Skaffa Prover med avtagit Accelerated och Omvänd Aging i Honey Bee modell

Summary

I honungsbiet arbetare, åldrande beror på sociala beteenden snarare än kronologisk ålder. Här visar vi hur arbetartyper med mycket olika åldringsmönster kan erhållas och analyseras för cellernas åldrande.

Abstract

Samhällen med mycket sociala djur har stora livslängdsskillnader mellan närbesläktade individer. Bland sociala insekter, är honungsbiet bäst etablerad modell för att studera hur plasticitet i livslängd och åldrande förklaras av sociala faktorer.

Arbetaren kasten av honungsbin inkluderar sjuksköterska bin, som tenderar att grubbla och fälthackar bin som samlar nektar och pollen. Tidigare arbete har visat att hjärnans funktioner och flygprestanda senesce snabbare i fälthackar än sjuksköterskor. Däremot kan hjärnfunktioner återhämta sig, när fälthackar återgå till omvårdnadsuppgifter. Sådana mönster av accelererad och omvända funktionella åldrande är kopplade till förändrade metaboliska resursnivåer, till förändringar i protein överflöd och för immunförsvaret. Vitellogenin, en äggula protein med anpassade funktioner i hormonell kontroll och cellulära försvaret, kan fungera som en viktig reglerande faktor i ett nätverk som styr de olika åldrandedynamiken hos arbetare.

Här beskriver vi hur uppkomsten av sjuksköterskor och fälthackar kan övervakas och manipuleras, inklusive återföring från vanligtvis kortlivade fälthackar i längre livade sjuksköterskor. Vår representativa resultat visar hur personer med liknande kronologiska ålder differentierar till fälthackar och sjuksköterska bin under experimentella förhållanden. Vi exemplifierar hur beteende omsvängning från fälthackar tillbaka till sjuksköterskor kan valideras. Senaste, visar vi hur olika cellernas åldrande kan bedömas genom att mäta ackumulationen av lipofuscin, en universell biomarkör av åldrande.

För att studera mekanismer som kan länka sociala influenser och åldrande plasticitet, ger detta protokoll ett standardiserat verktyg inställd på att skaffa relevant provmaterial, samt att förbättra jämförbarheten mellan framtida studier.

Introduction

De komplexa koloni strukturer mycket sociala djur bibehålls genom samverkan mellan en reproduktiv kast, och en hjälpare kast av typiskt icke-återgivning arbetare med olika social uppgiftsbeteenden. I de olika arbetare, specifika fysiologiska anpassningar möjliggör tydliga sib vårdbeteenden, och är också kopplade till extrema livslängdsskillnader. Honungsbin och mole råttor representerar de mest utvecklade djurmodeller för att studera hur socialitet är kopplat till mönster av accelererad, försumbar eller vändas åldrande ^1-3.

I honung bisamhällen, är ett enda äggläggande drottning biträdd av tusentals arbetare som tenderar att ruva, foder för mat, och engagera sig inom bevakning, värmereglering eller hygieniska beteenden ^4. Bland dessa arbetare är de extremt kortlivade fälthackar, sjuksköterska bin med mellanliggande och vinter (diutinus) bin med längsta livslängd. Individer är dock inte permanent bundna till en viss worker-typ, men visar en flexibel beteende ontogeni: de ändrar från en social uppgift beteende till ett annat ("timliga kaster"). Callow bin kan ändra till avels tenderar sjuksköterska bin, som så småningom kan komma att ändras till utanför födosök. Däremot kan callow boet bin också förvandlas till längst livade vinter bin, och kortlivade hackar kan även återgå till normalt längre livade sjuksköterskor. Arbetstagare med extrema (vinter bin) och mellan (sjuksköterska bin) livslängd har väl utvecklade livsmedelsproduktion och lagringsorgan med stora resurser - till skillnad från kortlivade hackar (recenserade i ^1,5). Men att regleringen av enskilda livslängd går utöver enkla förändringar i en persons balans resurs föreslås av forskning på en äggula protein, som har olika anpassade funktioner i den icke-reproducerande arbetare kast, såsom gelé produktion ^6, hormonell kontroll ^7, immun ⁸ och antioxidant försvars ^9.

Mönster för funktionell nedgång (åldrande) spegel livslängdsskillnaderna bland arbetare, som fastställts för lukt, och även för andra hjärnan eller motorik ^10-13. Specifikt den betydande nedgång i inlärningsfunktion efter bara två veckors födosök matchar en liknande dödlighet progression i fälthackar ^14, i motsats till bristen på detekterbara nedgång (försumbar åldrande) i långlivade vinter bin ^15.

