Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Kvantitative Published: August 23, 2013 doi: 10.3791/50677
Automatic Translation
1, 1,2, 1
1Department of Anesthesia and Perioperative Care, University of California, San Francisco, 2Graduate Program in Biomedical Sciences, University of California, San Francisco

Summary

Neutrofil tilslutning til den aktiverede endotel på steder med infektion er en integreret del af værtens inflammatoriske respons. Beskrevet i denne rapport er en neutrofil binding assay, der giver mulighed for

Abstract

Det vaskulære endotel spiller en integrerende del i det inflammatoriske respons. Under den akutte fase af inflammation, der endotelceller (EC'er) aktiveres ved værts mediatorer eller direkte af konserverede mikrobielle komponenter eller værtsafledte fare molekyler. Aktiverede ECS udtrykke cytokiner, kemokiner og adhæsionsmolekyler, der mobiliserer, aktivere og fastholde leukocytter på stedet for infektion eller skade. Neutrofiler er de første leukocytter at ankomme, og klæbe til endotelet gennem en række adhæsionsmolekyler stede på overfladerne af begge celler. De vigtigste funktioner i neutrofiler er direkte eliminere mikrobielle trusler fremme af ansættelse af andre leukocytter gennem frigivelse af yderligere faktorer, og igangsætte sårheling. Derfor er deres rekruttering og tilknytningen til endotel er et afgørende skridt i indledningen af ​​den inflammatoriske respons. I denne rapport beskriver vi en in vitro neutrofiladhæsion assay hjælpcalcein AM-mærkede primære humane neutrofiler at kvantificere omfanget af mikrovaskulære endotelcelle aktivering under statiske forhold. Denne metode har den yderligere fordel, at de samme prøver kvantificeret ved fluorescens-spektrofotometri også kan visualiseres direkte ved hjælp af fluorescensmikroskopi for en mere kvalitativ vurdering af neutrofil binding.

Introduction

Da det vaskulære endotel er i direkte kontakt med det cirkulerende blod, er det unikt beliggende at indlede en hurtig inflammatorisk respons under infektion eller skade. Endotelceller (EC'er) udtrykkelige mønstergenkendelse receptorer, der genkender en række bevarede bakterielle komponenter og fare molekyler og receptorer for vært inflammatoriske mediatorer såsom TNF. Aktivering af disse receptorer inducerer EC'er at udskille cytokiner (f.eks IL-6, IL-8, CXCL1 og CCL2), og at opregulere adhæsionsmolekyler (fx E / P-selectin, VCAM-1 og ICAM-1) på deres celleoverflade 1 , 2.. Disse molekyler alle lette lokaliseringen af leukocytter til steder for infektion og skade for at rydde vært for smitstoffer og igangsætte væv reparation 3,4. Den neutrofile respons på infektion indebærer en velkoordineret samspil mellem det vaskulære endotel og reagerer neutrofiler. Ved EF aktivering, IL-8 udskilles og danner en intravaskulær gradient på endotelet, der tillader neutrofiler til hjem til stedet for infektion eller skade 5,6. E / P-selectiner mægle neutrofil indfangning og rullende gennem relativt svage associationer glycomolecules på neutrofile celleoverfladen. Disse interaktioner, sammen med IL-8 binding til dets kognate receptorer, lette robuste, integrin-medieret binding og eventuel anholdelse af neutrofiler på endotelcelleoverfladen 7-10. Efter anholdelse, kan neutrofile migrere ud af karrene til de specifikke steder for smitte til direkte at eliminere patogener, generere neutrofile ekstracellulære fælder for at forhindre spredning af patogener, fremme sårheling og frigøre yderligere faktorer, som rekrutterer andre leukocytter såsom monocytter, makrofager og dendritiske celler 11-17.

