschillen tussen nauw verwante individuen. Onder sociale insecten, de honingbij is de beste gevestigde model te bestuderen hoe de plasticiteit in levensduur en veroudering wordt verklaard door sociale factoren.

De werknemer kaste van honingbijen bevat verpleegster bijen, die het broed neigen, en forager bijen, die nectar en stuifmeel te verzamelen. Vorige werk heeft aangetoond dat hersenfuncties en vliegprestaties senesce sneller in verzamelaars dan bij verpleegkundigen. Toch kan hersenfuncties terugkrijgen, wanneer verzamelaars terugkeren naar verpleegkundige taken. Dergelijke patronen van versnelde en omgekeerd functionele veroudering zijn gekoppeld aan de veranderde stofwisseling resource niveaus, tot veranderingen in eiwitten overvloed en het immuunsysteem. Vitellogenine, een dooier eiwit met aangepaste functies hormonale controle en cellulaire afweer, kan dienen als een belangrijk regulerend element in een netwerk dat de verschillende veroudering dynamiek werknemers regelt.

Hier beschrijven we hoe de opkomst van verpleegkundigen en verzamelaars kunnen worden gecontroleerd en gemanipuleerd, met inbegrip van de omkering van meestal kortstondige verzamelaars in een langer leven verpleegkundigen. Onze vertegenwoordiger resultaten laten zien hoe individuen met gelijkaardige chronologische leeftijd differentiëren naar verzamelaars en verpleegkundige bijen onder experimentele omstandigheden. We illustreren hoe gedrags omkering van verzamelaars terug naar verpleegkundigen kunnen worden gevalideerd. Ten slotte tonen we hoe verschillende cellulaire senescentie kan worden beoordeeld door het meten van de accumulatie van lipofuscine, een universele biomerker voor veroudering.

Voor het bestuderen van mechanismen die sociale invloeden kunnen koppelen en veroudering plasticiteit, dit protocol voorziet een gestandaardiseerde tool set om relevante monstermateriaal te verwerven, en vergelijkbaarheid van de gegevens te verbeteren tussen toekomstige studies.

Introduction

Het complex kolonie structuren van zeer sociale dieren worden onderhouden door de interactie van een reproductieve kaste, en een helper kaste van typisch niet-reproducerende werknemers met verschillende sociale taak gedrag. In de verschillende arbeiders, specifieke fysiologische aanpassingen laten onderscheiden sib zorg gedrag, en zijn ook gekoppeld aan extreme levensduur verschillen. Honingbijen en mol ratten vertegenwoordigen de best ontwikkelde diermodellen om te bestuderen hoe socialiteit is gekoppeld aan patronen van versnelde, verwaarloosbaar of omgekeerd veroudering ^1-3.

In bijenkolonies, is een single-eierleggende koningin bijgestaan ​​door duizenden arbeiders die het broed, naar voedsel hebben de neiging, en zich in het bewaken, thermoregulatie of hygiënisch gedrag ^4. Onder deze werknemers zijn de extreem korte duur voedermachines, verpleegster bijen met tussentijdse en winter (diutinus) bijen met de langste levensduur. Individuen echter niet permanent gebonden aan een bepaald worker-type, maar het beeld blijft flexibel gedrag ontogenie: zij van een sociaal gedrag naar de andere taak ("temporele kasten"). Callow bijen kan veranderen broeden neigt verpleegster bijen, die uiteindelijk kan veranderen buiten foerageren. Echter, onervaren nest bijen ook transformeren tot langstlevende winter bijen, en kortstondige verzamelaars kunnen zelfs terugkeren in het algemeen langer leven verpleegkundigen. Werknemers met extreme (winter bijen) en tussenproduct (verpleegkundige bijen) levensduur hebben goed ontwikkelde productie en opslag voedsel organen met overvloedige middelen - in tegenstelling tot kortstondige verzamelaars (beoordeeld in ^1,5). Echter, dat de regulering van individuele levensduur gaat verder dan eenvoudige veranderingen in resource balans van een individu wordt gesuggereerd door het onderzoek op een dooier eiwit, dat diverse aangepaste functies heeft in de niet-reproducerende werknemer kaste, zoals gelei productie ^6, hormonale controle ^7, immuun ⁸ en anti-oxidant verdediging ^9.