För att identifiera de molekylära fingeravtryck av flexibla åldrande vi anpassat etablerade experimentella paradigm som möjliggör övervakning och manipulera åldrande typ övergångar ^8,16,17. Experiment 1 Information Hämta prover i vilka effekterna av kronologisk ålder och arbetar typspecifika sociala beteenden på åldrande kan separeras. Försök 2 beskriver återföring av fälthackar med accelererade in i sjuksköterska bin med bromsat åldrandedynamiken. Försök 3 ger en metod för att sondera effekterna av cellulärt åldrande genom Anatomical kvantifiering av en etablerad biomarkör för cellulärt åldrande (lipofuscin) ^18.

Protocol

1. Att frikoppla Åldrande från Kronologisk ålder

Detta avsnitt beskriver inställningen av dubbel kohort kolonier, som består av en kohort av identifierade individer som delar samma kronologiska ålder ("enda årskull") och en kohort av boet bin. Samma åldrade individer av den enda årskull kommer så småningom att dela upp i olika arbetartyper med olika åldrings dynamik - dessa är sjuksköterska bin med bromsat och fälthackar bin med accelererad funktionell nedgång. Alla förfaranden beskrivs för en experimentell koloni. Vi rekommenderar dock att utföra experiment i minst två koloni replikat så att koloni effekter kan kontrolleras för (två replikat-design).

1. Förbereda bikupa rutorna för de dubbla kohort kolonierna: Förbered en vanlig bikupa box som tar emot två livsmedels kammar med honung, en annan mat kam med pollen, och två tomma kammar. Se till att hitta en parad drottning och en donator koloni med mer än 3000boet bin. Båda kommer att introduceras senare (1,3).
2. Att få och märkning individer med liknande kronologisk ålder: Samla kammar med förseglade yngel som är på väg att växa fram. För ett replikat räkna med att samla kammar med totalt 3,000-5,000 utjämnade avelsceller. För varje replikera använda en balanserad mängd yngel från minst tre olika bikupa källor för att undvika skeva fördelningar av maternal genotyper (bikupa ursprung).
   1. Placera yngel kammar i en inkubator inställd på 34 ° C med 60 till 70% relativ fuktighet. Se till att förvara kammar på ett sådant sätt att framväxande grubbla inte kan fly.
   2. Låt bin framträda för två dagar och märka dessa bin med en liten färgmärke på thorax (t.ex. Uni Posca, Mitsubishi Pencil Co Ltd.) Färgen märket gör det möjligt att identifiera bina i den enda årskull (dag för uppkomst), och för att skilja dem från andra replikera kolonier.
3. Att sätta upp en dubbel kohort koloni, vilket inkluderar den kohort jagdentified, ensamstående ålders bin: På dagen unga bin har markerats, samlar ca 2500-3000 boet bin från en donator koloni (jämför avsnitt 1 i diskussion.), och lägga till dessa omärkta bin till kupan rutan som utarbetades innan (se steg 1,1). Det senare individer kommer att utgöra den oidentifierade boet biet kohort.
   1. Lägg till drottningen, som kommer att till en början begränsad till en drottning bur (finns i handeln). Täta buren med ätbara godis (t.ex. Apifonda, Südzucker AG, Mannheim / Ochsenfurt, Tyskland) för att göra arbetstagare bin släpper långsamt drottningen.
   2. Lägg till den nyligen framkommit och markerade bin, som kommer att utgöra den enda åldersgruppen. Dessa bin är de enda märkta individer, och är fokusgruppen för alla följande steg.
4. Övervakning födosök debut och märkning fälthackar: Att bedöma debut och dynamiken i sjuksköterska-till-forager övergång i den enda åldersgruppen, övervaka den demografiska utvecklingen av födosök aktivitets emycket annan dag för varje koloni. Börja räkna fem dagar efter kolonier bildades (figur 1).
   1. Räkna det totala antalet bin som återvänder från födosök flygningar (entré räknas) inom 3 x 20 min observationsperioder på fasta tider. Se till att inte räkna bin under perioder av orienterings flygningar (se diskussion).
   2. När inträdes räkningar tyder på en betydande födosök aktivitet påbörjas (> 100 inträdes pulser / dag), börja märkning hackar. För att göra detta, fälthackar i den enda årskull (enstaka markerade personer) får en andra färg märke på återvänder från sina första födosök flygningar. Denna färgmarkering anger dagen för födosök debut, och gör det möjligt att senare identifiera födosök ålder för varje forager.
   3. Upprepa dagligen markeringar tills ett tillräckligt antal bin har markerats. För att uppskatta ett tillräckligt antal markerade fälthackar, räkna med en hämtningshastighet på högst 5-10% efter dessa bin hade åldrats, normalt efter 14 dagarfödosök.
5. Provtagning: Eftersom alla från början markerade bin har en liknande kronologisk ålder, kan åldersmatchade grupper av sjuksköterskor och gamla fälthackar samlas samtidigt, när fälthackar har foraged i ≥ 14 dagar.
   1. Enstaka markerade sjuksköterska bin samlas i kupan, och identifieras med omvårdnadsbeteende (utfodring och rengöring av larver med huvudena lägga ner i öppna yngelceller).
   2. Dubbla markerade fälthackar samlas också in i kupan innan dagliga födosök verksamheten påbörjas.
   3. Samla bin i burar (rör, lådor) som ger tillräcklig ventilation och hålla mörker tills vidare bearbetning. Alternativt, för transcriptomic, epigenetisk eller proteomik studier, direkt knäppa frysa bin i flytande kväve. Samla balanserade antal individer från alla testgrupper och replikera kolonier.