Beskrevet i denne rapport er en in vitro metode til at kvantificere neutrofil overholdelse microVascular EC'er efter aktivering af værten inflammatorisk mediator TNF. Denne analyse er at vurdere aktiveringen af ​​ECS og ikke neutrofiler. Primære humane neutrofiler er først isoleret ved anvendelse densitetsgradient separation, og derefter mærket med calcein acetoxymethyl (AM). Esteraser i levende celler hydrolysere calcein AM til den meget fluorescerende calcein molekyle med et excitation af 492-495 nm og emission af 513-516 nm 18 år. De fluorescens-mærkede neutrofiler inkuberes derefter med EF-monolag, og ikke-adhærente neutrofiler efterfølgende fjernet. Fluorescensen af ​​de resterende, bundne neutrofiler måles derefter ved hjælp af et fluorescensspektrofotometer, og beregnes som en procent af den samlede neutrofil fluorescens input per brønd. Denne metode har den yderligere fordel, at de bundne calcein-mærkede neutrofiler anvendes i spektrofotometri kan visualiseres direkte ved hjælp af fluorescensmikroskopi for at give en mere kvalitativ udlæses af EF acvation. Da dette assay udføres under statiske betingelser, vil kun de meget indledende begivenheder, der opstår i neutrofiladhæsion kaskade vurderes. Dette bekræftes i denne rapport ved hjælp E-selectin blokerende antistoffer at vise, at neutrofil overholdelse TNF-behandlet human lunge mikrovaskulære EC (HMVEC-Lung) monolag er drastisk reduceret, når samspillet med E-selectin er forstyrret.

Ud over TNFa, har vi med succes anvendt dette assay til at bestemme omfanget af menneskers navlevene EF (HUVEC) aktivering af Toll-like receptor 1/2 agonister peptidoglycan-associeret lipoprotein (PAL), murein lipoprotein (MLP) og Pam3Cys og HMVEC-Lunge aktivering med Pam3Cys 19,20. Desuden, vi succesfuldt anvendt dette assay med kinaseinhibitorer og efter RNAi-medieret knockdown af overflade-og cytoplasmiske proteiner i HMVEC-Lung, antyder, at denne metode er forenelig med en række biokemiske og screening assays 20. Sammenfattet indeholder denne analyse en nem at bruge, reproducerbar, mere funktionel måde at få adgang omfanget af EF-aktivering ved inflammatoriske mediatorer in vitro.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1.. Plating og vedligeholdelse af Mikrovaskulære endotelceller

  1. Tø og dyrke dine mikrovaskulære endotelceller ifølge producenterne leverede anvisninger. I denne protokol blev celler dyrket i EGM-2 MV medier (Lonza), og det anbefales, at alle forsøg udføres inden for to uger efter optøning for at minimere enhver variation som følge passage nummer. Vores eksperimenter med HMVEC-Lung gennemføres mellem passagerne 4-9.
  2. Dag 1: Når cellerne når 80-90% konfluens Trypsinisér og resuspender på 120.000 celler pr. Plade 36.000 celler (0,3 ml) per brønd i 48-brønds, polystyren vævskultur plade (r). Omfatte brønde HMVEC der ikke vil blive inkuberet med neutrofiler med henblik på at opnå en baggrundsfluorescens læsning. Medmindre at bruge 48-brønds plader specielt designet til fluorescensanalyser, alternerende rækker eller kolonner vil minimere enhver lys forurening fra tilstødende brønde. BEMÆRK: Wells kan præ-coated med poly-Lysine, collagen eller fibronectin.
  3. Dag 2: Tilføj friske medier.
  4. Dag 3: Ved fasekontrastmikroskopi, cellerne er sunde (dvs. "brosten" udseende og lille cellerester) bekræfte, og de ​​er 100% sammenflydende (figur 1). Hvis cellerne ikke er 100% sammenflydende, ændre mediet hver dag, indtil de er klar.
  5. Når HMVEC monolagene er klar til behandling, vaskes cellerne en gang med Hanks balancerede saltopløsning (HBSS) og tilsæt 0,3 ml af friske EGM-2 MV medier eller medier indeholdende inflammatoriske agonist til de passende brønde. I denne protokol HMVEC-Lung blev behandlet med TNF [100 ng / ml] (PeproTech, New Jersey) i 3 timer, da dette er et velbeskrevet aktivator af ECs 21.. BEMÆRK: Det anbefales, at du tid dit eksperiment, så dine aktiverede HMVEC celler (trin 4.1) og calcein AM mærkede neutrofiler (trin 3.5) er klar til at bruge på samme tid. Det tager os cirka 2,5 hr at isolere og mærke neutrophils.

