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Immunology and Infection

मात्रात्मक Published: August 23, 2013 doi: 10.3791/50677
Automatic Translation
1, 1,2, 1
1Department of Anesthesia and Perioperative Care, University of California, San Francisco, 2Graduate Program in Biomedical Sciences, University of California, San Francisco

Summary

संक्रमण की साइटों पर सक्रिय अन्तःचूचुक को न्युट्रोफिल पालन मेजबान भड़काऊ प्रतिक्रिया का एक अभिन्न अंग है. के लिए अनुमति देता है कि एक न्युट्रोफिल बाध्यकारी परख है कि इस रिपोर्ट में वर्णित

Abstract

संवहनी endothelium भड़काऊ प्रतिक्रिया में एक अभिन्न भूमिका निभाता है. सूजन की तीव्र चरण के दौरान, endothelial कोशिकाओं (ईसीएस) मेजबान मध्यस्थों द्वारा या सीधे संरक्षित माइक्रोबियल घटकों या मेजबान व्युत्पन्न खतरा अणुओं द्वारा सक्रिय कर रहे हैं. सक्रिय ईसीएस व्यक्त साइटोकिन्स, लामबंद कि chemokines और आसंजन अणुओं, संक्रमण या चोट के स्थल पर ल्यूकोसाइट्स सक्रिय करने और बनाए रखने के लिए. न्यूट्रोफिल आने से पहले ल्यूकोसाइट्स हैं, और दोनों कोशिकाओं की सतह पर मौजूद आसंजन अणुओं की एक किस्म के माध्यम से अन्तःचूचुक का पालन करें. neutrophils के मुख्य कार्य सीधे, माइक्रोबियल खतरों को खत्म अतिरिक्त कारकों की रिहाई के माध्यम से अन्य leukocytes की भर्ती को बढ़ावा देने, और घाव की मरम्मत शुरू करने के लिए कर रहे हैं. इसलिए, अन्तःचूचुक को उनकी भर्ती और लगाव भड़काऊ प्रतिक्रिया की दीक्षा में एक महत्वपूर्ण कदम है. इस रिपोर्ट में, हम का उपयोग करते हुए एक इन विट्रो न्युट्रोफिल आसंजन परख में वर्णनcalcein स्थिर परिस्थितियों में microvascular endothelial सेल सक्रियण की हद quantitate को प्राथमिक मानव जीवाणुओं AM लेबल. इस विधि प्रतिदीप्ति स्पेक्ट्रोफोटोमेट्री द्वारा quantitated ही नमूने भी सीधे न्युट्रोफिल बंधन का एक और अधिक गुणात्मक मूल्यांकन के लिए प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी का उपयोग कल्पना की जा सकती है कि अतिरिक्त लाभ है.

Introduction

संवहनी endothelium घूम रक्त के साथ सीधे संपर्क में है, यह विशिष्ट संक्रमण या चोट के दौरान तेजी से भड़काऊ प्रतिक्रिया आरंभ करने के लिए स्थित है. Endothelial कोशिकाओं (ईसीएस) संरक्षित बैक्टीरियल घटकों और खतरे अणुओं की एक किस्म की पहचान है कि एक्सप्रेस पैटर्न मान्यता रिसेप्टर्स, और इस तरह के TNFα के रूप में मेजबान भड़काऊ मध्यस्थों के लिए रिसेप्टर्स. इन रिसेप्टर्स की सक्रियण ईसीएस साइटोकिन्स (जैसे आईएल -6, आईएल -8, CXCL1 और CCL2) स्रावित करने के लिए, और उनके कोशिका की सतह 1 पर आसंजन अणु (जैसे ई / पी selectin, Vcam-1 और 1-ICAM) upregulate करने के लिए प्रेरित करता है , 2. इन अणुओं सभी संक्रामक एजेंटों के मेजबान स्पष्ट और ऊतकों की मरम्मत 3,4 आरंभ करने के क्रम में संक्रमण और चोट की साइटों के लिए leukocytes के स्थानीयकरण की सुविधा. संक्रमण को न्युट्रोफिल प्रतिक्रिया संवहनी endothelium और जवाब के बीच एक अच्छी तरह से समन्वित परस्पर क्रिया शामिल है जीवाणुओं. चुनाव आयोग सक्रियण पर, आईएल8 स्रावित और संक्रमण या चोट 5,6 की साइट के लिए घर के लिए जीवाणुओं की अनुमति देता है कि अन्तःचूचुक पर एक intravascular ढाल रूपों है. ई / पी selectins मध्यस्थता न्युट्रोफिल पकड़ने और न्युट्रोफिल कोशिका की सतह पर glycomolecules साथ अपेक्षाकृत कमजोर संघों के माध्यम से रोलिंग. इन मुलाकातों, अपने आत्मीय रिसेप्टर्स करने के लिए आईएल -8 बंधन के साथ, मजबूत, इंटीग्रिन की मध्यस्थता लगाव और endothelial सेल सतह 7-10 पर neutrophils की संभावित गिरफ्तारी की सुविधा. गिरफ्तारी के बाद neutrophils, सीधे, रोगजनकों को खत्म रोगजनकों के प्रसार को रोकने के लिए न्युट्रोफिल कोशिकी जाल उत्पन्न, घाव भरने को बढ़ावा देने और इस तरह monocytes, मैक्रोफेज और वृक्ष के समान ही अन्य ल्यूकोसाइट्स भर्ती कि अतिरिक्त कारकों को रिहा करने के लिए संक्रमण के विशिष्ट साइटों के लिए वाहिका संरचना से बाहर पलायन कर सकते हैं कोशिकाओं 11-17.