2. Återföring av arbetare med Rapid till arbetare med Långsammare åldrande genom att ändra Hive s demografi </ P>

Detta avsnitt beskriver hur återföringen från arbetstagare med accelererad åldring (fälthackar) till arbetstagare med långsammare åldrande (sjuksköterska bin) utförs. Sådant beteende återföring induceras, när fälthackar upplever en brist på sjuksköterska bin, som normalt bedriver yngelvård. Reversionen förfarande kommer att separera en enda koloni replikera i två nässelfeber: en kupan med sjuksköterskan bee fraktion ("sjuksköterska härledda"), och en annan en med forager fraktion ("forager härledda"). Efter kan studeras framgångsrik vändning, eventuella symtom på plast och omvända åldrandet i den enda åldersgruppen med återgick arbetarna, kvarvarande fälthackar, kvar sjuksköterska bin och nyrekryterade hackar. Liksom tidigare identifierade bin av den enda åldersgruppen, inte den kohort av oidentifierade boet bin, utgör den experimentella fokusgrupp.

1. Förberedelser: Upprepade kupor med sjuksköterskor (singel märkt) och fälthackar (dubbelt märkt) görs tillgängliga enligt beskrivningen i föregående avsnitt. Se till att inte börja reversion med mindre än 500 markerade hackar per replikat koloni för att säkerställa tillräcklig återvinning efter återgång har fullbordats.
   1. För säker identifiering av testgrupper efter återföring är det viktigt att hela forager befolkningen i den ursprungliga datafilen har markerats innan återgång. Följande procedur är beskriven för en replikera.
   2. Dagen före återgång, förbereda ytterligare en bikupa rutan för forager-härledda bikupa (se steg 1.1). Leta upp två damer och två avels kammar från givar bikupor. Före överföring till de experimentella kolonierna borsta bort alla vuxna bin från dessa kammar. En bur drottning (se steg 1.3) och en kull kam kommer att ersätta drottning och avels kammar i original bikupa rutan. Den andra uppsättningen av drottning och yngel kam kommer att användas nästa dag för den nya datafilen boxen. Liknande fördelning av nya avels kammar och främmande drottningar för både den ursprungliga och den nya datafilen rekommenderas att se till att separata fälthackar och sjuksköterskas kommer lika erfarenhet förändrats bikupa ledtrådar ("bikupa lukt").
2. Återgång: På morgonen, strax före återgång, tillsätt bur drottningen och grubbla kammen till den nya rutan som kommer att få den forager-härledd fraktion. Vänta tills toppen födosök tid börjar. Flytta sedan original kolonin med markerade fälthackar och sjuksköterska bin minst 100 m bort från den ursprungliga platsen.
   1. På den ursprungliga platsen, inrättat den nya boxen för forager-härledda bikupa med yngel och endast drottning.
   2. Hackar kommer att lämna den ur led original bikupa rutan, och gå tillbaka till den ursprungliga platsen. Tillåt hackar för att återgå till den ursprungliga platsen i 2 h för att nå nästa för att fullborda separationen av den forager befolkningen från boet bin.
   3. Sedan, för att avsluta separationen, stänga den ursprungliga, nu "sjuksköterska-derived" bikupa, och överföra den till en bigård på minst 3 km bort.
3. Hive underhåll och övervakning för ett framgångsrikt socialt arbeteomkastning: Kontrollera de experimentella bikupor regelbundet för friska, öppna grubbla.
   1. Under de första dagarna efter koloni manipulation ersätta obevakad och döda yngel för att minska potentiell patogen belastning.
   2. För att validera framgångsrik vändning inom forager-härledda bikupa, ta bilder av avels kammar innan man inför dessa, och igen när kammar byts ut eller när återgång experimentet är klar (Figur 2). Områden med tidigare icke-begränsade grubbla och med öppna, levande yngel är pålitliga markörer för vårdverksamhet inom fälthackar-härledda kolonier.
4. Provtagning: Fysiologiska effekter som följer med den sociala återföring kan upptäckas 3-8 dagar efter fälthackar och sjuksköterskor separerades.
   1. Vi rekommenderar provtagning alla testgrupper, det vill säga återgick arbetare och fortsatta fälthackar (forager-härledda bikupa) samt fortsatta sjuksköterskor och nyanställda fälthackar (sjuksköterska-härledda bikupa) 8 dagar efter återföring initieras.
   2. ColLect prover såsom beskrivs i steg 1,5.