Patronen van functional daling (veroudering) spiegel levensduur verschillen tussen werknemers, zoals vastgesteld voor olfactorische, en ook voor andere hersen-of motorische functies ^10-13. Met name de aanzienlijke daling leerfunctie na twee weken voederen overeenkomt soortgelijke mortaliteit progressie voedermachines ^14, in tegenstelling tot het gebrek aan detecteerbare daling (verwaarloosbaar senescentie) in langlevende winter bijen ^15.

Om de moleculaire vingerafdrukken van flexibele veroudering passen wij vastgesteld experimentele paradigma's die het mogelijk maken voor de bewaking van en het manipuleren van veroudering-soort overgangen ^8,16,17 identificeren. Experiment 1 details van voorbeelden waarin de effecten van de chronologische leeftijd en de werknemers-type-specifieke sociaal gedrag op veroudering kan worden gescheiden verkrijgen. Experiment 2 beschrijft de omkering van verzamelaars met versnelde in verpleegster bijen met vertraagde veroudering dynamiek. Experiment 3 biedt een aanpak voor het sonderen van effecten van cellulaire veroudering door Anatomical kwantificering van een gevestigde biomarker voor cellulaire veroudering (lipofuscin) ^18.

Protocol

1. Ontkoppeling Senescentie van chronologische leeftijd

Dit hoofdstuk beschrijft de opzet van dubbele cohort kolonies, die bestaan ​​uit een cohort van geïdentificeerde individuen die dezelfde chronologische leeftijd ("single leeftijdscohort") en een cohort van nest bijen te delen. Zelfde leeftijd van individuen van de ene leeftijdsgroep zal uiteindelijk scheiden in aparte werknemer-types met verschillende veroudering dynamiek - dit zijn verpleegster bijen met vertraagde en forager bijen met versnelde functionele achteruitgang. Alle procedures zijn beschreven voor een experimentele kolonie. We raden echter voeren experimenten minstens twee kolonie replicaties zodat kolonie effecten kunnen worden gecontroleerd (twee repliceren ontwerp).

