Beziehen Proben mit verlangsamt, Beschleunigte und Umge Aging in der Honig-Bienen-Modell

Summary

In Arbeitsbienen, hängt Altern auf Sozialverhalten und nicht auf das chronologische Alter. Hier zeigen wir, wie Arbeiter-Typen mit sehr unterschiedlichen Alterungsmuster erhalten und für die zelluläre Seneszenz analysiert werden.

Abstract

Gesellschaften sehr soziale Tiere verfügen über große Lebensdauer Unterschiede zwischen nahe verwandten Individuen. Unter sozialen Insekten, ist die Honigbiene, die am besten etablierten Modell zu untersuchen, wie die Plastizität der Lebenserwartung und Alterung wird durch soziale Faktoren erklärt.

Die Arbeiterkaste der Honigbienen gehören Krankenschwester Bienen, die die Brut neigen und Sammlerinnen, die Nektar und Pollen zu sammeln. Frühere Arbeiten haben gezeigt, dass die Gehirnfunktionen und Flugleistung altern schneller in Sammlerinnen als in Krankenschwestern. Allerdings kann die Gehirnfunktionen zu erholen, wenn Häcksler wieder zurück zu Pflegeaufgaben. Solche Muster der beschleunigt und umgekehrt Funktions Seneszenz sind an veränderte Stoffwechsel Ressource Ebenen verknüpft sind, um Veränderungen in der Proteinmenge und die Immunfunktion. Vitellogenin, einem Eigelb Protein mit angepassten Funktionen in hormonelle Steuerung und zelluläre Abwehr, kann als eine wichtige regulatorische Element in einem Netzwerk, das die unterschiedlichen Alterungsdynamik in Arbeiter steuert dienen.

Hier beschreiben wir, wie die Entstehung von Krankenschwestern und Sammlerinnen können überwacht werden, und manipuliert werden, einschließlich der Auflösung von in der Regel nur von kurzer Dauer Sammlerinnen in langlebiger Krankenschwestern. Unsere repräsentative Ergebnisse zeigen, wie Individuen mit ähnlichen chronologischen Alter differenzieren sich in Sammlerinnen und Krankenschwester Bienen unter experimentellen Bedingungen. Wir veranschaulichen, wie Verhaltensumkehr von Sammlerinnen zurück zu Krankenschwestern können validiert werden. Schließlich zeigen wir, wie verschiedene Zellalterung kann durch Messen der Akkumulation von Lipofuscin, eine universelle Biomarker der Alterung geprüft.

Für die Untersuchung Mechanismen, die soziale Einflüsse verbinden kann und Alterungs Plastizität, bietet dieses Protokoll ein standardisiertes Tool, um relevante Probenmaterial zu erwerben, und die Vergleichbarkeit der Daten bei zukünftigen Studien zu verbessern.

Introduction

Die komplexen Strukturen der Kolonie sehr soziale Tiere werden durch das Zusammenspiel eines Fortpflanzungs Kaste gehalten und ein Helfer Kaste der Regel nicht-Wiedergabe Arbeitnehmer mit unterschiedlichen sozialen Aufgabe Verhaltensweisen. In den verschiedenen Arbeiter, spezifische physiologische Anpassungen ermöglichen deutliche sib Pflege Verhalten und werden auch extreme Unterschiede Lebensdauer verbunden. Honigbienen und Nacktmulle stellen die besten entwickelten Tiermodell zu untersuchen, wie Sozialität ist, um Muster der beschleunigten, unerheblich oder umgekehrt Alterungs ^3.1 verknüpft.

In Bienenvölkern ist eine einzige eierlegende Königin von Tausenden von Arbeitnehmern, die die Brut-, Futter für Lebensmittel sind in der Regel unterstützt wird, und bei der Bewachung, Thermoregulation oder hygienische Verhaltensweisen ⁴ eingreifen. Unter dieser Arbeiter sind die extrem kurzlebige Häcksler, Krankenschwester Bienen mit Zwischen-und Winter (diutinus) Bienen mit der längsten Lebensdauer. Menschen sind jedoch nicht permanent an einem bestimmten WO gebundenrker-Typ, aber zeigen eine flexible Verhaltens Ontogenese, sie von einer sozialen Aufgabe, Verhalten ändern, um eine andere ("zeitliche Kasten"). Callow Bienen zum Grübeln neigen Krankenschwester Bienen verändern, was kann schließlich außerhalb Futtersuche ändern. Allerdings kann callow Nest Bienen auch in langlebigsten Winterbienen zu verwandeln, und kurzlebig Häcksler kann sogar in der Regel langlebiger Krankenschwestern zurück. Arbeitnehmer mit extremen (Winterbienen) und Mittelstufe (Krankenschwester Bienen) Lebensdauer verfügen über gut entwickelte Lebensmittelproduktion und Speicherorgane mit reichlich Ressourcen - im Gegensatz zu kurzlebigen Häcksler (in ^1,5 bewertet). Jedoch, dass die Regelung von Einzel Lebensdauer geht über einfache Änderungen in Ressourcenbilanz eines Menschen ist durch die Forschung auf einem Eigelb-Protein, das vielfältige angepasst Funktionen in der Nicht-Wiedergabearbeiterkaste hat, wie Gelee Produktions ^6, hormonelle Steuerung ^7, Immun vorgeschlagen ⁸ und antioxidative Verteidigungs ^9.