Microv को न्युट्रोफिल पालन quantitate को एक में इन विट्रो विधि है इस रिपोर्ट में वर्णितascular TNFα मेजबान भड़काऊ मध्यस्थ द्वारा सक्रियण के बाद ईसीएस. यह परख ईसीएस के सक्रियण, और नहीं जीवाणुओं का आकलन करने के लिए बनाया गया है. प्राथमिक मानव जीवाणुओं पहले घनत्व ढाल जुदाई का उपयोग कर अलग कर रहे हैं, और फिर calcein acetoxymethyl (एएम) के साथ लेबल रहे हैं. जीवित कोशिकाओं Hydrolyze calcein भीतर Esterases 492-495 एनएम और 513-516 एनएम 18 के उत्सर्जन के एक उत्तेजना के साथ अत्यधिक फ्लोरोसेंट calcein अणु AM. fluorescently लेबल neutrophils, तो चुनाव आयोग monolayers के साथ incubated हैं, और गैर पक्षपाती neutrophils के बाद हटा रहे हैं. शेष, बाध्य neutrophils की रोशनी तो एक प्रतिदीप्ति स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग करके मापा, और अच्छी तरह से प्रति कुल न्युट्रोफिल प्रतिदीप्ति निवेश का एक प्रतिशत के रूप में गणना की है. इस विधि स्पेक्ट्रोफोटोमेट्री में इस्तेमाल बाध्य calcein लेबल neutrophils के सीधे चुनाव आयोग एसी से बाहर पढ़ने के लिए एक और अधिक गुणात्मक देने के लिए प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी का उपयोग कल्पना की जा सकती है कि अतिरिक्त लाभ हैtivation. इस परख स्थिर शर्तों के तहत किया जाता है, न्युट्रोफिल आसंजन झरना में होते हैं कि केवल बहुत प्रारंभिक घटनाओं का मूल्यांकन किया जाएगा. इस TNFα का इलाज मानव फेफड़े microvascular चुनाव आयोग (HMVEC-फेफड़े) को उस न्युट्रोफिल पालन ई selectin के साथ बातचीत बाधित है जब monolayers काफी कम है दिखाने के लिए ई selectin अवरुद्ध एंटीबॉडी का उपयोग इस रिपोर्ट में पुष्टि की है.

TNFα के अलावा, हम सफलतापूर्वक टोल की तरह रिसेप्टर 1/2 एगोनिस्ट पेप्टीडोग्लायकन जुड़े लिपोप्रोटीन (पाल), murein लिपोप्रोटीन (MLP) और Pam3Cys और द्वारा मानव नाल की शिरा चुनाव आयोग (HUVEC) सक्रियण की सीमा निर्धारित करने के लिए इस परख का इस्तेमाल किया है Pam3Cys 19,20 से HMVEC-फेफड़े सक्रियण. इसके अलावा, हम सफलतापूर्वक इस पद्धति की एक किस्म के साथ संगत है, सुझाव है कि kinase inhibitors के साथ और HMVEC-फेफड़े में सतह और cytoplasmic प्रोटीन की आरएनएआई की मध्यस्थता पछाड़ना के बाद इस परख इस्तेमाल जैव रासायनिक और screeninजी assays के 20. सारांश में, इस परख इन विट्रो में सूजन मध्यस्थों द्वारा चुनाव आयोग के सक्रियण की हद तक पहुंचने के लिए, प्रतिलिपि प्रस्तुत करने, अधिक कार्यात्मक रास्ते का उपयोग करने के लिए आसान प्रदान करता है.

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Protocol

1. चढ़ाना और microvascular endothelial कोशिकाओं के रखरखाव

  1. पिघलना और निर्माताओं के अनुसार अपने microvascular endothelial कोशिकाओं के बढ़ने निर्देश की आपूर्ति की. इस प्रोटोकॉल में, कोशिकाओं ईजीएम -2 एमवी मीडिया (Lonza) में बड़े हो रहे थे, और यह सभी प्रयोगों बीतने संख्या की वजह से किसी भी बदलाव के लिए कम से कम विगलन के दो सप्ताह के भीतर प्रदर्शन कर रहे हैं की सिफारिश की है. HMVEC-फेफड़े के साथ हमारे प्रयोगों 9-4 मार्ग के बीच प्रदर्शन कर रहे हैं.
  2. दिन 1: कोशिकाओं 80-90% confluency तक पहुँचते हैं, trypsinize और मिलीलीटर प्रति 120,000 कोशिकाओं में resuspend. 48 अच्छी तरह से, polystyrene, टिशू कल्चर प्लेट (ओं) में प्लेट अच्छी तरह से प्रति 36,000 कोशिकाओं (0.3 मिलीलीटर). एक पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति पढ़ने प्राप्त करने के क्रम में जीवाणुओं के साथ incubated नहीं होगा कि HMVEC के कुओं में शामिल हैं. विशेष रूप से प्रतिदीप्ति assays के, बारी पंक्तियों या स्तंभों के लिए बनाया गया 48 अच्छी तरह से प्लेटों का उपयोग कर जब तक पड़ोसी कुओं से किसी भी प्रकाश प्रदूषण को कम कर देंगे. नोट: वेल्स पाली lysi साथ पूर्व लेपित किया जा सकता हैपूर्वोत्तर, कोलेजन या fibronectin.
  3. दिन 2: ताजा मीडिया जोड़ें.
  4. दिन 3: चरण विपरीत माइक्रोस्कोपी करके, कोशिकाओं (यानी "पत्थर" उपस्थिति और छोटे सेल मलबे) स्वस्थ हैं पुष्टि, और वे 100% मिला हुआ (चित्रा 1) हैं. कोशिकाओं 100% मिला हुआ नहीं हैं, तो वे तैयार हैं जब तक, हर दिन मीडिया बदल जाते हैं.
  5. HMVEC monolayers के इलाज के लिए तैयार हैं एक बार, हांक संतुलित नमक समाधान (HBSS) के साथ एक बार कोशिकाओं को धोने और उचित कुओं को भड़काऊ एगोनिस्ट युक्त ताजा ईजीएम -2 एमवी मीडिया या मीडिया के 0.3 मिलीलीटर जोड़ें. इस प्रोटोकॉल में HMVEC-फेफड़े TNFα के साथ इलाज किया गया, 3 घंटे के लिए [100 एनजी / एमएल] (PeproTech, न्यू जर्सी) इस ईसीएस 21 की एक अच्छी तरह से वर्णित उत्प्रेरक है के बाद से. नोट: यह आपके सक्रिय HMVEC कोशिकाओं (चरण 4.1) और calcein लेबल जीवाणुओं (चरण 3.5) AM इतना है कि आप समय अपने प्रयोग है कि एक ही समय में उपयोग करने के लिए तैयार कर रहे हैं की सिफारिश की है. यह neutroph अलग और लेबल करने के लिए हमें लगभग 2.5 घंटे लगते हैंआइएलएस.