1. Het voorbereiden bijenkorf dozen voor de dubbele cohort kolonies: Bereid een regelmatige bijenkorf doos die twee voedsel kammen ontvangt met honing, een ander levensmiddel kam met stuifmeel, en twee lege kammen. Zorg ervoor dat u een gekoppeld koningin evenals een donor kolonie te vinden met meer dan 3.000nest bijen. Beide zullen later worden ingevoerd (1.3).
2. Het verkrijgen en markeren individuen met gelijkaardige chronologische leeftijd: Verzamel kammen met verzegelde broed dat is ongeveer te voorschijn te komen. Voor een herhaling verwachten kammen verzamelen met een totaal van 3.000-5.000 bedekte broed. Voor elke repliceren gebruik maken van een evenwichtige hoeveelheid broed uit ten minste drie verschillende bijenkorf bronnen om een ​​scheve verdeling van maternale genotypen (bijenkorf oorsprong) te vermijden.
   1. Plaats broed kammen in een incubator ingesteld op 34 ° C en 60-70% relatieve vochtigheid. Zorg ervoor dat kammen slaan zodanig dat opkomende broed niet kan ontsnappen.
   2. Laat bijen ontstaan ​​voor twee dagen en markeer deze bijen met een kleine verf-tag op de thorax (bijv. Uni Posca, Mitsubishi Pencil Co Ltd). De verfmerkteken zal het identificeren van de bijen van de enkele leeftijdsgroep (dag van opkomst), en om ze te onderscheiden van andere repliceren kolonies.
3. Het opzetten van een dubbele cohort kolonie, die de cohort van i omvatdentified, enkel leeftijd bijen: Op de dag dat jonge bijen zijn gemarkeerd, verzamelen over 2500-3000 nest bijen van een donor kolonie (vergelijk paragraaf 1 in discussie.), en voeg deze ongemarkeerde bijen naar de korf doos die werd opgesteld vóór (zie stap 1.1). Zal de laatste mensen de ongeïdentificeerde nest bijen cohort vormen.
   1. Voeg de koningin, die in eerste instantie zal worden beperkt tot een koningin kooi (los verkrijgbaar). Verzegeling van de kooi met eetbare snoep (bijv. Apifonda, Südzucker AG, Mannheim / Ochsenfurt, Duitsland) te maken werkbijen langzaam de koningin los.
   2. Voeg de nieuw opgedoken en gemarkeerd bijen, die de ene leeftijdsgroep zullen vormen. Deze bijen zijn de enige gemerkte individuen, en zijn de focusgroep voor alle volgende stappen.
4. Monitoring foerageren begin en markering verzamelaars: Om ontstaan ​​en de dynamiek van de verpleegkundige-forager overgang in de interne leeftijdsgroep beoordelen, toezien op de demografische ontwikkeling van de foerageer-activiteit eheel andere dag voor elke kolonie. Beginnen te tellen vijf dagen na de kolonies werden opgericht (figuur 1).
   1. Tel het totale aantal bijen terugkeren uit foerageertochten (ingang tellingen) binnen 3 x 20 periodes min observatie op vaste tijden. Zorg ervoor dat u niet bijen tellen tijdens periodes van oriëntatie vluchten (zie Discussie).
   2. Wanneer ingang tellingen geven aanzienlijke foerageergebied activiteit moet beginnen (> 100 entree tellingen / dag), beginnen markering verzamelaars. Om dit te doen, verzamelaars van de enige leeftijdsgroep (enkel gemarkeerd personen) krijgen een tweede verfmerkteken bij terugkomst van hun eerste foerageergebied vluchten. Dit verfmerkteken zal de dag van foerageren begin specificeren, en zal toelaten om later identificeren van de foerageer-leeftijd voor elke verzamelaar.
   3. Herhaal dagelijks markeringen totdat een voldoende aantal bijen is gemarkeerd. Voor het schatten van een voldoende aantal gemarkeerde voedermachines, verwachten een geautomatiseerd percentage van niet meer dan 5-10% na deze bijen waren ouder, meestal na 14 dagenfoerageren.
5. Sampling: Aangezien alle aanvankelijk gemarkeerd bijen hebben een vergelijkbare chronologische leeftijd, kan leeftijd gematchte groepen van verpleegkundigen en oude verzamelaars gelijktijdig worden verzameld, wanneer verzamelaars hebben foraged voor ≥ 14 dagen.
   1. Enkele duidelijke verpleegster bijen worden verzameld binnen de korf, en worden geïdentificeerd door verplegend gedrag (voeding en reiniging van larven met hoofd naar beneden in de open broed zetten).
   2. Dubbele gemarkeerd verzamelaars worden verzameld binnen de korf voor dagelijkse foerageer activiteit begint.
   3. Verzamelen bijen in kooien (buizen, dozen) dat er voldoende ventilatie en houd donker tot verdere verwerking. Als alternatief voor transcriptomische, epigenetische of proteomics studies, direct snap bevriezen bijen in vloeibare stikstof. Verzamel evenwichtige aantallen individuen van alle testgroepen en repliceren kolonies.

2. Omkering van de werkenden met Rapid om Werknemers met Vertraagde Aging door het veranderen van de Hive's Demografie </ P>

Deze paragraaf beschrijft hoe de omkering van werknemers met versnelde veroudering (verzamelaars) werknemers met vertraagde veroudering (verpleegkundige bijen) wordt uitgevoerd. Dergelijke gedrags omkering wordt veroorzaakt, wanneer verzamelaars ervaren een gebrek aan verpleegkundige bijen, die normaal bezighouden met broed zorg. De terugkeer procedure zal scheiden een enkele kolonie repliceren in twee bijenkasten: een bijenkorf met de verpleegkundige bee fractie ("nurse-afgeleide"), en een andere met de hakselaar fractie ("jager-verzamelaar-afgeleide"). Na een succesvolle ommekeer, mogelijke symptomen van plastic en omgekeerde veroudering kan worden bestudeerd in de interne leeftijdsgroep met teruggekeerd werknemers, voortdurende voedermachines, voortdurende verpleegkundige bijen en nieuw aangeworven verzamelaars. Zoals eerder, geïdentificeerd bijen van de interne leeftijdsgroep, niet de cohort van niet-geïdentificeerde nest bijen, vormen de experimentele focusgroep.