3. Analysera Worker-typspecifika cellernas åldrande Mönster av Kvantifiering av Lipofuscin

Lipofuscin är en universell biomarker av cellulärt åldrande. Som en inneboende ackumulation produkt, kan lipofuscin specifika autofluorescens _(max utsläpp = 530-650 nm) används för detektion ^18.

1. Dissection och fixering: Chill bin på is tills orörlig, ta bort och dissekera ut önskad vävnadsprovet.
   1. Överför till fixativ (4% paraformaldehyd i fosfatbuffrad koksaltlösning, PBS, pH 7,2) för inkubering över natten vid 4 ° C.
   2. Tvätta prover tre gånger i PBS.
2. Tissue bearbetning och montering: Skär vävnadsprover i sektioner med högst 40 ìm tjocklek, till exempel genom att använda en vibrerande blad mikrotom, t.ex. Leica VT 1000S (Leica Biosystems, Nussloch, Tyskland).
   1. Montera avsnitten på mikroskopiska objektglasen i 50% glycerol (PBS). För långtidslagring tätning täckglas med nagellack.
3. Bild förvärv: För att upptäcka lipofuscin, föreslår vi att du använder en laserskanning konfokalmikroskop som ger laserlinjer med λ = 514, 561nm eller liknande för excitation, och med detektorn bandbredd inställd på 570-650 nm.
   1. För bättre identifiering av lipofuscin, innefattar en andra kanal, och gör en samtidig genomsökning med kortare våglängd spektra (excitation = 405 nm, emission = 410-450 nm). Ju längre våglängd kanal kommer att avslöja både, granulat lipofuscin, men även ospecifika "bakgrund" på grund av autofluorescent luftstrupen och andra icke-granulära strukturer. Den andra, kortare våglängd kanal kommer bara avslöja ospecifik autofluorescens, men inte lipofuscin. Sålunda kan lipofuscin identifiering vara under tated genom att jämföra signalerna i båda kanalerna, med endast en av dem avslöjar granulerna med lipofuscin specifik fluorescens.
   2. För förvärv av högupplösta bilder använder ett objektiv med 40x förstoring eller högre, och helst en numerisk bländare på 1,25 eller högre. Skanna bild travar med måtten ca 100 x 100 x 10 mikrometer ^3. Varje individ-och vävnadsprov måste representeras av flera bildstaplar.
   3. För att minska intraindividuella och interindividuella variationer som orsakas av tekniska variationer, alltid hålla lasereffekt och detektorkänslighet konstant.
   4. För att minska fördomar från dag till dag tekniska variationer skanna lika provnummer i alla testgrupper i var och en av de olika skanningssessioner.
4. Bildbehandling: Använd programvarupaket med moduler som möjliggör avancerad behandling av mikroskopiska bildstaplar, till exempel ImageJ (US National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, USA,gej.nih.gov / ij / "target =" _blank "> http://imagej.nih.gov/ij/).
   1. Generera en 2D maximal projektion för var och en av de 3D-bildstaplar.
   2. Applicera en Gauss-filter med en blygsam kärna storlek för att dämpa högfrekvent brus, och för att bevara strukturer med dimensioner lipofuscin granulat.
   3. Slå ihop de båda färgkanaler för att underlätta identifieringen av lipofuscin (se steg 3.2).
5. Bildanalyser: Se till att motivet utför kvantifiering stegen kommer att vara blinda för att testa gruppidentitet.
   1. För alla bilder, först välja en region av intresse (ROI) som täcker de relevanta strukturerna, och har samma dimensioner som ROI från andra bilder.
   2. Välj sedan önskat antal lipofuscin granulat som representerar varje ROI. Vid val lipofuscin granulat i en ROI, kommer tillämpningen av följande regler minskar subjektiv partiskhet.
      1. Välj en enhetlig plats för att välja den första granulatle. Detta kan vara, till exempel, kommer den vänstra kanten av en ROI och granul som är närmast kanten alltid vara det första valet.
      2. En efter en har granulat väljs som är närmast föregående val (nästa granne).
      3. När du väljer nästa granne, flyttar bara in i en riktning, bara till exempel söka rätt från föregående val. Denna regel förhindrar att urvalet domineras av enstaka kluster av tätt packade korn.
      4. När valet är klar, bedöma storleken på varje lipofuscin partikel med att redogöra och mäta respektive granulat området. Använd lämpliga statistiska test för att jämföra individer av olika testgrupper.