Patterns of functional Rückgang (Seneszenz) Spiegel Lebensdauer Ungleichheiten unter den Arbeitnehmern, wie für andere Riechhirn oder motorischen Funktionen ^10-13 gegründet, und auch. Insbesondere der deutliche Rückgang der Lernfunktion nach nur zwei Wochen der Nahrungssuche entspricht eine ähnliche Mortalitätsverlauf in Sammler ^14, im Gegensatz zu dem Fehlen von nachweisbaren Rückgang (vernachlässigbare Seneszenz) in langlebigen Winterbienen ^15.

Um die molekularen Fingerabdrücke der Alterung wir flexible angepasst etablierten experimentellen Paradigmen, die für die Überwachung und Manipulation Aging-Typ-Übergänge ermöglichen ^8,16,17 identifizieren. Versuch 1 Details, wie man Proben, in denen die Auswirkungen der chronologischen Alter und Arbeitnehmertyp-spezifische soziale Verhaltensweisen auf die Alterung getrennt werden können, zu erhalten. Experiment 2 beschreibt die Umkehrung der Häcksler mit beschleunigten in Krankenschwester Bienen mit verlangsamten Alterungsdynamik. Experiment 3 liefert einen Ansatz zur Untersuchung von Auswirkungen von zellulärer Seneszenz durch anatomical Quantifizierung eines etablierten Biomarker für Zellalterung (Lipofuszin) ^18.

Protocol

1. Die Entkopplung von Seneszenz chronologischen Alter

Dieser Abschnitt beschreibt die Einrichtung von Doppel Kohorte Kolonien, die aus einer Gruppe von Individuen identifiziert, die den gleichen chronologischen Alter ("single Alterskohorte") und eine Kohorte von Bienen Nest Aktien bestehen. Gleiche Alter Individuen der einzelnen Alterskohorte wird schließlich in verschiedenen Arbeiter-Typen mit unterschiedlichen Alterungsdynamik zu trennen - das sind Krankenschwester Bienen mit verlangsamter und Sammlerinnen mit beschleunigten Funktionsabnahme. Alle Verfahren sind für eine experimentelle Kolonie beschrieben. Wir empfehlen jedoch Experimente für mindestens zwei Kolonie durch repliziert, so dass Kolonie Effekten kann (zwei Replikat-Design) gesteuert werden.