1. Bereiding: repliceren netelroos met verpleegkundigen (enkel gemarkeerd) en verzamelaars (dubbele gemarkeerd) ter beschikking worden gesteld, zoals beschreven in de vorige paragraaf. Zorg ervoor dat niet beginnen omkering minder dan 500 gemarkeerd voedermachines per herhaling kolonie voldoende ontsluiting na de terugkeer is voltooid.
   1. Voor een veilige identificatie van testgroepen na omkering is het cruciaal dat de gehele forager bevolking in de originele korf is gemarkeerd voordat terugkeer. De volgende procedure wordt beschreven voor een herhaling.
   2. De dag voor terugkeer, bereiden een extra bijenkorf doos voor de hakselaar afgeleide korf (zie stap 1.1). Zoek twee koninginnen en twee broed kammen van donor bijenkasten. Vóór de overdracht naar de experimentele kolonies borstel weg alle volwassen bijen uit deze kammen. Een gekooide koningin (zie stap 1.3) en een brood kam zal koningin en broed kammen vervangen in de originele bijenkorf doos. De andere set van koningin en broed kam zal gebruikt worden de volgende dag voor de nieuwe bijenkorf doos. Vergelijkbare toewijzing van nieuwe broed kammen en buitenaardse koninginnen voor zowel de oorspronkelijke als de nieuwe korf wordt geadviseerd om ervoor te zorgen dat gescheiden verzamelaars en verpleegkundiges zal eveneens ervaring veranderd hive cues ("hive ruiken").
2. Reversion: In de ochtend, net voor de terugkeer, voeg de gekooide koningin en het broed kam om de nieuwe doos die de hakselaar afgeleide fractie zal ontvangen. Wacht tot de piek foerageertijd begint. Verplaats dan de oorspronkelijke kolonie met gemarkeerde verzamelaars en verpleegkundige bijen ten minste 100 meter van de oorspronkelijke locatie.
   1. Op de oorspronkelijke locatie, het opzetten van de nieuwe doos voor de hakselaar afgeleide korf met broed en slechts koningin.
   2. Foragers zal de ontwrichte originele bijenkorf doos verlaten, en ga terug naar de oorspronkelijke locatie. Laat verzamelaars om terug te keren naar de oorspronkelijke locatie voor 2 uur om te komen naast de scheiding van de hakselaar bevolking uit nest bijen te voltooien.
   3. Dan, om scheiding te beëindigen, sluit de originele, nu 'nurse-afgeleide "bijenkorf, en over te dragen ten minste 3 km afstand van een bijenstal.
3. Hive onderhoud en monitoring voor een succesvolle maatschappelijke opdrachtomkering: Controleer de experimentele korven regelmatig voor een gezonde, geopend kroost.
   1. Tijdens de eerste dagen na kolonie manipulatie vervangen onbeheerd en dode broed om potentiële ziekteverwekker reduceren.
   2. Om succesvol omkering valideren binnen de-forager afgeleide bijenkorf, foto's raten die broed duren voordat de invoering van deze, en opnieuw toen kammen worden vervangen of wanneer de terugkeer experiment voltooid is (figuur 2). Gebieden met eerder afgetopte broed en met open, live-broedsel zijn betrouwbare markers van de verpleegkundige activiteit in-forager afgeleide kolonies.
4. Sampling: Fysiologische effecten die sociale omkering begeleiden kan worden gedetecteerd 3-8 dagen na verzamelaars en verpleegkundigen werden gescheiden.
   1. Wij adviseren bemonstering alle testgroepen, dwz teruggekeerd werknemers en voortgezette verzamelaars (-forager afgeleid bijenkorf), alsmede de aanhoudende verpleegkundigen en nieuw aangeworven verzamelaars (-verpleegkundige afgeleid bijenkorf) 8 dagen na omkering wordt gestart.
   2. Collect monsters zoals beschreven in stap 1.5.

3. Het analyseren Worker-soort Specifieke Cellular Senescentie Patterns door Kwantificering van Lipofuscine

Lipofuscine is een universele biomarker van cellulaire veroudering. Als een intrinsieke accumulatie product kunnen specifieke autofluorescentie lipofuscine's (emissie _max = 530-650 nm) worden gebruikt voor de detectie ^18.