Representative Results

Protokoll avsnitt 1 och 2 detalj hur testgrupper kan erhållas för att studera attribut accelererat, bromsade och vände åldrande i kolonier med en enda årskull. För att följa arbetar typ differentiering som följer med normala ontogenin vi bedömde fälthackar räknas ("entré räknas") för 6 kolonier (Figur 1, jämför avsnitt 1). Diagrammen visar att en betydande förändring från sjuksköterska till forager staten normalt inte observeras innan individer är mer än 10 dagar gammal. Märkt variabilitet i fälthackar räknar observerades med avseende på tidpunkten för födosök debut mellan olika kolonier, och som en markerad dag till dag variation inom varje koloni. Förutom koloni specifika demografiska faktorer, såsom olika grubbla belastningen är stor variation förklaras av förändrade väderförhållanden (tidpunkter rödmarkerade i figur 1). Noggrann övervakning av födosök dynamik därför rekommenderas att optimera märkning och insamling insatser undering experimentet.

Den omvända ontogeni (avsnitt 2) från födosök tillbaka till omvårdnadsuppgifter kan valideras genom att inspektera avels kammar som förs in i fälthackar-härledda kolonier (se steg 2.2 och 2.3). För tre replikat Figurerna 2A, C och E visar yngel kammar före införandet i fälthackar-härledda kolonier. Figurerna 2B, D och F visar de respektive kammar efter borttagning. Fläckar av nyligen utjämnade yngel, friska larver, och ökad pollen lagring runt yngelceller visar att före detta fälthackar nu hade godkänt resultat typisk boet, inklusive omvårdnadsinsatser.

Lipofuscin (avsnitt 3) är ett starkt konservativa symptom på cellulärt åldrande, och kan lätt bedömas för post experimentella analyser i de olika bee vävnaderna. Figur 3 kontraster lipofuscin ackumulation, mätt som kornstorlek (figur 3E), i hypopharyngeal körtlar åldersmatchade sjuksköterska ennd fälthackar bin. Skillnaden i kronologisk ålder mellan de två unga och de två gamla grupperna var ≥ 17 dagar, med endast en grupp (fälthackar) spenderar dessa ≥ 17 dagar med utanför flyg-och insamlingslivsmedelsverksamhet. Representativa mikroskopiska bilder (fig. 3A-D) visar ökad lipofuscin ackumulation endast för den grupp av äldre fälthackar efter mer än 17 dagar för födosök (Figur 3D), inte för äldre sjuksköterska bin av liknande kronologiska ålder (37-43 dagar, figur 3B) . En två-faktoriell ANOVA med den fasta huvudfaktorer arbetare-typ (fälthackar, sjuksköterskor) och åldersskillnad (Δage ≥ 17 dagar) visade signifikanta effekter för arbetare-typ, åldersskillnad och samspelet mellan de båda faktorerna (F _typ = 33.67, P <0,001; F _Δage = 21.93, P <0,001, _{F-typ x Δage} = 22.07, P <0,001). Men post-hoc-tester visade signifikanta effekter endastnär kontrasterande äldre hackar (≥ 17 dagar med födosök) till yngre fälthackar, eller till båda sjuksköterska grupper (PF 17d vs F _1d/N1d/N17d <0,001, Fishers LSD, Figur 3E). Ingen skillnad påvisades mellan de tre sistnämnda grupperna, inklusive kronologiskt unga och gamla sjuksköterska grupper (alla tester med P> 0,5, Fishers LSD, Figur 3E). Detta tyder på att lipofuscin ackumulation beror på fälthackar särskilda aktiviteter (födosök ålder), snarare än att vara funktion av kronologisk ålder endast i sig.