1. Vorbereiten Bienenstock-Boxen für den Doppel Kohorte Kolonien: Bereiten Sie eine regelmäßige Struktur ein, die zwei Lebensmittel Kämme mit Honig erhält, einen anderen Lebensmittelkamm mit Pollen, und zwei leere Kämme. Achten Sie auf eine gepaart Königin sowie ein Spender Kolonie mit mehr als 3.000 lokalisierenNest Bienen. (1.3) beide später eingeführt werden.
2. Beziehen und Kennzeichnung Individuen mit ähnlichen chronologischen Alter: Sammeln Kämme mit verdeckelten Brut, die im Entstehen ist. Für ein Replikat erwarten, Kämme mit insgesamt 3.000-5.000 verdeckelten Brutzellen zu sammeln. Für jede Wiederholung verwenden eine ausgewogene Menge an Brut aus mindestens drei verschiedenen Quellen, um Bienenstock schiefen Verteilungen von Genotypen (Bienenstock Herkunft) zu vermeiden.
   1. Zeigen Brutwaben in einem Inkubator auf 34 ° C mit 60 bis 70% relative Feuchte eingestellt. Achten Sie darauf, Kämme in einer Weise, dass die Schwellen Brut nicht entweichen kann speichern.
   2. Lassen Bienen entstehen für zwei Tage und markieren diese Bienen mit einer kleinen Lack-Tag auf den Brustkorb (zB Uni POSCA, Mitsubishi Pencil Co. Ltd.) Die Farbmarkierung ermöglicht die Identifizierung der Bienen der einzelnen Altersjahrgangs (Tag der Entstehung) und um sie von anderen Replikat-Kolonien zu unterscheiden.
3. Einrichten einer Doppel Kohorte Kolonie, die die Kohorte von i enthältdentified, single Alter Bienen: An dem Tag, jungen Bienen markiert wurden, sammeln etwa 2.500-3.000 Nest Bienen von einem Spender Kolonie (vgl. Abschnitt 1 in Diskussion.) und fügen Sie diese nicht markierten Bienen in den Bienenstock-Box, die vor vorbereitet wurde (siehe Schritt 1.1). Letztere wird den nicht identifizierten Personen Nest Biene Kohorte bilden.
   1. Fügen Sie die Königin, die zunächst zu einem Doppelkäfig (im Handel erhältlich) beschränkt wird. Verschließen Sie den Käfig mit essbaren Süßigkeiten (zB Apifonda, Südzucker AG, Mannheim / Ochsenfurt, Deutschland), um Arbeitsbienen geben langsam die Königin.
   2. Fügen Sie die neu entstandenen und markierte Bienen, die die einzelnen Altersjahrgangs darstellen wird. Diese Bienen sind die einzigen markierten Individuen, und sind die Fokusgruppe für alle folgenden Schritte.
4. Überwachung der Nahrungssuche Beginn und Kennzeichnung Sammlerinnen: Zur Entstehung und Dynamik der Krankenschwester-to-Häcksler Übergang in eine einzige Alterskohorte zu bewerten, überwachen die demographische Entwicklung der Sammelaktivität esehr anderen Tag für jeden Kolonie. Beginnen Zählen fünf Tage nach Kolonien wurden (Abbildung 1) gesetzt.
   1. Zählen Sie die Anzahl der Bienen Rückkehr aus Futtersuche Flüge (Eingang zählt) innerhalb von 3 x 20 min Beobachtungszeiträume zu festen Zeiten. Achten Sie darauf, die Bienen in Zeiten der Orientierung Flüge zählen nicht (siehe Diskussion).
   2. Als Eingang zählt zeigen erhebliche Futtersuche zu beginnen (> 100 Eingang counts / Tag), beginnen Kennzeichnung Häcksler. Um dies zu tun, Sammlerinnen der einzelnen Alterskohorte (Einzel markierten Individuen) erhalten eine zweite Farbmarkierung nach der Rückkehr von ihrer ersten Flüge Nahrungssuche. Diese Farbmarkierung wird der Tag der Futtersuche Beginn anzugeben, und wird es ermöglichen, später identifizieren die Nahrungssuche für jedes Alter Häcksler.
   3. Täglich wiederholen Markierungen, bis eine ausreichende Anzahl von Bienen wurde markiert. Für die Abschätzung einer ausreichenden Anzahl von markierten Sammlerinnen, erwarten eine Wiederfindungsrate von nicht mehr als 5-10%, nachdem diese Bienen war gealtert worden, in der Regel nach 14 TagenFuttersuche.
5. Sampling: Da alle ursprünglich markierten Bienen haben eine ähnliche chronologische Alter kann altersgleichen Gruppen von Krankenschwestern und alte Sammler gleichzeitig gesammelt werden, als Sammlerinnen haben für ≥ 14 Tage Futter gesucht.
   1. Einzel deutliche Krankenschwester Bienen im Bienenstock gesammelt und werden von Pflegeverhalten (Fütterung und Reinigung der Larven mit Kopf nach unten in offenen Brutzellen setzen) identifiziert.
   2. Doppel markiert Sammlerinnen sind auch in den Bienenstock gesammelt vor der täglichen Futtersuche beginnt.
   3. Bienen sammeln in Käfigen (Tuben, Schachteln), die eine ausreichende Belüftung zu gewährleisten, halten und dunkel bis zur Weiterverarbeitung. Alternativ zur Transkriptom-, Proteom-oder epigenetische Studien direkt Snap Bienen Einfrieren in flüssigem Stickstoff. Sammeln ausgewogene Zahl von Personen aus allen Testgruppen und zu replizieren Kolonien.

2. Umkehr der Arbeiter mit Rapid auf Arbeitnehmer mit Verlangsamte Aging durch Ändern der Hive Demographie </ P>

Dieser Abschnitt enthält Details, wie die Umkehrung von Arbeitnehmern mit beschleunigten Alterung (Häcksler) Arbeitnehmer mit verlangsamter Alterung (Krankenschwester Bienen) durchgeführt wird. Solche Verhaltensumkehr induziert wird, als Sammlerinnen erleben einen Mangel an Ammen, die normalerweise in der Brutpflege zu engagieren. Die Reversion Verfahren wird getrennt eine einzelne Kolonie in zwei Bienenstöcke zu replizieren: Bienenstock mit der Krankenschwester Biene Fraktion ("Krankenschwester-abgeleitete"), und eine andere mit dem Häcksler Fraktion ("Häcksler abgeleitete"). Nach der erfolgreichen Umkehr, mögliche Symptome von Kunststoff-und umgekehrt Alterung in der einzigen Alterskohorte mit rückgängig Arbeiter, weiterhin Sammlerinnen, Weiterbildung Krankenschwester Bienen und neu eingestellten Sammlerinnen untersucht werden. Nach wie vor identifiziert Bienen der einzelnen Altersjahrgangs, nicht die Kohorte von nicht identifizierten Nest Bienen bilden die experimentellen Fokusgruppe.