1. Dissectie en fixatie: Chill bijen op ijs tot onbeweeglijk, te verwijderen en ontleden de gewenste weefselmonster.
   1. Breng in fixatief (4% paraformaldehyde in fosfaat gebufferde zoutoplossing, PBS, pH 7,2) gedurende een nacht incubatie bij 4 ° C.
   2. Was monsters 3 keer in PBS.
2. Tissue verwerking en montage: Snijd weefselmonsters in secties met niet meer dan 40 urn dik, bijvoorbeeld door een trillend mes microtoom, bijv. VT 1000S Leica (Leica Biosystems, Nussloch, Duitsland).
   1. Monteer hoofdstukken over microscopische dia's in 50% glycerol (PBS). Voor de lange termijn opslag seal dekglaasjes met nagellak.
3. Beeldacquisitie: Om lipofuscin detecteren, raden we het gebruik van een laser scanning confocale microscoop die laser-lijnen biedt met λ = 514, 561nm of soortgelijke voor excitatie, en met de detector bandbreedte ingesteld op 570-650 nm.
   1. Voor een betere identificatie van lipofuscin, voorzien van een tweede kanaal, en doe een gelijktijdige scan bij kortere golflengte spectra (excitatie = 405 nm; emissie = 410-450 nm). De langere golflengte kanaal openbaren beide korrelig lipofuscine, maar ook niet-specifieke "achtergrond" door autofluorescente trachea en andere niet-granulaire structuren. De tweede, kortere golflengte kanaal zal alleen onthullen aspecifieke autofluorescence, maar niet lipofuscin. Zo kan lipofuscin identificatie te faciliteren draaid door vergelijking van de signalen in beide kanalen, met slechts een van hen waaruit de korrels met lipofuscine specifieke fluorescentie.
   2. Voor de overname van hoge-resolutie afbeeldingen een objectief met 40x vergroting of hoger, en bij voorkeur een numerieke opening van 1,25 of hoger. Afbeelding scannen stapels met afmetingen van ongeveer 100 x 100 x 10 micrometer ^3. Ieder individu en weefselmonster moet worden vertegenwoordigd door meerdere image stacks.
   3. Intra-individuele en inter-individuele variatie door technische variatie te verminderen, altijd laservermogen en gevoeligheid detector constant.
   4. Om vertekening verminderen van dag tot dag technische variaties scannen gelijke aantallen monsters van alle testgroepen in elk van de meerdere sessies scannen.
4. Beeldverwerking: Gebruik software pakketten met modules die het mogelijk maken voor geavanceerde verwerking van microscopisch beeld stacks, bijvoorbeeld ImageJ (US National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, Verenigde Staten,gej.nih.gov / ij / "target =" _blank "> http://imagej.nih.gov/ij/).
   1. Genereer een 2D maximale projectie van elk van de 3D-afbeelding stacks.
   2. Breng een Gauss filter met een geringe korrelgrootte om hoogfrequente ruis verminderen, en structuren behouden met afmetingen van lipofuscine granules.
   3. Samenvoegen beide kleurkanalen om identificatie van lipofuscin (zie stap 3.2) te vergemakkelijken.
5. Beeldanalyses: Zorg ervoor dat het onderwerp het uitvoeren van de kwantificering stappen blind voor groepsidentiteit testen zal zijn.
   1. Voor alle beelden, kies eerst een regio van belang (ROI) dat de relevante structuren omvat, en heeft dezelfde afmetingen als de ROI van andere beelden.
   2. Selecteer vervolgens het gewenste aantal lipofuscin korrels dat elke ROI vertegenwoordigen. Bij het selecteren van lipofuscin korrels binnen een ROI, zal de toepassing van de volgende regels subjectieve vertekening te verminderen.
      1. Kies een consistente locatie voor het selecteren van de eerste granulaatle. Dit kan bijvoorbeeld de meest linkse rand van een ROI, en de korrel die het dichtst bij de rand altijd de eerste keuze zijn.
      2. Een na de ander, zijn korrels gekozen die het dichtst bij de vorige selectie (buurman) zijn.
      3. Bij de keuze van de buurman, alleen verplaatsen in een richting, bijvoorbeeld alleen recht zoeken bij de vorige selectie. Deze regel voorkomt dat de selectie wordt gedomineerd door incidentele clusters van dicht op elkaar gepakte korrels.
      4. Bij selectie voltooid, beoordeelt de grootte van elk deeltje met een overzicht van lipofuscine en het meten van de respectieve granule gebied. Gebruik de juiste statistische tests te vergelijken individuen van de verschillende testgroepen.