Figur 1. Arbetar typ differentiering under normal ontogeni. Diagrammet visar entré räkningar av fälthackar som återvänder från födosök flygningar räknat för 6 olika kolonier som börjar fem dagar efter att de var etablerade (för detaljer jämföra protokoll avsnitt 1.4). Betydande övergång från NEst till födosök aktiviteter observerades först när märkta individer av den enda åldersgruppen var ca 10 dagar gammal. Varierande backar för de kumulativa entré räknas indikerar att dynamiken i sjuksköterskans bee till forager övergång skiljer sig åt mellan kolonierna, och påverkas av klimatfaktorer. Till exempel, på dagar med regn och mindre än två timmar av födosök, ökningen av entré räknar tillplattad normalt ut (datapunkter i rött).

Figur 2. Validera beteende återgång. För att testa om hackar har framgångsrikt återgått till omvårdnadsuppgifter, vi jämfört avels kammar innan de infördes i fälthackar-härledda bikupor, och efter att de avlägsnats från dessa bikupor. Bilderna visar avels kammar före introduktion (A, C, E) ochefter avlägsnande (B, D, F) från tre olika fälthackar härledda nässelfeber, respektive. Brood vård av tidigare fälthackar bin anges med ett ökande antal celler med utjämnade yngel (B, D, F, svart pil, infällda i D), ihållande överlevnad av larver i öppna celler (röd pil) och ökad lagring av pollen nära avels celler (vit pil). Observera att fälthackar-derived-kolonierna initialt är oftast mindre effektiva i tenderar att grubbla än sjuksköterska-härledda kolonier. Detta kan leda till högre larvdödlighet i fälthackar-härledda kolonier. Bilder i B, D, F tas 5, 4 och 7 dagar efter yngel kammar infördes i fälthackar-härledda kolonier.

Figur 3. Ansamling av lipofuscin, en biomarkör för cellular åldrande, kan tyda på arbetare-typ specifik vävnad försämring. Representativa mikroskopiska bilder av hypopharyngeal körtlar i unga (A) och gamla sjuksköterska bin (B), samt i åldersmatchade fälthackar bin med ≥ 1 dag (C) respektive ≥ 17 dagar födosök erfarenhet (skala bar i A = 20 mikrometer). Lipofuscin ackumulering mättes som kornstorlek, och ges som medianer och kvartiler för N = 5 personer för varje ålder och arbetar-typ (E). Födosök för 17 dagar resulterade i betydande lipofuscin ackumulation, medan samma period inte ledde till lipofuscin förändringar sjuksköterska bin (för statistik se resultat).

Discussion

Vi här anta tidigare beskrivna metoder ^{8,16,17,19,20,} och integrera dem i ett enda arbetsflöde som kommer att underlätta att studera flexibelt åldrande i honungsbin. Vårt mål är att ge forskare som är nybörjare på det här området med ett standardiserat verktyg inställd på att få relevant provmaterial, samt för att förbättra experimentella reproducerbarhet mellan olika forskargrupper. Medan våra rutiner är förenklade och inte kräver särskild utrustning som i tidigare beskrivningar (jämför till exempel ^8), är några försiktighetsåtgärder för råd och samlas nedanför.

Att frikoppla åldrande från kronologisk ålder. En mycket viktig aspekt är att undvika falsk identifiering av fälthackar bin under första bekräftelse på födosök beteenden ^{(2: a} märkning). Därför, när fälthackar finns för övervakning ("inträdes räknas") eller märkta, vet strikt undvika dagliga perioder med orienterings flygningar. Under dessa perioder många pre-forumging scen bin avgår från eller in i kupan. Dessa bin visar inte typiska fysiologiska egenskaper mogna fälthackar, men att bygga upp en rumslig karta över svärm omgivning med lätt identifierbara cirkulära flygmönster ^21.