1. Zubereitung: Replizieren Nesselsucht mit Krankenschwestern (Einzel markiert) und Häcksler (Doppel markiert) zur Verfügung gestellt werden, wie im vorherigen Abschnitt beschrieben. Achten Sie darauf, nicht anfangen Reversion mit weniger als 500 markierte Sammler pro Wiederholung Kolonie, um eine ausreichende Abruf nach der Rückkehr abgeschlossen ist sicherzustellen.
   1. Für die sichere Identifikation von Testgruppen nach Umkehr ist es entscheidend, dass die gesamte Bevölkerung in den Häcksler ursprünglichen Bienenstock wurde, bevor Reversion markiert. Das folgende Verfahren ist für ein Replikat beschrieben.
   2. Am Tag vor der Rückkehr, bereiten eine weitere Bienenstock-Box für den Häcksler-abgeleitete Struktur (siehe Schritt 1.1). Suchen Sie zwei Damen und zwei Brutwaben aus Spendernesselsucht. Vor der Übergabe an den experimentellen Kolonien Pinsel entfernt alle erwachsenen Bienen aus diesen Kämme. Ein Käfig Königin (siehe Schritt 1.3) und eine Brutwaben wird Königin und Brutwaben in der ursprünglichen Struktur ein ersetzen. Die andere Gruppe von Königin und Brutwaben werden am nächsten Tag für den neuen Bienenstock-Box verwendet werden. Ähnliche Zuteilung neuer Brutwaben und Alien-Königinnen für beide, das Original und die neue Bienenstock wird empfohlen, um sicherzustellen, dass getrennte Sammlerinnen und Krankenschwesters gleichermaßen Erfahrung verändert Bienenstock Cues ("hive Geruch").
2. Reversion: Morgens, kurz vor der Rückkehr, fügen Sie den Käfig Königin und die Brut Kamm zu der neuen Box, die die Häcksler-abgeleiteten Fraktion erhalten wird. Warten Sie, bis der Spitzennahrungssuche beginnt. Dann bewegen Sie die ursprüngliche Kolonie markiert mit Häcksler und Krankenschwester Bienen mindestens 100 m entfernt von der ursprünglichen Position.
   1. Am ursprünglichen Standort, Einrichtung der neuen Box für den Häcksler-abgeleiteten Bienenstock mit Brut und nur Königin.
   2. Foragers verlassen die dislozierten ursprünglichen Struktur ein, und zurück an den ursprünglichen Speicherort. Lassen Sie den Häcksler an den ursprünglichen Speicherort für 2 Stunden, um zu erreichen neben Trennung der Häcksler Bevölkerung von Bienen Nest vervollständigen zurückzukehren.
   3. Dann, um die Trennung zu beenden, schließen Sie das Original, jetzt "Krankenschwester-abgeleitete" Bienenstock, und es auf dem Bienenstand mindestens 3 km entfernt.
3. Hive Wartung und Überwachung für erfolgreiche gesellschaftliche AufgabeAuflösung: Überprüfen Sie die experimentelle Bienenstöcke regelmäßig für gesunde, offene Brut.
   1. In den ersten Tagen nach der Kolonie Manipulation ersetzen unbeaufsichtigt und tote Brut, um mögliche Erreger Last zu reduzieren.
   2. Um erfolgreich zu Umkehr in der Häcksler-abgeleiteten Bienenstock zu validieren, machen Sie Fotos von Brutwaben vor der Einführung dieser und wieder, wenn Kämme ersetzt werden oder wenn die Reversion Experiment abgeschlossen ist (Abbildung 2). Bereiche mit zuvor unverschlossen Brut und mit offenen, Live-Brut sind zuverlässige Marker der Pflegetätigkeit in Häcksler abgeleitete Kolonien.
4. Sampling: Physiologische Effekte, die soziale Umkehrung begleiten kann 3-8 Tage nach Häcksler und Pflegepersonal erkannt werden getrennt.
   1. Wir beraten Probenahme alle Testgruppen, dh rückgängig Arbeiter-und Weiterbildung Häcksler (Häcksler abgeleitete Bienenstock), sowie die anhaltenden Krankenschwestern und neu eingestellten Sammlerinnen (Krankenschwester-Bienenstock abgeleitet) von 8 Tagen nach Umkehr eingeleitet wird.
   2. Collect Proben wie in Schritt 1.5 beschrieben.

3. Analyse Worker-Typ-spezifische zelluläre Seneszenz-Muster durch Quantifizierung von Lipofuszin

Lipofuszin ist ein universeller Biomarker für zelluläre Seneszenz. Als intrinsische Akkumulations Produkt kann lipofuscin spezifischen Autofluoreszenz (Emissions _max = 530-650 nm) zur Detektion ¹⁸ verwendet werden.