2.. Neutrofil Isolation hjælp Polymorphprep

  1. Isolere neutrofiler som beskrevet tidligere 22, eller med en færdig densitetsgradient løsning at isolere polymorfkernede granulocytter fra fuldblod. Anvender Polymorphprep ifølge protokollen ved Nuzzi, et al. 2007 resultater i udbytter af ca 2-3 x 10 6 neutrofile pr ml fuldblod 23.. BEMÆRK: For at undgå overdreven erythrocyt lysis, en dextransedimentering at fjerne røde blodlegemer kan udføres før densitetsgradientcentrifugering 24..
  2. Bring Polymorphprep densitetsgradient løsning til RT.
  3. Saml 30 ml fuldblod fra en sund frivillig forsøgsperson i nærvær af et anti-koagulationsmiddel såsom heparin, citrat eller EDTA. Blodet skal anvendes inden for 2 timer, og holdes mellem 18-22 ° C.
  4. Lag 5 ml fuldblod over 5 ml af densitetsgradient opløsning i en 15 ml konisk rør (
  5. Centrifuger ved 450 xg i 30 minutter ved 18-22 ° C. Sørg for langsomt fremskynde og ned centrifugen (dvs. slukke centrifugen bremse), og afbalancere rørene godt for at forhindre vibrationer for at reducere aktivering af neutrofiler og forhindre blanding af lag. Længere centri gange eller højere centrifugalkraft vil resultere i lavere leukocyt lag, som indeholder neutrofiler, at migrere længere ned mod de pelleterede røde blodlegemer.
  6. Aspirer plasma og øvre leukocyt Båndet indeholdende PBMC'er at forebygge forurening af laget, der indeholder neutrofiler (figur 2B).
  7. Brug en 1-2 ml serologisk pipette til at fjerne det nederste leukocyt lag, der indeholder neutrofile. Kombiner de neutrofile lag i 30 ml PBS (uden Ca2 + og Mg2 +) i en 50 mlkonisk rør.
  8. Bringe volumenet op til 50 ml med PBS (uden Ca2 + og Mg2 +) og centrifugeres ved 450 xg i 10 minutter ved 18-22 ° C.

Bemærk: Trin 2.9 og 2.10 er valgfri, men anbefales.

  1. Aspirere supernatanten. Resuspendere neutrofiler i 8 ml sterilt vand i 30 sek for at lysere røde blodlegemer, straks tilføje cellesuspensionen til 2 ml 5x PBS (uden Ca2 + og Mg2 +) og forsigtigt blandes med hånden. IKKE inkuberes celler i vand i mere end 30 sek siden betydelig neutrofil døden kan forekomme.
  2. Centrifuger ved 250 xg i 5 minutter ved 18-22 ° C.
  3. Vask cellerne en gang med 10 ml PBS (uden Ca2 + og Mg2 +) og centrifugeres igen ved 250 xg i 5 minutter ved 18-22 ° C.
  4. Resuspendere neutrofiler i 10 ml RPMI-1640 (uden phenolrødt) og tælle de levende celler ved anvendelse af trypan-blue farveeksklusion metode. Undgå lange perioder med celletætheder større end 5 x 10 6 pr ml, da dette kan resultere i aktivering af neutrofile.