2. Polymorphprep उपयोग कर न्युट्रोफिल अलगाव

  1. पहले 22 के रूप में वर्णित जीवाणुओं को अलग, या पूरे रक्त से polymorphonuclear granulocytes को अलग करने के लिए तैयार कर दिया घनत्व ढाल समाधान के साथ. Nuzzi, एट अल द्वारा प्रोटोकॉल के बाद Polymorphprep रोजगार. पूरे रक्त की 23 मिलीलीटर प्रति लगभग 2-3 एक्स 10 6 neutrophils की पैदावार में 2007 का परिणाम है. नोट: लाल रक्त कोशिकाओं को दूर करने के लिए अत्यधिक एरिथ्रोसाइट सेल, एक dextran अवसादन से बचने के लिए घनत्व ढाल centrifugation 24 से पहले किया जा सकता है.
  2. आरटी Polymorphprep घनत्व ढाल समाधान लाओ.
  3. की उपस्थिति में एक स्वस्थ मानव स्वयंसेवक से पूरे रक्त की 30 मिलीलीटर लीजिए एक ऐसी हेपरिन, साइट्रेट या EDTA के रूप में विरोधी कौयगुलांट. रक्त 2 घंटे के भीतर इस्तेमाल किया, और 18-22 डिग्री सेल्सियस के बीच रखा जाना चाहिए
  4. एक 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में घनत्व ढाल समाधान (के 5 मिलीलीटर से अधिक पूरे खून की परत 5 मिलीलीटर
  5. 18-22 पर 30 मिनट के लिए 450 XG पर अपकेंद्रित्र डिग्री सेल्सियस धीरे से ऊपर की गति और नीचे अपकेंद्रित्र (यानी अपकेंद्रित्र ब्रेक बंद कर देते हैं), और neutrophils की सक्रियता को कम करने और परतों के मिश्रण को रोकने में मदद करने के लिए कंपन को रोकने के लिए अच्छी तरह से ट्यूब संतुलन के लिए सुनिश्चित करें. लंबा centrifugation के समय या उच्च केन्द्रापसारक बल pelleted लाल रक्त कोशिकाओं को ओर आगे नीचे की ओर पलायन करने के लिए, जीवाणुओं होता है जो कम ल्युकोसैट परत में परिणाम होगा.
  6. जीवाणुओं (चित्रा 2B) युक्त परत के प्रदूषण को रोकने के लिए PBMCs युक्त प्लाज्मा और ऊपरी ल्युकोसैट बैंड महाप्राण.
  7. जीवाणुओं से युक्त कम ल्युकोसैट परत को हटाने के लिए एक 1-2 मिलीलीटर सीरम वैज्ञानिक pipet का प्रयोग करें. पीबीएस के 30 मिलीलीटर में न्युट्रोफिल परतों का मिश्रण एक 50 मिलीलीटर में (2 सीए बिना + और ​​2 मिलीग्राम +)शंक्वाकार ट्यूब.
  8. पीबीएस के साथ 50 मिलीलीटर (2 सीए बिना + और ​​2 मिलीग्राम +) 18-22 से कम 10 मिनट के लिए 450 XG पर और अपकेंद्रित्र डिग्री सेल्सियस तक की मात्रा को लाओ

नोट: कदम 2.9 और 2.10 वैकल्पिक हैं लेकिन अत्यधिक की सिफारिश की.

  1. तैरनेवाला Aspirate. लाल रक्त कोशिकाओं lyse करने के लिए 30 सेकंड के लिए बाँझ पानी के 8 मिलीलीटर में जीवाणुओं Resuspend, तुरंत 5x पीबीएस के 2 मिलीलीटर (2 सीए बिना + और ​​2 मिलीग्राम +) और धीरे हाथ से मिश्रण. में कोशिकाओं को सेते ऐसा नहीं करने के लिए सेल निलंबन जोड़ना अब से 30 सेकंड के लिए पानी महत्वपूर्ण न्युट्रोफिल मौत भी हो सकती है.
  2. 18-22 में 5 मिनट के लिए 250 XG पर अपकेंद्रित्र डिग्री सेल्सियस
  3. पीबीएस के 10 मिलीलीटर (2 सीए बिना + और ​​2 मिलीग्राम +) और 18-22 से कम 5 मिनट के लिए 250 XG पर फिर से अपकेंद्रित्र डिग्री सेल्सियस के साथ एक बार कोशिकाओं को धो लें
  4. RPMI 1640 के 10 मिलीलीटर में जीवाणुओं Resuspend (फिनोल लाल के बिना) और trypan Blu उपयोग कर जीवित कोशिकाओं गिनतीई डाई अपवर्जन विधि. इस neutrophils के सक्रियण में परिणाम मई के बाद से मिलीलीटर प्रति 5 एक्स 10 6 से बड़ा सेल घनत्व की लंबी अवधि से बचें.