1. Dissection und Fixierung: Schauer Bienen auf Eis, bis unbeweglich, zu entfernen und sezieren die gewünschte Gewebeprobe.
   1. Transfer in die Fixierlösung (4% Paraformaldehyd in Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung, PBS, pH 7,2) für eine Inkubation über Nacht bei 4 ° C.
   2. 3 mal in PBS waschen Proben.
2. Gewebeverarbeitung und Montage: Schneiden von Gewebeproben in Abschnitte mit nicht mehr als 40 &mgr; m Dicke, beispielsweise unter Verwendung eines Mikrotoms Schwingklinge, z. B. Leica VT 1000S (Leica Biosystems, Nussloch, Deutschland).
   1. Montieren Abschnitte auf Objektträger in 50% Glycerin (PBS). Für die langfristige Lagerung Dichtungsdeckel rutscht mit Nagellack.
3. Bildaufnahme: Um Lipofuszin erkennen, empfehlen wir die Verwendung eines konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop, das Laserlinien bietet mit λ = 514, 561nm oder ähnliche für die Anregung, mit der Detektor Bandbreite von 570 bis 650 nm eingestellt.
   1. Zur besseren Identifizierung von Lipofuszin, einen zweiten Kanal, und tun eine gleichzeitige Abtastung bei kürzeren Wellenlängenspektren (Anregung = 405 nm, Emission = 410 bis 450 nm). Die längere Wellenlängenkanal wird sowohl durch autofluoreszierenden Luftröhre und andere nicht-körnige Strukturen offenbaren, granulare Lipofuszin, aber auch unspezifische "Hintergrund". Der zweite, kürzere Wellenlängenkanal nur unspezifische Autofluoreszenz zeigen, aber nicht Lipofuszin. So kann Lipofuszin Identifizierung Facili sein durch Vergleich der Signale in den beiden Kanälen, wobei nur einer von ihnen offenbart die Granulate mit Lipofuscin spezifische Fluoreszenz tated.
   2. Zum Erwerb der Bilder mit hoher Auflösung verwenden ein Objektiv mit 40-facher Vergrößerung oder höher, und vorzugsweise einer numerischen Apertur von 1,25 oder höher. Scan-Bildstapeln mit den Abmessungen von ca. 100 x 100 x 10 um ^drei. Und jeder einzelne Gewebeprobe, die von mehreren Bildstapel dargestellt werden.
   3. Um intra-individuelle und inter-individuelle Unterschiede durch technische Veränderung zu reduzieren, der stets Laserleistung und Empfindlichkeit des Detektors konstant.
   4. Um Verzerrungen durch Tag zu Tag technische Varianten reduzieren scannen gleich Probennummern aller Testgruppen in jeder der verschiedenen Scan-Sitzungen.
4. Bildverarbeitung: Mit Software-Pakete mit Modulen, die für erweiterte Verarbeitung von mikroskopischen Bildstapeln zu ermöglichen, zum Beispiel ImageJ (US National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, USA,gej.nih.gov / ij / "target =" _blank "> http://imagej.nih.gov/ij/).
   1. Generieren Sie ein 2D-Projektions maximal für jeden der 3D-Bildstapeln.
   2. Tragen Sie eine Gauss-Filter mit einem bescheidenen Kerngröße, um Hochfrequenzrauschen zu dämpfen und um Strukturen mit Abmessungen von Lipofuszingranula bewahren.
   3. Zusammenführen beider Farbkanäle, um die Identifizierung von Lipofuszin (siehe Schritt 3.2) zu erleichtern.
5. Imageanalysen: Vergewissern Sie sich, dass das Thema der Durchführung der Quantifizierung Schritte werden blind für die Gruppenidentität zu testen.
   1. Für alle Bilder, zuerst eine Region von Interesse (ROI), die die entsprechenden Strukturen bedeckt, und hat ähnliche Abmessungen wie der ROIs von anderen Bildern zu wählen.
   2. Dann wählen Sie die gewünschte Anzahl von Lipofuszingranula, die jede ROI darzustellen. Bei der Auswahl Lipofuszingranula innerhalb einer ROI, wird die Anwendung der folgenden Regeln subjektive Bias zu reduzieren.
      1. Wählen Sie einen einheitlichen Ort für die Auswahl der ersten Granulatle. Dies kann, zum Beispiel, wird die am weitesten links Kante eines ROI, und das Granulat, das am nächsten zu der Kante ist immer die erste Wahl sein.
      2. Einer nach dem anderen werden die Granulat gewählt, die am nächsten zu der vorherigen Auswahl (nächste Nachbarn) sind.
      3. Bei der Wahl des nächsten Nachbarn, bewegen sich nur in eine Richtung, beispielsweise nur richtig suchen, von der vorherigen Auswahl. Diese Regel verhindert, dass die Auswahl durch gelegentliche Cluster von dicht gepackten Granulat dominiert.
      4. Bei Auswahl abgeschlossen ist, beurteilen die Größe der einzelnen Partikel durch Lipofuszin skizziert und die Messung der jeweiligen Granulatbereich. Verwenden Sie geeignete statistische Tests, um Personen der verschiedenen Testgruppen vergleichen.