3.. Neutrofil Mærkning med Calcein AM

  1. 6 x 10 5 neutrofiler anvendes per brønd af en 48-brønds plade.
  2. Efter tælling, overføre resuspenderede cellerne til et 50 ml konisk rør og fortynde neutrofiler til 2-4 x 10 6 celler pr ml med phenolrødt-frit RPMI-1640.
  3. Tilføj calcein AM stamopløsning til 3 uM (dvs. 2,98 pi af calcein AM stamopløsning (1 mg / ml) pr ml medium) og blandes godt ved forsigtigt at knipse røret. Større end 5 uM calcein AM vil resultere i lækage fra neutrofiler Bemærk:. Ikke-fluorescerende calcein AM spaltes i cellerne af endogene esteraser at producere stærkt fluorescerende molekyle calcein (dvs. døde celler vil ikke fluorescerer).
  4. Dæk glasset med aluminiumsfolie og inkuberes feller 30 min ved 37 ° C i mørke Bemærk:. Længere inkubationstider kan resultere i mere calcein som frigives fra neutrofiler løbet af adhæsionsassayet.
  5. Centrifuger ved 450 xg i 5 minutter ved 18-22 ° C, og vask neutrofilerne 2x med 10 ml RPMI-1640 (uden phenolrødt, forvarmet til 37 ° C). Efter resuspendering af cellerne i den anden vask, passerer først neutrofilerne selvom en 40 uM sterilt filter for at fjerne klumper og centrifugeres igen ved 450 xg i 5 minutter ved 18-22 ° C.
  6. Resuspendere neutrofiler i RPMI 1640 (uden phenolrødt, forvarmet til 37 ° C) ved 2 x 10 6 neutrofiler per ml.

4.. Neutrophil bindingsassay

  1. Vask HMVEC monolag 3x med 0,5 ml filtersteriliseret (0,22 um) RPMI 1640 (uden phenolrødt) indeholdende 3% BSA per brønd.
  2. Aspirere medierne og tilsæt 6 x 10 5 calcein-mærkede neutrofiler (0,3 ml celle suspension) eller 0,3 ml RPMI 1640 (uden phenolrødt), uden neutrofiler, til de passende brønde i 48-brønds plade Bemærk:. Dette svarer til 8 x 10 5 neutrofile pr cm2.
  3. Inkuber i 20 minutter i et 37 ° C, 5% CO2 inkubator.
  4. Samlet Neutrophil Fluorescens (PRE vask): Mål fluorescensintensiteten af hver brønd med en excitationsbølgelængde på 485 nm og en emissionsbølgelængde på 520 nm (fluorescein filter sæt) i en Fluostar eller tilsvarende spektrofotometer. Udføre dette trin lige før inkubation slutpunkt Bemærk: I denne protokol blev calcein excitation og detektering af det udsendte lys udføres fra toppen af de udækkede brønde, men kan både også foretages fra bunden af brøndene..
  5. Vask brøndene indeholdende HMVEC monolag og neutrofiler 5x med 0,5 ml per brønd PBS (w / Ca 2 + og Mg 2 +). Fjern medierne og vaskerved at vende pladen, og klappede forsigtigt på papirservietter til at fjerne den resterende væske.
  6. Tilføj tilbage 0,3 ml RPMI 1640 (uden phenolrødt) per brønd.
  7. Klæbende Neutrophil Fluorescens (POST vask): Mål fluorescensintensiteten af hver såvel som i trin 4.4.
  8. Bestem procent vedhæftning og relative vedhæftning per brønd:

Bemærk: På dette stadium, kan billeder af calcein-mærkede neutrofiler opnås ved anvendelse af en fluorescens stand mikroskop udstyret med standard fluorescein filtre. Billederne i Figur 4 blev opnået på et Olympus IX51 omvendt mikroskop udstyret med et Retiga 2000R kamera (Q Imaging) ved hjælp af Q-Capture Pro7 software (Q Imaging).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