3. Calcein AM साथ न्युट्रोफिल लेबल

  1. 6 एक्स 10 5 neutrophils, एक 48 अच्छी तरह से थाली के प्रति अच्छी तरह से इस्तेमाल कर रहे हैं.
  2. गिनती के बाद, एक 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब resuspended कोशिकाओं हस्तांतरण और 2-4 को फिनोल लाल मुक्त RPMI 1640 के साथ मिलीलीटर प्रति x 10 6 कोशिकाओं neutrophils पतला.
  3. Calcein 3 माइक्रोन (calcein AM स्टॉक यानी 2.98 μl (1 मिलीग्राम / एमएल) प्रति मिलीलीटर मीडिया के) के शेयर समाधान AM जोड़ें और धीरे ट्यूब flicking द्वारा अच्छी तरह से मिलाएं. ग्रेटर से 5 माइक्रोन calcein जीवाणुओं से रिसाव का परिणाम देगा AM नोट:. गैर फ्लोरोसेंट calcein AM अत्यधिक फ्लोरोसेंट अणु calcein (यानी मृत कोशिकाओं प्रतिदीप्ति नहीं होगा) के उत्पादन के लिए अंतर्जात esterases द्वारा कोशिकाओं के भीतर cleaved है.
  4. एल्यूमीनियम पन्नी के साथ ट्यूब कवर और च सेतेया 37 पर 30 मिनट डिग्री अंधेरे नोट में सी:. अब ऊष्मायन बार आसंजन परख के पाठ्यक्रम पर जीवाणुओं से मुक्त किया जा रहा अधिक calcein में हो सकता है.
  5. 18-22 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 450 XG पर अपकेंद्रित्र, और RPMI 1640 के 10 मिलीलीटर (फिनोल लाल के बिना, 37 के लिए पूर्व गर्म डिग्री सेल्सियस) के साथ 2x जीवाणुओं धो लो. एक 40 माइक्रोन बाँझ फिल्टर 18-22 में झुरमुटों को हटाने और फिर 5 मिनट के लिए 450 XG पर एक बार फिर अपकेंद्रित्र को हालांकि दूसरे धोने के लिए कोशिकाओं resuspending के बाद, पहले जीवाणुओं पारित डिग्री सेल्सियस
  6. मिलीलीटर प्रति 2 एक्स 10 6 जीवाणुओं पर., (37 डिग्री सेल्सियस के लिए पूर्व गरम बिना फिनोल लाल) 1640 RPMI में जीवाणुओं Resuspend

4. न्युट्रोफिल बंधन परख

  1. फिल्टर निष्फल (0.22 मीटर) RPMI 1640 के 0.5 मिलीलीटर (फिनोल लाल) के बिना अच्छी तरह से प्रति 3% BSA युक्त के साथ 3x HMVEC monolayers धो लें.
  2. मीडिया Aspirate और 6 x 10 5 calcein लेबल जीवाणुओं (सेल suspensio के 0.3 मिलीलीटर जोड़ें. 48 अच्छी तरह से थाली नोट की उचित कुओं को जीवाणुओं के बिना 1640 RPMI के एन), या 0.3 मिलीलीटर (फिनोल लाल के बिना): यह 2 सेमी प्रति 8 एक्स 5 10 neutrophils के बराबर है.
  3. एक 37 डिग्री सेल्सियस में 20 मिनट, 5% सीओ 2 इनक्यूबेटर के लिए सेते हैं.
  4. कुल न्युट्रोफिल प्रतिदीप्ति (पूर्व धोने): 485 एनएम के एक उत्तेजना तरंगदैर्ध्य और एक FLUOstar, या समकक्ष, स्पेक्ट्रोफोटोमीटर में 520 एनएम (fluorescein फिल्टर सेट) के एक उत्सर्जन तरंग दैर्ध्य के साथ एक अच्छी तरह से प्रतिदीप्ति तीव्रता उपाय. . सिर्फ पूर्व ऊष्मायन अंत बिंदु को ध्यान दें कि इस कदम प्रदर्शन: इस प्रोटोकॉल में, calcein उत्तेजना और उत्सर्जित प्रकाश का पता लगाने का पर्दाफाश कुएं के ऊपर से प्रदर्शन किया गया, लेकिन, दोनों भी कुओं की गहराई से किया जा सकता है.
  5. पीबीएस के प्रति अच्छी तरह से 0.5 मिलीलीटर के साथ 5x HMVEC monolayers और neutrophils युक्त कुओं धो (डब्ल्यू / सीए 2 + और ​​2 मिलीग्राम +). मीडिया और washes निकालेंinverting थाली से, और कागज तौलिए पर धीरे ठोक शेष तरल निकालने के लिए.
  6. वापस अच्छी तरह से प्रति 1640 RPMI के 0.3 मिलीलीटर (फिनोल लाल के बिना) जोड़ें.
  7. पक्षपाती न्युट्रोफिल प्रतिदीप्ति (पोस्ट धोने): कदम 4.4 में के रूप में अच्छी तरह से प्रत्येक के प्रतिदीप्ति तीव्रता उपाय.
  8. प्रतिशत पालन और अच्छी तरह से प्रति रिश्तेदार पालन का निर्धारण करते हैं:

नोट: इस स्तर पर, calcein लेबल neutrophils की छवियों मानक fluorescein फिल्टर के साथ सुसज्जित एक प्रतिदीप्ति सक्षम माइक्रोस्कोप का उपयोग करके प्राप्त किया जा सकता है. चित्रा 4 में छवियों Pro7 सॉफ्टवेयर (क्यू इमेजिंग) क्यू कैप्चर का उपयोग कर एक Retiga 2000R कैमरा क्यू (इमेजिंग) से सुसज्जित एक ओलिंप IX51 उलटा माइक्रोस्कोप पर प्राप्त किया गया.

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Representative Results

एक न्युट्रोफिल बाध्यकारी परख का उपयोग विश्वसनीय, प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य परिणाम प्राप्त करने के लिए, यह चित्र 1 में HMVEC-फेफड़े के साथ सचित्र के रूप में स्वास्थ्य और microvascular endothelial कोशिकाओं की confluency, परख के दिन इष्टतम है कि आवश्यक है. इसके अलावा, यह कम बीतने संख्या microvascular ईसीएस (कम से कम 9 अंश अर्थात्) का उपयोग किया जाता है कि आवश्यक है, और तदनुसार, हम विगलन के दो सप्ताह के भीतर सभी प्रयोगों प्रदर्शन करने की सलाह देते हैं. neutrophils की स्वास्थ्य कोशिकाओं के कुछ तरीके में शामिल कर रहे हैं अगर calcein AM फ्लोरोसेंट calcein अणु को metabolized नहीं होगा, खासकर जब से भी अत्यंत महत्वपूर्ण है. हम trypan नीले अपवर्जन विधि का उपयोग करें, और कोशिकाओं का एक महत्वपूर्ण अनुपात (यानी दाग) मर रहे हैं तो परख के साथ आगे बढ़ना नहीं है.