Representative Results

Protokoll Abschnitt 1 und 2 ausführlich, wie Testgruppen erhalten, um die Attribute des beschleunigten studieren, verlangsamt und umgekehrt Alterung in Kolonien mit einer einzigen Alterskohorte. Um Arbeitnehmer-Typ-Differenzierung, die den normalen Ontogenese wir beurteilt Häcksler Zahlen ("Eingang zählt") für 6 Kolonien (Abbildung 1, vgl. Abschnitt 1) begleitet überwachen. Die Grafiken zeigen, dass erhebliche Veränderung von der Krankenschwester auf den Häcksler Zustand ist in der Regel nicht eingehalten, bevor Personen sind mehr als 10 Tage alt. Gekennzeichnet Variabilität Häcksler Zählungen wurde im Hinblick auf den Zeitpunkt der Futtersuche Einsetzen zwischen verschiedenen Kolonien beobachtet, und als markierten Tag-zu-Tag Variation innerhalb jeder Kolonie. Neben Kolonie bestimmte demographische Faktoren, wie unterschiedliche Brut Last wird viel Variabilität von wechselnden Wetterbedingungen (Zeitpunkte in rot in Abbildung 1 markiert) erläutert. Eine engmaschige Überwachung der Nahrungssuche Dynamik daher wird empfohlen, Kennzeichnung und Sammlung Bemühungen während optimierenten das Experiment.

Die umgekehrte Ontogenese (Abschnitt 2) von der Nahrungssuche zurück zu Pflegeaufgaben können durch die Inspektion Brutwaben, die in die Häcksler-abgeleiteten Kolonien eingeführt werden validiert werden (siehe Schritte 2.2 und 2.3). Für drei Wiederholungen 2A, C und E zeigen Brutwaben vor der Einführung in Häcksler abgeleitete Kolonien. 2b, D und F zeigen die jeweiligen Kämme nach Entfernung. Patches neu verdeckelten Brut, gesunde Larven und erhöhte Pollen Speicher um Brutzellen zeigen, dass ehemalige Sammler jetzt hatte erfolgreich typisches Nest durchgeführt, einschließlich Pflegeaufgaben.

Lipofuszin (Abschnitt 3) ist eine hoch konservierte Symptom der Zellalterung und kann leicht für Post-experimentelle Untersuchungen in den verschiedenen Bienen Gewebe beurteilt werden. Abbildung 3 kontras Lipofuszin Akkumulation, gemessen als Granulatgröße (3E), in den Futtersaftdrüsen der Alter abgestimmt Krankenschwester einnd Sammlerinnen. Der Unterschied in der chronologischen Alter zwischen zwei jungen und die beiden alten Gruppen war ≥ 17 Tage, mit nur einer Gruppe (Häcksler) verbringen diese ≥ 17 Tage mit Flug und Essen außerhalb Sammlung Aktivitäten. Repräsentative mikroskopische Bilder (Fig. 3A-D) zeigen eine erhöhte Lipofuszin Akkumulation nur für die Gruppe der älteren Sammlerinnen nach mehr als 17 Tagen nach der Futtersuche (3D), nicht für ältere Krankenschwester Bienen ähnliche chronologische Alter (37-43 Tage; 3B) . Ein Zwei-faktorielle ANOVA mit der festen Hauptfaktoren Arbeiter-Typ (Sammlerinnen, Krankenschwestern) und Altersunterschied (Δage ≥ 17 Tage) ergab signifikante Effekte für Arbeiter-Typ, Alter Differenz und der Interaktion zwischen den beiden Faktoren (F _type = 33.67, P <0,001, F = _Δage 21,93, P <0,001, _{F-Typ x Δage} = 22.07, P <0,001). Jedoch zeigten Post-hoc-Tests nur erhebliche Auswirkungenwenn kontras älteren Häcksler (≥ 17 Tage Nahrungssuche), jüngere Sammlerinnen, Krankenschwester oder beiden Gruppen (PF 17d vs _1d/N1d/N17d F <0,001, Fisher-LSD; 3E). Es wurde kein Unterschied zwischen den drei letztgenannten Gruppen, darunter chronologisch junge und alte Krankenschwester Gruppen (; 3E alle Tests mit P> 0,5, Fisher-LSD) nachgewiesen. Dies deutet darauf hin, dass Lipofuszin Akkumulation hängt Häcksler spezifischen Aktivitäten (Futtersuche Alter), anstatt Funktion der chronologischen Alter nur an sich.