For at opnå pålidelige, reproducerbare resultater ved hjælp af en neutrofil bindingsassay, er det vigtigt, at sundhed og sammenflydning af de mikrovaskulære endotelceller er optimale på dagen for assayet, som illustreret med HMVEC-Lung i figur 1. Desuden er det bydende nødvendigt, at lave passage nummer mikrovaskulære ECS brugt (dvs. mindre end 9 passager), og derfor anbefaler vi at udføre alle eksperimenter inden for to uger efter optøning. Sundheden for neutrofile er også af allerstørste betydning, især da calcein AM vil ikke blive metaboliseret til fluorescerende calcein molekylet, hvis cellerne indeholdt i nogle måde. Vi bruger trypanblåteksklusion metode, og ikke fortsætte med analysen, hvis en betydelig del af cellerne er døde (dvs. farvet).

Der er flere måder at isolere neutrofiler, herunder densitetsgradient og antigen-baserede søjleseparation metoder, og enhver afdisse bør være nok for denne procedure. Vi valgte at bruge Polymorphprep færdige densitetsgradient løsning fra Axis-Shield. Som det kan ses i figur 2, PBMC'erne er til stede i det øverste lag, mens neutrofiler er inden i den nedre lag efter centrifugering. Den PBMC lag aspireres for at undgå forurening af granulocytter upon deres ophævelse. Det er vigtigt at bemærke, at trin 2.9, der består af vand tilsat for at lysere eventuelle resterende røde blodlegemer, er valgfri. Men mens det er ideelt at fjerne alle kontaminerende erythrocytter, er det afgørende, at neutrofiler ikke sidder i rent vand i mere end 30 sekunder, hvorefter betydelig død kan forekomme.

Endelig er neutrofiler inkuberet med calcein AM i 30 minutter, vasket og resuspenderet i foropvarmede (37 ° C) RPMI-1640-medier (uden phenolrødt). Det er vigtigt at anvende medier uden phenolrødt, som kan interferere med fluorescensaflæsning. Antallet af neutrophils tilsat til brøndene er temmelig vilkårligt, forudsat at de fluorescensaflæsninger præ-og post-vask er inden for det lineære område af spektrofotometeret, og forskellene mellem behandlinger, der enten fremmer eller forhindre neutrofil vedhæftning kan være reproducerbart konstateres (se nedenfor). Vi finder, at fluorescens OD 520nm er inden for det lineære område, når 10.000 til 1.000.000 mærkede neutrofiler analyseres (figur 3A). Interessant, finder vi også, at den procent tilslutning stiger, efterhånden som flere neutrofile føjes til HMVEC-Lung monolag behandlet med TNFa [100 ng / ml] for 3 timer (figur 3B). Vi valgte at inkubere HMVEC-Lunge og calcein-mærkede neutrofiler sammen i 20 min, da vi finder, at den procentdel af adhæsion ikke forøgede efter dette tidspunkt (data ikke vist). Det skal bemærkes, vi i dette assay anvendte standard, klar polystyren 48 brønd plader og fandt, at graden af ​​fluorescens cross-over aflæsninger mellem tHan brønde ikke udgøre mere end 0,5% af den samlede fluorescens input (data ikke vist). Alligevel anbefaler vi at bruge 48-brønds plader med vilje lavet til fluorescensspektrofotometer aflæsninger for mere følsomme eksperimenter, hvis den er tilgængelig, eller i det mindste at designe dit eksperiment minimerer cross-over aflæsninger (se trin 1.2).