वहाँ घनत्व ढाल और प्रतिजन आधारित स्तंभ जुदाई तरीकों सहित जीवाणुओं को अलग करने के कई तरीके हैं, और किसी भीये इस प्रक्रिया के लिए पर्याप्त होना चाहिए. हम एक्सिस शील्ड से Polymorphprep तैयार किया घनत्व ढाल समाधान का उपयोग करने के लिए चुना है. चित्रा 2 में देखा जा सकता है जीवाणुओं centrifugation के बाद निचले स्तर के अंदर हैं, जबकि PBMCs, ऊपर परत में मौजूद हैं. PBMC परत उनके हटाने पर granulocytes के संक्रमण से बचने के क्रम में aspirated है. यह पानी किसी भी शेष लाल रक्त कोशिकाओं lyse करने के लिए जोड़ा गया है, जिसमें कदम 2.9, वैकल्पिक है, यह नोट करना महत्वपूर्ण है. यह सब contaminating एरिथ्रोसाइट्स को दूर करने के लिए आदर्श है, जबकि हालांकि, यह जीवाणुओं काफी मौत भी हो सकती है, जिसके बाद 30 सेकंड से अधिक के लिए शुद्ध पानी में बैठ नहीं है कि महत्वपूर्ण है.

अंत में, जीवाणुओं calcein पूर्व गर्म (37 डिग्री सेल्सियस) RPMI 1640 मीडिया (फिनोल लाल के बिना) में धोया और resuspended 30 मिनट, के लिए AM साथ incubated हैं. यह प्रतिदीप्ति पढ़ने के साथ हस्तक्षेप कर सकते हैं जो फिनोल लाल, बिना मीडिया का उपयोग करने के लिए महत्वपूर्ण है. neutr की संख्याophils कुओं में जोड़ा प्रतिदीप्ति रीडिंग से पहले और बाद धोने स्पेक्ट्रोफोटोमीटर के रैखिक सीमा के भीतर हैं, बशर्ते कि बजाय मनमाने ढंग से है, और या तो न्युट्रोफिल पालन को बढ़ावा देने या रोकने उपचार है कि दोनों के बीच मतभेद (देखें नीचे) reproducibly पता लगाया जा सकता है. हम 10,000 से 1,000,000 लेबल neutrophils (चित्रा 3) विश्लेषण कर रहे हैं जब प्रतिदीप्ति आयुध डिपो 520Nm रैखिक सीमा के भीतर है कि लगता है. दिलचस्प है, हम भी अधिक जीवाणुओं TNFa साथ इलाज HMVEC-फेफड़े monolayers के लिए जोड़ रहे हैं के रूप प्रतिशत पालन बढ़ जाती है कि खोजने के लिए [100 एनजी / एमएल] 3 घंटा (3B चित्रा) के लिए. हम आसंजन का प्रतिशत काफी इस समय बिंदु (डेटा नहीं दिखाया गया है) के बाद वृद्धि नहीं करता आप के बाद से हम 20 मिनट के लिए एक साथ HMVEC-फेफड़े और calcein लेबल neutrophils सेते के लिए चुना है. ध्यान से, इस परख में हम मानक, स्पष्ट पॉलीस्टीरिन 48 अच्छी तरह से प्लेटों का इस्तेमाल किया और पाया कि टी के बीच प्रतिदीप्ति पार से अधिक रीडिंग का स्तरवह कुओं कुल प्रतिदीप्ति इनपुट (नहीं दिखाया डेटा) की अधिक से अधिक 0.5% करने के लिए राशि नहीं किया. फिर भी यदि उपलब्ध है, हम अधिक संवेदनशील प्रयोगों के लिए प्रतिदीप्ति स्पेक्ट्रोफोटोमीटर रीडिंग के लिए जानबूझकर बनाया 48 अच्छी तरह से प्लेटों का उपयोग करने की सलाह देते हैं, या बहुत कम से कम, अपने प्रयोग डिजाइन (1.2 चरण देखें) पार से अधिक रीडिंग कम करने के लिए.

कुओं में जोड़ा neutrophils की संख्या इतनी देर जोड़ा संख्या स्पेक्ट्रोफोटोमीटर के रैखिक सीमा के भीतर है बल्कि मनमाना है कि प्रदर्शित करने के लिए, हम p38 की अनुपस्थिति या उपस्थिति में TNFα का इलाज HMVEC-फेफड़े के साथ एक न्युट्रोफिल आसंजन परख प्रदर्शन neutrophils की बदलती इनपुट मात्रा में (यानी 40,000 / अच्छी तरह से, 200,000 / अच्छी तरह से या 1000000 / अच्छी तरह से) 25 का उपयोग कर-MAPK अवरोध BIRB7906,. p38-MAPK पहले TNFα का इलाज मानव ईसीएस में ई selectin अभिव्यक्ति के लिए आवश्यक होना दिखाया गया है, और इसके निषेध इसलिए TNFα सक्रिय HMVEC-फेफड़े न्युट्रोफिल बंधन को कम करना चाहिए26. वास्तव में, यह है कि हम (चित्रा -3 सी) का निरीक्षण क्या है. हम अधिक जीवाणुओं जोड़ रहे हैं प्रतिशत पालन बढ़ जाती है, और प्रतिशत पालन ऐसी अंतर - दाता विविधताओं, संगम पर neutrophils की गुणवत्ता और HMVEC का घनत्व, रिश्तेदार पालन के रूप में विभिन्न कारकों की वजह से, प्रयोगों के बीच भिन्न हो सकती है पाते हैं कि यद्यपि स्थितियों के बीच की परवाह किए बिना (चित्रा -3 सी और डेटा नहीं दिखाया गया है) कहा कि जीवाणुओं की संख्या में से प्रत्येक स्वतंत्र प्रयोग में अपेक्षाकृत स्थिर बनी हुई है. यह अंतर - प्रयोगात्मक स्थिरता के लिए एक सकारात्मक नियंत्रण के सापेक्ष रूप आसंजन डेटा प्रदर्शित करने के लिए बेहतर है क्यों ये आंकड़े यह भी उदाहरण देना.