Fig. 1 ist. Worker-Typ-Differenzierung während der normalen Ontogenese. Die Grafik zeigt Eingang zählt der Sammlerinnen der Rückkehr von der Nahrungssuche Flüge für 6 verschiedene Kolonien ab 5 Tage nach der sie gegründet wurden gezählt (Details vergleichen Protokoll Abschnitt 1.4). Erhebliche Übergang von nest auf Nahrungssuche Aktivitäten wurde beobachtet, wenn markierten Individuen der einzelnen Alterskohorte etwa 10 Tage alt waren. Unterschiedliche Steigungen für den kumulierten Eintrittszahlen zeigen, dass die Dynamik der Krankenschwester Biene zu unterscheiden Häcksler Übergang zwischen Kolonien und sind durch klimatische Faktoren beeinflusst. Beispielsweise an Tagen mit regen und weniger als zwei Stunden nach Futtersuche, die Zunahme der Eingangszählungen typischerweise abgeflacht (Datenpunkte in Rot).

2. Überprüfen Verhaltens Reversion. Um zu testen ob Sammler erfolgreich zu Pflegeaufgaben zurückgekehrt, verglichen wir Brutwaben, bevor sie in Häcksler abgeleitete Nesselsucht eingeführt wurden, und nachdem sie von diesen Bienenstöcke entfernt wurden. Repräsentative Bilder zeigen Brutwaben vor der Einführung (A, C, E) undnach der Entfernung (B, D, F) von drei verschiedenen Häcksler abgeleiteten Nesselsucht sind. Brutpflege von früheren Sammlerinnen wird von einer zunehmenden Anzahl von Zellen mit verdeckelten Brut (B, D, F; schwarzen Pfeil in D eingelassen) angegeben, nachhaltige Überleben der Larven im offenen Zellen (roter Pfeil) und erhöhte Lagerung von Pollen in der Nähe Brutzellen (weißer Pfeil). Beachten Sie, dass Häcksler abgeleitete Kolonien zunächst sind in der Regel weniger effizient bei der Pflege der Brut als Krankenschwester abgeleitete Kolonien. Dies kann zu höheren Larvensterblichkeit in den Häcksler-abgeleitete-Kolonien führen. Bilder in B, D, F genommen wurden 5, 4 und 7 Tage nach der Brutwaben wurden in Häcksler abgeleitete Kolonien eingeführt.

3. Die Akkumulation von Lipofuszin, ein Biomarker der Zelledere Seneszenz, kann darauf hinweisen, Arbeiter-Typ-spezifische Gewebe Verschlechterung. Repräsentative mikroskopische Bilder der Futtersaftdrüsen bei jungen (A) und alte Krankenschwester Bienen (B), ebenso wie bei gleichaltrigen Sammlerinnen mit ≥ 1 Tag (C) bzw. ≥ 17 Tage Futter Erfahrung (Maßstab in A = 20 um). Lipofuszin Akkumulation wurde als Korngröße gemessen und als Mediane und Quartile für N = 5 Personen für jede Alters-und Arbeiter-Typ (E) gegeben. Futtersuche für 17 Tage führte zu einer signifikanten Lipofuszin Akkumulation, während im gleichen Zeitraum nicht zu Lipofuszin Änderungen in Krankenschwester Bienen führen (für die Statistik siehe Ergebnisse).

Discussion

Wir übernehmen hier zuvor beschriebenen Ansätze ^{8,16,17,19,20,} und integrieren sie in einem einzigen Workflow, der das Studium flexibel Alterung in Honigbienen erleichtern wird. Unser Ziel ist es, die Anfänger sind Wissenschaftler auf diesem Gebiet mit einem standardisierten Werkzeugsatz, um relevante Probenmaterial zu erhalten, liefern und experimentelle Reproduzierbarkeit zwischen verschiedenen Forschungsteams zu verbessern. Während unsere Verfahren werden vereinfacht und nicht spezielle Ausrüstung wie in früheren Beschreibungen (vgl. z. B. ^8), sind einige Vorsichtsmassnahmen beraten und sind unten gesammelt.

Die Entkopplung von Seneszenz chronologischen Alter. Ein sehr wichtiger Aspekt ist die falsche Identifikation von Sammlerinnen bei der ersten Bestätigung der Nahrungssuche Verhaltensweisen ^(2. Markierung) zu vermeiden. Deshalb, wenn Sammler überwacht werden sollen ("Eingang zählt") oder kreuzt, so sind strikt zu vermeiden täglichen Perioden mit Orientierungsflügen. Während dieser Zeit viele Pre-ForenLadestufe wird von Bienen verlassen oder geben Sie den Bienenstock. Diese Bienen nicht typischen physiologischen Eigenschaften von reifen Sammlerinnen an, sondern bauen eine räumliche Karte der Umgebung mit dem Bienenstock leicht identifizierbar Kreisflugmuster ^21.

Während die meisten Bienen auf Futtersuche mit dem Alter von 2 Wochen und älter zu ändern, sporadische Nahrungssuche ist bereits in sehr jungen Jahren (Abbildung 1) beobachtet. Extrem frühreife Sammlerinnen aus callow Nest Bienen direkt Regel entwickeln, ohne durch die Krankenschwester Stufe geleitet. Um keine Personen mit einer solchen abweichenden Ontogenese (vgl. ²² und Referenzen darin), werden Personen, die Futtersuche mit dem Alter von 10 oder weniger Tagen beginnen nicht für weitere Analysen berücksichtigt.