At påvise, at antallet af neutrofiler tilsat til brøndene er temmelig vilkårligt, så længe den tilsatte nummer er inden for det lineære område af spektrofotometeret, udførte vi en neutrofiladhæsion assay med TNFa-behandlede HMVEC-Lung i fravær eller nærvær af p38 -MAPK hæmmer BIRB7906, ved hjælp af varierende input mængder af neutrofiler (dvs. 40.000 / godt, 200.000 / brønd eller 1.000.000 / godt) 25. p38-MAPK er tidligere blevet vist at være nødvendige for E-selectin ekspression i TNFa-behandlede humane EC'er, og dens hæmning bør derfor reducere neutrofil binding til TNFa-aktiveret HMVEC-Lung26.. I virkeligheden er det, hvad vi observerer (figur 3C). Selvom vi finder, at den procentvise vedhæftning øges, efterhånden som flere neutrofiler tilsættes, og den procentvise vedhæftning kan variere mellem eksperimenter, på grund af forskellige faktorer, såsom inter-donor variationer, kvaliteten af ​​neutrofiler og densiteten af ​​HMVEC på konfluens, den relative overholdelse mellem betingelser forbliver relativt konstant i hver uafhængigt forsøg uanset antallet af neutrofiler tilsat (figur 3C og data ikke vist). Disse data giver også eksempler, hvorfor det er bedre at vise vedhæftning data som i forhold til en positiv kontrol for inter-eksperimentelle konsistens.

For fuldt ud at illustrere, hvordan dette assay virker, udførte vi en neutrofiladhæsion assay med TNFa-behandlede HMVEC-Lunge præinkuberet med enten kontrol-antistof eller en E-selectin blokerende antistof. E-selectin udtrykkes på EF overfladen efter behandling med TNF og indfanger neutrophils fra vaskulaturen via elektrostatiske interaktioner med glycomolecules stede på neutrofile overflade 1,27. Som vist numerisk i figur 4A, grafisk i figur 4B og visuelt i figur 4C, TNFa-behandlede HMVEC-Lung præinkuberet med E-selectin antistof bundet ~ 75% færre neutrofiler end den TNFa-behandlede HMVEC-Lung præinkuberet med kontrol-IgG. Dette tyder E-selectin spiller en vigtig rolle i tøjring neutrofiler til HMVEC-Lung i vores statiske adhæsionsassay.

Figur 1
Figur 1. Eksempel på sunde, sammenflydende HMVEC-Lung monolag. Bemærk "brosten" udseende og total sammenflydning af monolagene. Billeder blev taget på 4X og 10X forstørrelse på en Fisher Scientific Micromaster inverteret digital mikroskop. Figur 2
Figur 2. Fuldblod og Polymorphprep lag inden centrifugering (A) og separeret efter centrifugering (B). Bemærk, at efter centrifugering, PBMC'erne udgøre en særskilt øvre bånd, mens de polymorfkernede granulocytter (neutrofiler) danner en tydelig lavere bånd.

Figur 3
Figur 3. Forholdet mellem neutrofil tal og fluorescens OD 520nm er lineær, den procent vedhæftning af neutrofiler til TNF-behandlede HMVEC-Lung stiger som flere neutrofiler tilsættes p38-MAPK fremmer neutrofil overholdelse TNF-aktiverede HMVEC-Lung monolag (A) Graf. afbilder linear forholdet mellem fluorescens OD 520nm og neutrofile tal over to størrelsesordener. En R2 værdi på 0,996 indikerer en lineær sammenhæng mellem neutrofil tal og fluorescens OD 520nm når 10.000 til 1.000.000 neutrofiler analyseres. (B) Grafisk repræsentation af procent tilslutning når varierende antal calcein-mærkede neutrofiler blev tilsat til ubehandlede eller TNFa-behandlede ( 100 ng / ml. 3 timer) HMVEC-Lung monolag i 48-brønds plader (C) HMVEC-Lung monolag blev præinkuberet med p38-MAPK inhibitor BIRB796 (10 mM) (Axon Medchem) eller DMSO (kontrol) for 1 time før TNFa (100 ng / ml) behandling i 3 timer, mens i den kontinuerlige tilstedeværelse af BIRB796 (10 mM). Den relative vedhæftning blev beregnet som i trin 4.8. Data er udtrykt som middelværdi ± SD. GraphPad Prism uparret t-test blev anvendt til statistisk analyse (n = 3) (TNFa-behandlede versus TNFa-behandlede plus BIRB796). p-værdi ** <0,01; *** &# 60;. 0,001 Klik her for at se større figur .