यह पूरी तरह से परख कैसे काम करता है उदाहरण देकर स्पष्ट करने के लिए, हम साथ एक न्युट्रोफिल आसंजन परख प्रदर्शन TNFα का इलाज HMVEC-फेफड़े पूर्व incubated नियंत्रण एंटीबॉडी या एक ई selectin अवरुद्ध एंटीबॉडी के साथ या तो. ई selectin TNFa और कब्जा neutr साथ उपचार के बाद चुनाव आयोग की सतह पर व्यक्त की हैglycomolecules साथ electrostatic बातचीत के माध्यम से vasculature से ophils न्युट्रोफिल सतह 1,27 पर उपस्थित थे. जैसा कि चित्र 4 बी में और नेत्रहीन चित्रा 4C में रेखांकन, चित्रा -4 ए में संख्यानुसार दिखाया, TNFα का इलाज HMVEC-फेफड़े TNFα का इलाज HMVEC-फेफड़े पूर्व incubated से ~ 75% कम जीवाणुओं बाध्य ई selectin एंटीबॉडी के साथ पूर्व incubated नियंत्रण आईजीजी साथ. इस ई selectin हमारे स्थिर आसंजन परख में HMVEC-फेफड़े को जीवाणुओं tethering में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है पता चलता है.

चित्रा 1
चित्रा 1. स्वस्थ, मिला हुआ HMVEC-फेफड़े monolayers का उदाहरण है. "पत्थर" उपस्थिति और monolayers के confluency कुल ध्यान दें. छवियाँ एक फिशर साइंटिफिक Micromaster उल्टे डिजिटल माइक्रोस्कोप पर 4X और 10X बढ़ाई पर ले जाया गया. चित्रा 2
चित्रा 2. पूरे रक्त और Polymorphprep centrifugation के लिए पहले स्तरित (ए) और (बी) centrifugation के बाद अलग कर दिया. नोट polymorphonuclear granulocytes (जीवाणुओं) एक अलग निचले बैंड बनाने जबकि centrifugation के बाद, PBMCs, एक अलग ऊपरी बैंड है कि फार्म.

चित्रा 3
चित्रा 3. न्युट्रोफिल संख्या और प्रतिदीप्ति आयुध डिपो 520Nm के बीच रैखिक संबंध है, और जीवाणुओं के रूप में TNFα का इलाज HMVEC-फेफड़े बढ़ जाती है neutrophils के प्रतिशत आसंजन जोड़ रहे हैं, p38-MAPK TNFα सक्रिय HMVEC-फेफड़े monolayers के लिए न्युट्रोफिल पालन को बढ़ावा देता है (ए) के ग्राफ. linea चित्रणपरिमाण के दो आदेश पर प्रतिदीप्ति आयुध डिपो 520Nm और न्युट्रोफिल संख्या के बीच आर रिश्ता. 0.996 के एक R2 के मूल्य 10,000 तक 1,000,000 neutrophils, विश्लेषण कर रहे हैं जब न्युट्रोफिल संख्या और प्रतिदीप्ति आयुध डिपो 520Nm के बीच एक रैखिक संबंध को दर्शाता है. Calcein लेबल neutrophils की बदलती संख्या में जोड़ा गया था जब प्रतिशत पालन का (बी) ग्राफ़िकल प्रतिनिधित्व अनुपचारित या TNFα का इलाज ( 100 एनजी / एमएल;. 48 अच्छी तरह प्लेटें में 3 घंटा) HMVEC-फेफड़े monolayers (सी) HMVEC-फेफड़े monolayers के लिए p38-MAPK अवरोध BIRB796 (10 मिमी) (एक्जॉन Medchem) या DMSO (नियंत्रण) के साथ पहले से incubated रहे थे TNFa से पहले 1 घंटा (100 एनजी / एमएल) के 3 घंटे के लिए उपचार BIRB796 (10 मिमी) की निरंतर उपस्थिति में हुए. रिश्तेदार पालन कदम 4.8 में के रूप में गणना की गई. डेटा मतलब ± एसडी के रूप में व्यक्त कर रहे हैं. GraphPad चश्मे टी परीक्षण unpaired सांख्यिकीय विश्लेषण (एन = 3) (TNFα का इलाज बनाम प्लस BIRB796 TNFα का इलाज) के लिए इस्तेमाल किया गया था. पी मूल्य ** 0.01 <; *** &# 60;. 0.001 बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें .

चित्रा 4
चित्रा 4. ई selectin के लिए neutrophils के पालन को बढ़ावा TNFa का इलाज HMVEC-फेफड़े. HMVEC-फेफड़े TNFα के साथ इलाज किया गया [100 एनजी / एमएल] 3 घंटा के लिए. 3% बीएसए (4.1 कदम), या तो भेड़ आईजीजी [50 माइक्रोग्राम / एमएल] जिसमें 1640 RPMI साथ HMVEC-फेफड़े धोने के बाद (5-001-ए, आर एंड डी सिस्टम) या ई selectin पॉलीक्लोनल एंटीबॉडी (पीएबी) [50 मिलीग्राम / एमएल] (AF724, आर एंड डी सिस्टम) 20 मिनट के लिए उपयुक्त कुओं को जोड़ा गया था. 6 एक्स 10 5 neutrophils, एक अतिरिक्त 20 मिनट के लिए अच्छी तरह से प्रति जोड़ा गया था पहले HMVEC-फेफड़े monolayers तो एक बार फिर RPMI 1640 से धोया गया. (ए) प्रतिशत और रिश्तेदार पालन निर्धारित करने के लिए गणना दिखाए जाते हैं. Calceinप्रकाश उत्सर्जन आयुध डिपो के 520 एनएम पर मापा जाता है. पृष्ठभूमि आयुध डिपो 520Nm औसत TNFα उपचार और neutrophils के अभाव में HMVEC-फेफड़े से ली गई है. (बी) के इलाज या TNFα का इलाज HMVEC-फेफड़े monolayers के लिए calcein लेबल neutrophils के सापेक्ष प्रतिशत पालन की चित्रमय प्रतिनिधित्व के पूर्व ऊष्मायन के बाद या तो नियंत्रण के साथ आईजीजी या ई selectin PAB अवरुद्ध. डेटा मतलब ± एसडी के रूप में व्यक्त कर रहे हैं. GraphPad चश्मे टी परीक्षण unpaired सांख्यिकीय विश्लेषण (एन = 3) के लिए इस्तेमाल किया गया था. गणना पी मूल्य <0.001 था. (सी) अनुपचारित और TNFα का इलाज HMVEC-फेफड़े monolayers के नियंत्रण आईजीजी या ई selectin PAB के साथ या तो पूर्व incubated लिए बाध्य calcein लेबल neutrophils की छवियाँ. अच्छी तरह से पीबीएस के साथ धोने से पहले 6 एक्स 5 10 जीवाणुओं से युक्त एक उदाहरण (पूर्व धोने) दिखाया गया है. संदर्भ के एक ही क्षेत्र के प्रतिदीप्ति छवियों, एक fluorescein फिल्टर का उपयोग करते समय पारदर्शी प्रकाश माइक्रोस्कोपी छवियों, दाएँ हाथ के कॉलम में दिखाए जाते हैंसेट, बाएं हाथ के कॉलम में दिखाया जाता है. छवियाँ एक Retiga 2000R कैमरा क्यू (इमेजिंग) से सुसज्जित एक ओलिंप IX51 उलटा माइक्रोस्कोप पर 10X बढ़ाई पर ले जाया गया. पूर्व धोने = कुल न्युट्रोफिल प्रतिदीप्ति आयुध डिपो 520Nm (चरण 4.4), पोस्ट धोने = पक्षपाती न्युट्रोफिल प्रतिदीप्ति आयुध डिपो 520Nm (चरण 4.7); PMN - polymorphonuclear granulocytes, औसत - औसत, आईजीजी - भेड़ आईजीजी नियंत्रण; E-sel/α-E-selectin - ई selectin PAB अवरुद्ध. बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें .

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Discussion

एक सफल न्युट्रोफिल / microvascular endothelial सेल आसंजन परख के लिए सबसे महत्वपूर्ण कदम हैं: 1) कम बीतने संख्या (<9), स्वस्थ endothelial कोशिकाओं का प्रयोग करें, एक कम घनत्व (यानी <5 x 10 6 कोशिकाओं को अलग जीवाणुओं को बनाए रखने 2) / एमएल) और अलगाव के दो घंटे के भीतर उन का उपयोग कर, क्रमशः और 3) दुराराध्य calcein AM लेबल neutrophils की धुलाई और neutrophils से calcein के चुनाव आयोग संदूषण और नुकसान को कम करने के लिए एक समय पर फैशन में calcein AM लेबल neutrophils के उपयोग, .

हम टिशू कल्चर के 2 सेमी प्रति 8 एक्स 5 10 जीवाणुओं अच्छी तरह से सतह क्षेत्र (यानी 600,000 neutrophils के प्रति अच्छी तरह से एक 48 अच्छी तरह से थाली में से) जोड़ें. हम 600,000 neutrophils की एक इनपुट हमारे स्पेक्ट्रोफोटोमीटर के रैखिक सीमा के भीतर है कि मिल जाए, और रिश्तेदार adherences मापा जाता है जब मज़बूती से डेटा reproduces. हालांकि, न्युट्रोफिल बंधन में एक बहुत ही इसी तरह की कमी में मनाया जाता है40000, 200000 या 1000000 neutrophils के प्रति अच्छी तरह से जोड़ रहे हैं जब p38-MAPK निषेध परख (चित्रा -3 सी), कम से कम 600,000 जीवाणुओं का इस्तेमाल किया जा सकता है कि संकेत मिलता है.

प्रोटोकॉल के साथ साथ वर्णित केवल खुद को पूर्व सक्रिय, या पाठ्यक्रम के लिए अपने विशेष परख की आवश्यकता है यह तो एक विकल्प है, जो किसी भी तरह से इलाज नहीं कर रहे जीवाणुओं के बाद endothelial सक्रियण की हद तक का आकलन है. हम HMVEC-फेफड़े पिछले टिप्पणियों 27 के साथ संगत, इस परख में neutrophils की कुर्की के लिए महत्वपूर्ण है पर ई selectin की अभिव्यक्ति TNFa का इलाज करता है. न्युट्रोफिल सतह पर मौजूद glycomolecules को ई selectin के electrostatic बंधन अपेक्षाकृत कमजोर कर रहे हैं, लेकिन प्रवाह शर्तों के तहत, इन मुलाकातों neutrophils और ईसीएस 1,7-10 के बीच उच्च आत्मीयता इंटीग्रिन की मध्यस्थता संलग्नक प्रेरित करने के लिए लगा रहे हैं. इसलिए, इस परख सूजन में प्रारंभिक कदम के अधिक संकेत हो सकता है कि गिरफ्तारीvasculature से जीवाणुओं कब्जा करने के लिए आवश्यक ई. बहरहाल, हम physiologically प्रासंगिक हैं इस रिपोर्ट में TNFα साथ प्राप्त हमारे परिणाम यह स्थिर परख के परिणामों का संकेत है, एक प्रवाह मॉड्यूल (नहीं दिखाया डेटा) का उपयोग कर प्राप्त लोगों के लिए, अत्यधिक इसी तरह, अगर नहीं समान थे कि सत्यापित और पता चलता है कि इस परख एक प्रवाह प्रणाली के लिए पहुँच नहीं है कि शोधकर्ताओं के लिए विशेष रूप से उपयोगी है.