Um Überrepräsentation von frühreife Sammler weiter zu vermeiden, haben wir keinen Gebrauch von klassischen "Einzel Kohorte Kolonien", die nur aus der einzigen Alterskohorte ^17,23 bestehen. Stattdessen wird, wenn die EinrichtungKolonien wir Zufalls Nest Bienen ("Nest Biene Kohorte") in den markierten einzigen Alterskohorte (siehe Schritte 1.1 und 1.3). Da Zufalls Nest Bienen sind in der Regel älter, können sie den Druck auf die sehr jungen Bienen in extrem frühreifen ¹⁷ Sammlerinnen entwickeln zu reduzieren. Derartige Doppel Kohorte Kolonien kann daher besser ähneln einem natürlichen Bienenstock Demographie mit Personen, die sich langsam aus der Pflege, um die Fortschritte der Nahrungssuche.

Bei langfristigen Arbeiter spezifische Anpassungen untersucht werden sollen, sammeln Sie alle Testgruppen außerhalb der Nahrungssuche Stunden. Dies wird empfohlen, Vorspannung, die durch mehr akute metabolische Anpassungen reduzieren aufgrund der jüngsten Bewegungsaktivitäten, beispielsweise anstrengend Flug.

Umkehr der Arbeitnehmer mit schnellen verlangsamt Alterung durch Änderung der Bienenstock Demographie. Nach Sammlerinnen waren wieder in die ursprüngliche Position ist es wichtig, bewegen sich die Krankenschwester abgeleitete Struktur (> 3 km entfernt) geflogen. Dies ist zu vermeiden, dass vor der Bühne Nahrungssuche Bienen rekrutiert und die geführtealten Standort von anderen Bienen, die jeweils durch Pheromon-Kommunikation ^24.

Um eine Krankenschwester oder andere Pre-Nahrungssuche weitere Personen daran hindern, in die Häcksler-abgeleiteten Bienenstock, empfehlen wir halten die folgenden Regeln: (I) Beenden Sie das Trennverfahren vor der täglichen Orientierungsflügen beginnen. (II) versuchen Nur Umkehr an den Tagen, wenn starke Sammelaktivität beobachtet. (III) Während und nach der ersten Translokation des ursprünglichen Bienenstock, unnötige Aufregung der Bienen, insbesondere nicht den Bienenstock zu öffnen.

Im Prinzip künstlicher Setups, die Sammlerinnen beschränken in einer Krankenschwester-armen Umgebung kann auch zum Rückschlag führen. Solche Setups haben nur informativen Wert begrenzt, wie die Sammlerin abgeleitete Bruch Erfahrungen anderen belastenden Umgebungen und somit auch keine direkten Vergleich mit Kontrollgruppen von der Krankenschwester-abgeleiteten Kolonien.

Bestätigen verschiedenen Seneszenz Musterdurch Quantifizierung von Lipofuszin, ein Biomarker für zelluläre Seneszenz. wir hier beispielhaft Lipofuszin Beurteilung mit Bildern und statistischen Daten der Futtersaftdrüsen, weil Lipofuszin ist am leichtesten in diesem Gewebe nachweisbar. Dies, so glauben wir, ist wichtig, um den unerfahrenen Beobachter Einrichtung die richtigen Protokolle für die mikroskopischen Nachweis helfen. Doch im Gegensatz zu anderen Geweben, Futtersaftdrüsen nicht angezeigt signifikante Apoptose und Nekrose bei der Krankenschwester, den Übergang ²⁵ Häcksler. Solche Verfahren können mit der Akkumulation des Seneszenz-Marker interagieren, auch wenn wir ein höheres Maß an Lipofuszin in jungen Sammlerinnen, die vor kurzem von Pflegeaufgaben (3C, E) verändert nicht erkennen. Um jedoch Seneszenz Maßnahmen in anderen Geweben Biene zu bewerten, die hier beschriebenen Mikroskopie-basierte Methoden können leicht angepasst werden.

Alternativ sind durchflusszytometrische Ansätze weniger zeitaufwendig ^26. Mikroskopie-basierte Analysenhaben den Vorteil, dass zelluläre Alterungserscheinungen können für verschiedene Regionen oder sogar für Zellen innerhalb eines einzelnen Organe ²⁷ beurteilt werden. Für Studien in Gehirn und andere Organe mit komplexen räumlichen Heterogenität der Zellalterung ^28, empfehlen wir daher die Mikroskopie-Ansatz.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Apifonda	Südzucker AG, Mannheim/Ochsenfurt, Germany
paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	158127
phosphate-buffered saline	Sigma-Aldrich	P4417
Glycerol	Merck	1.04094.1000