Representative Results

Protocol deel 1 en deel 2 detail hoe testgroepen kan worden verkregen om de kenmerken van versnelde bestuderen, vertraagd en teruggedraaid veroudering in kolonies met een enkele leeftijdsgroep. Voor het bewaken van werknemer-soort differentiatie dat de normale ontogenie onderzochten we forager tellingen ("ingang telt") voor 6 kolonies (figuur 1, vergelijk hoofdstuk 1) begeleidt. De grafieken laten zien dat aanzienlijke verandering van verpleegster om de hakselaar staat wordt meestal niet waargenomen voor individuen zijn meer dan 10 dagen oud. Gemarkeerd variabiliteit verzamelaar tellingen werd waargenomen met betrekking tot de timing van begrazingsmanagement ontstaan ​​tussen verschillende kolonies, en een duidelijke dag-tot-dag variatie binnen elke kolonie. Naast kolonie specifieke demografische factoren, zoals verschillende broed belasting, wordt veel variatie verklaard door wisselende weersomstandigheden (tijdstippen rood gemarkeerd in figuur 1). Nauwlettend volgen van de foerageer dynamiek daarom wordt geadviseerd om markering en collectie inspanningen te optimaliseren during het experiment.

De omgekeerde ontogenie (deel 2) van foerageren terug naar verpleegkundige taken kunnen worden gevalideerd door de inspectie kroost kammen die worden geïntroduceerd in de hakselaar afgeleide kolonies (zie stap 2.2 en 2.3). Voor drie herhalingen figuren 2A, C, en E tonen broed kammen voordat deze-forager afgeleid kolonies. Figuren 2B, D en F tonen de respectieve kammen na verwijdering. Patches van nieuw afgedekt kroost, gezonde larven, en verhoogde pollen opslag rond broed geven aan dat voormalige verzamelaars nu met succes uitgevoerd typische nest, waaronder verpleegkundige taken.

Lipofuscine (hoofdstuk 3) is een sterk geconserveerd symptoom van cellulaire veroudering, en kan gemakkelijk worden beoordeeld voor post-experimentele analyses in de verschillende bijen weefsels. Figuur 3 contrasteert lipofuscin accumulatie, gemeten als korrelgrootte (figuur 3E), in de hypopharyngeal klieren van dezelfde leeftijd verpleegkundige eennd forager bijen. Het verschil in chronologische leeftijd tussen de twee jonge en de twee oude groepen was ≥ 17 dagen, met slechts een groep (verzamelaars) de besteding van deze ≥ 17 dagen met buiten vlucht en voedsel verzamelen activiteiten. Representatieve microscopische beelden (Figuren 3A-D) tonen verhoogd lipofuscin accumulatie alleen voor de groep oudere verzamelaars na meer dan 17 dagen van foerageren (figuur 3D), niet voor oudere verpleegster bijen van gelijkaardige chronologische leeftijd (37-43 dagen; Figuur 3B) . Een twee-faculteit ANOVA met de vaste belangrijkste factoren werknemer type (verzamelaars, verpleegkundigen) en verschil in leeftijd (Δage ≥ 17 dagen) bleek significante effecten voor de werknemer-type, verschil in leeftijd en de interactie tussen beide factoren _(F-type = 33.67, P <0,001; F _Δage = 21.93, p <0,001; _{F-type x Δage} = 22.07, P <0.001). Echter, Post-hoc tests toonden significante effecten alleenwanneer contrasterende oudere verzamelaars (≥ 17 dagen van foerageergebied) voor jongere verzamelaars, of beide verpleegkundige groepen (PF 17d versus F _1d/N1d/N17d <0,001, Fisher's LSD; figuur 3E). Er werd geen verschil waargenomen tussen de laatste drie groepen, waaronder chronologisch jong en oud verpleegkundige groepen (alle testen met P> 0,5, Fisher's LSD; figuur 3E). Dit suggereert dat accumulatie van lipofuscine afhankelijk hakselaar specifieke activiteiten (voederen leeftijd), in plaats functie van chronologische leeftijd slechts zodanig.

Figuur 1. Worker type differentiatie tijdens de normale ontogenie. De grafiek toont ingang tellingen van verzamelaars terugkeren uit foerageertochten geteld voor 6 verschillende kolonies beginnen 5 dagen nadat ze waren vastgesteld (voor details vergelijken Protocol paragraaf 1.4). Aanzienlijke overgang van nest te foerageren activiteiten werd voor het eerst waargenomen wanneer gemerkte individuen van de ene leeftijdsgroep waren ongeveer 10 dagen oud. Variërend pistes voor de cumulatieve entree tellingen geven aan dat de dynamiek van de verpleegster bijen te forager overgang verschillen tussen kolonies, en worden beïnvloed door klimatologische factoren. Bijvoorbeeld, op dagen met regen en minder dan twee uur van het voederen, de toename van de ingang tellingen afgevlakt typisch uitgevoerd (datapunten in het rood).