पता लगाने फ्लोरोफोरे रूप calcein का उपयोग वर्णित परख के बदलाव,, पहली बार 1993 28,29 में वर्णित किया गया. महत्वपूर्ण बात, इन प्रारंभिक रिपोर्टों calcein सेल व्यवहार्यता को प्रभावित नहीं किया है कि पाया और अन्य fluorescein व्युत्पन्न रंगों 29,30 की तुलना में जब आसंजन assays में सेल समारोह पर कम से कम प्रभाव पड़ा है. यह भी सेल नंबर हम (चित्रा 3) 28 निरीक्षण के साथ संगत, फ्लोरोसेंट तीव्रता के संबंध में रैखिक है कि सूचना मिली थी. प्रारंभिक रिपोर्टों पर भी प्रकाश डाला है कि एकfluorometric assays के प्रमुख लाभ यह है कि वे विशुद्ध ल्यूकोसाइट्स 31-33 की (करोड़ या 51 जैसे 111) radiolabeling की आवश्यकता नहीं है. radiolabeled कोशिकाओं पर calcein AM लेबल कोशिकाओं का उपयोग करने के फायदे और consistencies अच्छी तरह से पहले से 28,29,34 चर्चा की गई है. हम उपयोग हालांकि calcein हमारे assays में neutrophils, esterase substrates हैं कि उपलब्ध हैं कई अन्य सेल permeant रंजक लेबल करने दें. उदाहरण के लिए, जीवन टेक्नोलॉजीज CellTrace calcein लाल, नारंगी (C34852), calcein वायलेट (C34858) और उत्तेजित / विभिन्न तरंगदैर्य पर फेंकना कि calcein नीला (C34853) बेचता है. विभिन्न रंगों के प्रत्येक अपने फायदे और नुकसान है. उदाहरण के लिए, calcein लाल, नारंगी हूँ डाई हाइड्रोलिसिस 18 से पहले कुछ आंतरिक प्रतिदीप्ति है.

हम बैक्टीरिया और अंतर्जात कारकों (जैसे TNFa के रूप में) के जवाब में endothelium के भड़काऊ सक्रियण अध्ययन करने के लिए इस विधि का उपयोग करें, और वेंहमें उचित नियंत्रण के साथ परख करने के लिए पर्याप्त मात्रा में विस्तार किया जा सकता है, जो शवों से एकत्र HMVECs उपयोग और पर्याप्त सांख्यिकीय विश्लेषण प्रदर्शन करने के लिए replicates. क़यास, इस परख भी माइक्रोवैस्कुलर अन्तःचूचुक को ल्युकोसैट बाध्यकारी शामिल है कि endothelial आधारित रोग प्रक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए एक उपकरण के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है. रोगियों से HMVECs का उपयोग कर अध्ययन किया जा सकता है कि विकारों के उदाहरण क्रोनिक प्रतिरोधी फेफड़े के रोग (सीओपीडी), पूति, सूजन आंत्र रोग, vasculitides, ऐसे विरोधी न्युट्रोफिल साइटोप्लाज्मिक स्वप्रतिपिण्ड (ANCA) से जुड़े vasculitides के रूप में, और मस्तिष्क संवहनी malformations 35-40 शामिल . उदाहरण के लिए, HMVECs vasculitides या पूति पोस्टमार्टम, या संभवतः एक बायोप्सी या शल्य चिकित्सा के एक अंग की लकीर, और अलग अलग परिस्थितियों में मूल्यांकन जीवाणुओं का उनके बंधन आया है कि endothelial आधारित रोग प्रक्रियाओं के साथ रोगियों से साथ मनुष्यों से एकत्र किया जा सकता है. हालांकि, इस परख पर्याप्त आवश्यकतामिला हुआ monolayers लिए फार्म HMVECs, और इस प्रकार HMVECs की मात्रा का विस्तार किया है और कई मार्ग के बाद किया जाता है. विस्तार की यह प्रक्रिया चुनाव आयोग आधारित बीमारियों के साथ रोगियों से प्राथमिक ईसीएस का उपयोग अध्ययन डिजाइन करने में ध्यान में रखा जाना करने की आवश्यकता होगी जो ईसीएस में प्ररूपी परिवर्तन करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं. फिर भी, इस परख की चंचलता यह कई अन्य पक्षपाती और ल्युकोसैट प्रकार की कोशिकाओं के लिए अनुकूलित किया जा करने की अनुमति देता है. वास्तव में, इस परख, या इसके वेरिएंट, सफलतापूर्वक अन्य endothelial कोशिकाओं प्रकार से प्रयोग किया जाता है, और इस तरह के monocytes, THP-1, Jurkat, एच. एल -60 और U937 28,31,41 के रूप में प्राथमिक कोशिकाओं और सेल लाइनों. किया गया है यह परख तेजी, प्रदर्शन करने के लिए आसान प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य है और बहुत ही संवेदनशील होना सिद्ध, और इसलिए सूजन मध्यस्थों द्वारा endothelial सेल सक्रियण पता लगाने के लिए एक बहुत ही उपयोगी उपकरण है.

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.

Acknowledgments

इस काम संज्ञाहरण और Perioperative केयर के UCSF विभाग द्वारा समर्थित किया गया था.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
HMVEC-Lung Lonza CC-2527
EGM-2 MV Lonza CC-3202
HBSS Life Technologies 14175-095 Can be substituted with any vendor
48-well Tissue Culture Plates BD Falcon 353078
PBS (without phenol red) UCSF Cell Culture Facility CCFAL001 Can be substituted with any vendor
D-PBS (without Ca2+ and Mg2+ and phenol red) UCSF Cell Culture Facility CCFAL003 Can be substituted with any vendor
RPMI-1640 (without phenol red) Life Technologies 11835-030
Polymorphprep Axis-Shield 1114683
calcein AM Life Technologies C3099 (0.995 mM) stock soln
Trypan Blue Solution Sigma-Aldrich T8154
40 μM filters VWR 21008-949 Can be substituted with any vendor
FLUOstar OPTIMA Spectrophotometer BMG LABTECH -

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References

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Wilhelmsen, K., Farrar, K., Hellman, J. Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions. J. Vis. Exp. (78), e50677, doi:10.3791/50677 (2013).

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