Figur 4
Figur 4.. E-selectin fremmer vedhæftningen af neutrofiler til TNFa-behandlede HMVEC-Lung. HMVEC-Lung blev behandlet med TNFa [100 ng / ml] i 3 timer. Efter vask HMVEC-Lung med RPMI 1640 indeholdende 3% BSA (trin 4.1), enten får IgG [50 ug / ml] (5-001-A, R & D Systems) eller E-selectin polyklonalt antistof (pAb) [50 mg / ml] (AF724, F & U-Systems) blev tilsat til de passende brønde til 20 min. De HMVEC-Lung monolag blev derefter vasket en gang mere med RPMI-1640 før 6 x 10 5 neutrofiler blev tilsat per brønd i yderligere 20 min. (A) beregninger for at bestemme procent og relative vedhæftning vises. Calceinlysemission måles ved OD 520 nm. Baggrund OD 520nm gennemsnitlig stammer fra HMVEC-Lung i fravær af TNFa behandling og neutrofiler. (B) Grafisk fremstilling af relativ procent adhærence af calcein-mærkede neutrofiler til ubehandlede eller TNFa-behandlede HMVEC-Lung monolag efter præinkubering med enten kontrol IgG eller E-selectin blokerende pAb. Data er udtrykt som middelværdi ± SD. GraphPad Prism uparret t-test blev anvendt til statistisk analyse (n = 3). Beregnet p-værdien var <0,001. (C) Billeder af calcein-mærkede neutrofiler bundet til ubehandlede og TNF-behandlet HMVEC-Lung monolag præinkuberes med enten kontrol IgG eller E-selectin pAb. Et eksempel brønd indeholdende 6 x 10 5 neutrofiler forud for vask med PBS vises (PRE vask). Gennemsigtig lys mikroskopi billeder vises i højre kolonne, mens fluorescens billeder af det samme område henvisning, ved hjælp af en fluorescein filterindstille, er vist i venstre kolonne. Billeder blev taget ved 10x forstørrelse på et Olympus IX51 omvendt mikroskop udstyret med en Retiga 2000R kamera (Q Imaging). FORVASK = total neutrofil fluorescens OD 520nm (Trin 4.4) POST vask = vedhængende neutrofil fluorescens OD 520nm (Trin 4.7) PMN - polymorfnukleære granulocytter, avg - gennemsnittet IgG - får IgG kontrol E-sel/α-E-selectin - E-selectin blokerende pAb. Klik her for at se større figur .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

De mest kritiske trin for en vellykket neutrofil / mikrovaskulære endotel celleadhæsionsassay er: 1) Anvendelse af lav passage nummer (<9), sunde endotelceller, 2) Opretholdelse af de isolerede neutrofiler ved en lav densitet (dvs. <5 x 10 6 celler / ml) og bruge dem inden for to timer isolation, og 3) Udsøgt vask af calcein AM-mærkede neutrofiler og brug af calcein AM-mærkede neutrofiler i tide for at minimere EF forurening og tab af calcein fra neutrofiler hhv .

Vi tilføjer 8 x 10 5 neutrofile pr cm 2 vævskultur godt overfladeareal (dvs. 600.000 neutrofile per brønd i en 48-brønds plade). Vi finder, at en indgang på 600.000 neutrofiler er inden for det lineære område af vores spektrofotometer og pålideligt gengiver data, når relative TILTRÆDELSER måles. Men en meget tilsvarende fald i neutrofil binding observeret ip38-MAPK inhiberingsassay (figur 3C), når 40.000, 200.000 eller 1.000.000 neutrofiler tilsat pr, tyder på, at mindre end 600.000 neutrofiler kan anvendes.