Medan de flesta bin ändra till födosökande med 2 veckors ålder och äldre, är sporadiska födosök redan observerats vid mycket unga åldrar (Figur 1). Extremt brådmogna hackar utveckla typiskt direkt från Callow kapsla bin utan att ha passerat genom sjuksköterska skede. För att inte inkludera personer med sådan avvikande ontogeni (jämför ²² och referenser däri), är individer som börjar föda med en ålder av 10 dagar eller mindre inte vara för vidare analyser.

För att ytterligare undvika överrepresentation av brådmogen fälthackar, vi behöver inte använda sig av klassiska "single kohort kolonier" som består endast av den enda åldersgruppen ^17,23. Istället, när du ställer inkolonier som vi lägger till slump boet bin ("nest bee kohort") till den markerade enda åldersgruppen (se steg 1.1 och 1.3). Eftersom slump boet bin är oftast äldre, kan de minska trycket på mycket unga bina att utvecklas till extremt brådmogna foragers ^17. Sådana dubbla kohort kolonier kan därför bättre likna en naturlig bikupa demografi med individer som sakta framsteg från omvårdnad till födosök.

När långtidsarbetare specifika anpassningar studeras, samla alla testgrupper utanför födosök timmar. Detta rekommenderas för att minska fördomar med mer akuta metaboliska anpassningar på grund av de senaste motionsaktiviteter, till exempel ansträngande flygning.

Återföring av arbetstagare med snabb till saktade åldrande genom att ändra kupan demografi. Efter fälthackar hade flugit tillbaka till den ursprungliga platsen är det viktigt att komma bort sjuksköterskan-härledda bikupa (> 3 km). Detta för att undvika att för-söker föda scen bin rekryteras och styrs tillgamla platsen av andra bin, respektive genom feromonkommunikation ^24.

För att ytterligare förhindra sjuksköterska eller annan för-söker föda individer kommer in i forager-härledda bikupa, rekommenderar vi att hålla med följande regler: (I) Avsluta proceduren separationen innan dagliga orienterings flygningar börjar. (II) endast försöka återföring på dagar då kraftig födosök aktivitet observeras. (III) Under och efter den första translokation av den ursprungliga datafilen, undvika onödig oro för bin, särskilt inte öppna kupan.

I princip mer artificiella inställningar som begränsar fälthackar i sjuksköterska-berövade miljön också kan leda till återgång. Men bara sådana uppställningar har begränsat informativt värde som fälthackar-härledda fraktions upplevelser andra stressiga miljöer, vilket utgör hinder för en direkt jämförelse med kontrollgrupper från sjuksköterska-härledda kolonier.

Bekräftande olika hudåldrande mönstergenom kvantifiering av lipofuscin, en biomarkör för cellernas åldrande. Här exemplifieras lipofuscin bedömning med bilder och statistiska uppgifter för hypopharyngeal körtlar eftersom lipofuscin är mest enkelt kan upptäckas i denna vävnad. Detta, tror vi, är viktigt för att hjälpa de oerfarna observatören inrätta rätt protokoll för mikroskopisk upptäckt. Men till skillnad från andra vävnader, behöver hypopharyngeal körtlar visa signifikant apoptos och nekros under sjuksköterska att forager övergång ^25. Sådana processer kan interagera med ansamling av åldrande markör, även om vi inte upptäcker ökade nivåer av lipofuscin i unga fälthackar som nyligen hade ändrats från omvårdnadsuppgifter (figur 3C, E). Men för att bedöma hudåldrande åtgärder inom andra bee vävnader, de mikroskopi baserade metoder som beskrivs här kan lätt anpassas.

Alternativt, flödes cytometrisk metoder är mindre tidskrävande ^26. Mikroskopi baserade analyserhar fördelen att cellulära åldrande symptom kan bedömas för olika regioner eller även för celler i en enda organ ^27. För studier i hjärnan och andra komplexa organ med rumslig heterogenitet i cellulärt åldrande ^28, rekommenderar vi därför mikroskopi synsätt.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Apifonda	Südzucker AG, Mannheim/Ochsenfurt, Germany
paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	158127
phosphate-buffered saline	Sigma-Aldrich	P4417
Glycerol	Merck	1.04094.1000