Figuur 2. Valideren van gedragsmatige terugval. Om te testen of verzamelaars met succes zijn teruggekeerd naar verpleegkundige taken, vergeleken we broed kammen voordat ze werden geïntroduceerd in-forager afgeleide netelroos, en nadat ze werden verwijderd uit deze bijenkasten. Representatieve beelden tonen broed kammen vóór de invoering (A, C, E) enna verwijdering (B, D, F) van drie verschillende-forager afgeleid netelroos, respectievelijk. Brood zorg door vorige forager bijen wordt aangegeven door een toenemend aantal cellen met afgetopte broed (B, D, F; zwarte pijl, inzet in D), duurzame overleving van larven in de open cellen (rode pijl) en een verhoogde opslag van pollen in de buurt van broed (witte pijl). Merk op dat-hakselaar afgeleide-kolonies aanvankelijk zijn doorgaans minder efficiënt in het verzorgen van de broed dan-verpleegkundige afgeleide kolonies. Dit kan leiden tot hogere larvale mortaliteit in de hakselaar-afgeleide kolonies. Foto's in B, D, F werden genomen 5, 4 en 7 dagen na de broed kammen in-hakselaar afgeleid kolonies werden geïntroduceerd.

Figuur 3. Accumulatie van lipofuscine, een biomarker van celular veroudering, kan de werknemer-type-specifieke weefsel verslechtering geven. Vertegenwoordiger microscopische beelden van hypofarynx klieren in jonge (A) en de oude verpleegkundige bijen (B), alsmede in vergelijkbare leeftijd forager bijen met ≥ 1 dag (C), respectievelijk ≥ 17 dagen foerageren ervaring (schaal bar in A = 20 micrometer). Lipofuscine accumulatie werd gemeten als korrelgrootte, en wordt gegeven als medianen en kwartielen voor N = 5 personen per jaar en arbeider type (E). Voederen voor 17 dagen resulteerde in significant lipofuscin accumulatie, terwijl in dezelfde periode niet heeft geleid tot lipofuscin veranderingen in de verpleegkundige bijen (voor de statistieken zie Resultaten).

Discussion

We nemen hier eerder beschreven benaderingen ^{8,16,17,19,20,} en integreren in een enkele workflow die zal vergemakkelijken studeren flexibel veroudering in honingbijen. Ons doel is om wetenschappers die beginner zijn voorzien om dit gebied met een gestandaardiseerd instrument ingesteld om relevante steekproef materiaal te verkrijgen, en om experimentele reproduceerbaarheid tussen de verschillende onderzoeksteams te verbeteren. Terwijl onze procedures worden vereenvoudigd en geen speciale apparatuur vereisen zoals in eerdere beschrijvingen (vergelijk bijvoorbeeld ^8), zijn enkele maatregelen uit voorzorg geadviseerd en worden hieronder verzameld.

Ontkoppeling veroudering van de chronologische leeftijd. Een zeer cruciaal aspect is om valse identificatie van forager bijen tijdens de eerste bevestiging van foerageer-gedrag ^(2e markering) te vermijden. Daarom, wanneer verzamelaars moeten worden bewaakt ("ingang telt") of gemerkt, hoeft strikt vermijden dagdelen met oriëntatie vluchten. Tijdens deze periodes vele pre-foraGing stadium bijen zal afwijken van of voer de korf. Deze bijen hebben geen typische fysiologische kenmerken van volwassen verzamelaars tonen, maar het opbouwen van een ruimtelijke kaart van de korf omgeving door duidelijk herkenbaar cirkelvormige vlucht patronen ^21.

Terwijl de meeste bijen veranderen in foerageren met de leeftijd van 2 weken en ouder, wordt sporadisch foerageergebied reeds waargenomen op zeer jonge leeftijd (figuur 1). Zeer vroegrijpe verzamelaars meestal ontwikkelen rechtstreeks van Callow nest bijen zonder te hebben doorgegeven via de verpleegkundige podium. Om niet personen met een dergelijke afwijkende ontogenie (vergelijk ²² en referenties daarin) bevatten, worden personen die beginnen foerageren met de leeftijd van 10 dagen of minder niet in aanmerking voor verdere analyses.

Om oververtegenwoordiging van vroegrijpe verzamelaars verder te voorkomen, hebben we geen gebruik van de klassieke "single cohort kolonies" dat alleen van de ene leeftijdsgroep ^17,23 bestaan ​​te maken. In plaats daarvan, bij het opzetten vankolonies voegen we willekeurig nest bijen ("nest bee cohort") om de gemarkeerde enkele leeftijdsgroep (zie stap 1.1 en 1.3). Aangezien willekeurige nest bijen zijn meestal ouder, kunnen zij de druk op zeer jonge bijen te groeien tot zeer vroegtijdige verzamelaars ¹⁷ verminderen. Dergelijke dubbele cohort kolonies, kan daarom beter lijken op een natuurlijke bijenkorf demografie met individuen die langzaam evolueren van verpleging te foerageren.

Bij langdurige werknemer specifieke aanpassingen moeten worden bestudeerd, het verzamelen van alle testgroepen buiten foerageren uur. Dit wordt geadviseerd om vertekening te verminderen door meer acute metabole aanpassingen als gevolg van recente motorische activiteiten, bijvoorbeeld vermoeiend vlucht.

Omkering van de werknemers met een snelle tot vertraagde veroudering door het veranderen van de demografie de korf's. Na verzamelaars terug naar de oorspronkelijke locatie is het essentieel de-verpleegkundige afgeleide hive (> 3 km) te bewegen weg was gevlogen. Dit is om te voorkomen dat de pre-foerageren fase bijen worden geworven en begeleid naar deoude locatie door andere bijen, respectievelijk door middel van feromonen communicatie ^24.

Om verder te voorkomen dat elke verpleegkundige of andere pre-foerageren personen uit het invoeren van de-forager afgeleide bijenkorf, raden wij u aan, met de volgende regels: (I) Beëindig de scheiding procedure voor dagelijkse oriëntatie vluchten beginnen. (II) proberen omkering Alleen op dagen dat sterke foerageer-activiteit wordt waargenomen. (III) Tijdens en na de eerste translocatie van de oorspronkelijke korf, onnodige roeren van bijen, in het bijzonder heeft de korf niet openen.

In principe, meer kunstmatige setups dat verzamelaars beperken in een-verpleegkundige beroofd omgeving ook kan leiden tot terugkeer. Dergelijke opstellingen alleen informatieve waarde hebben beperkt, aangezien de-hakselaar afgeleide fractie ervaringen van andere stressvolle omgevingen, waardoor er geen een directe vergelijking met controlegroepen uit-verpleegkundige afgeleide kolonies.

Verschillende veroudering patronen bevestigtdoor kwantificering van lipofuscin, een biomarker van cellulaire veroudering. Hier geïllustreerd we lipofuscin evaluatie met foto's en statistische gegevens van de hypofarynx klieren omdat lipofuscin is het meest gemakkelijk te detecteren in dit weefsel. Hierbij nemen wij geloven belangrijk om de onervaren waarnemer instelling van de juiste protocollen voor microscopische detectie helpen. Echter, in tegenstelling tot andere weefsels, hypofarynx klieren geen significante apoptose en necrose geven tijdens verpleegkundige om de overgang ²⁵ Forager. Dergelijke processen kunnen interageren met accumulatie van de veroudering marker, hoewel we geen verhoogde niveaus van lipofuscin heeft detecteren bij jonge verzamelaars die onlangs uit verpleegkundige taken (Figuren 3C, E) was veranderd. Echter, om veroudering maatregelen in andere bijen weefsels te beoordelen, de microscopie-gebaseerde methoden hier beschreven kan gemakkelijk worden aangepast.

Als alternatief, stroom-cytometrische benaderingen zijn minder tijdrovend ^26. -Microscopie gebaseerde analyseshebben het voordeel dat cellulaire veroudering symptomen kunnen worden beoordeeld voor verschillende regio's of zelfs voor cellen in een organen ^27. Voor studies in de hersenen en andere complexe organen met ruimtelijke heterogeniteit in cellulaire veroudering ^28, daarom raden wij de microscopie gebaseerde aanpak.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Apifonda	Südzucker AG, Mannheim/Ochsenfurt, Germany
paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	158127
phosphate-buffered saline	Sigma-Aldrich	P4417
Glycerol	Merck	1.04094.1000