Protokollen beskrevet heri kun vurderer omfanget af endotel aktivering da neutrofilerne selv er ikke på forhånd aktiveret, eller behandles på nogen måde, hvilket naturligvis er en mulighed, hvis netop din analysen kræver det. Vi viser, at ekspressionen af E-selectin på TNFa-behandlede HMVEC-Lung er vigtigt for fastgørelsen af neutrofiler i dette assay, i overensstemmelse med tidligere observationer 27. Den elektrostatiske binding af E-selectin til glycomolecules stede på neutrofil overflade er relativt svage, men under strømningsforhold, er disse interaktioner menes at inducere høj affinitet integrin-formidlede vedhæftede mellem neutrofiler og til ECS 1,7-10. Derfor kan denne analyse være mere betegnende for de indledende trin i betændelse, are nødvendigt at indfange neutrofiler fra karrene. Ikke desto mindre har vi bekræftet, at vores resultater opnået med TNFa i denne rapport var meget ens, om ikke identiske, med dem opnået ved hjælp af et flow-modul (data ikke vist), der angiver resultaterne af denne statiske analyse er fysiologisk relevant og foreslår, at dette assay er især nyttigt for forskere, der ikke har adgang til et flow-system.

Variationer af den beskrevne assay med calcein som påvisning fluorofor, blev først beskrevet i 1993 28,29. Vigtigere, at disse første rapporter fandt, at calcein ikke påvirke cellernes levedygtighed og havde den mindste virkning på cellefunktion i adhæsionsassays sammenlignet med andre fluorescein-afledte farvestoffer 29,30. Det blev også rapporteret, at celle nummer er lineær med hensyn til fluorescerende intensitet i overensstemmelse med, hvad vi observerer (figur 3A) 28. Første rapporter også fremhævet, at enstor fordel af fluorometriske assays er, at de ikke kræver radiomærkning (f.eks 111 I eller 51Cr) af de oprensede leukocytter 31-33. Fordelene og konsistenser ved at bruge calcein AM-mærkede celler i løbet af radioaktivt mærkede celler er blevet grundigt diskuteret tidligere 28,29,34. Selvom vi bruger calcein AM at mærke neutrofilerne i vores analyser, adskillige andre celle permeantmaterialer farvestoffer, der er esterase substrater er tilgængelige. For eksempel sælger Life Technologies CellTrace calcein rød-orange (C34852), calcein violet (C34858), og calcein blå (C34853), der begejstrer / udsender ved forskellige bølgelængder. De forskellige farvestoffer har hver deres fordele og ulemper. For eksempel har calcein rødorange AM farvestof nogle iboende fluorescens forud for hydrolyse 18..

Vi bruger denne metode til at studere inflammatorisk aktivering af endotel som respons på bakterielle og endogene faktorer (såsom TNFa), og thos bruge HMVECs indsamlet fra kadavere, som kan udvides i tilstrækkelig mængde til at gøre analysen med ordentlig kontrol og nok gentagelser til at udføre statistiske analyser. Tænkeligt, at dette assay også anvendes som et værktøj til at studere endotel-baseret sygdom processer, der involverer leukocyt-binding til mikrovaskulære endotel. Eksempler på lidelser, der kan studeres ved hjælp HMVECs fra patienter omfatter kronisk obstruktiv lungesygdom (KOL), sepsis, inflammatorisk tarmsygdom, vaskulitis, såsom anti-neutrofil cytoplasmatisk autoantistof (ANCA)-associerede vaskulitis, og hjerne vaskulære misdannelser 35-40 . For eksempel kan HMVECs indsamles fra mennesker med vaskulitis eller sepsis post mortem, eller potentielt fra patienter med endotel baseret sygdom processer, der har undergået en biopsi eller kirurgisk resektion af et organ, og deres binding til neutrofiler vurderes under forskellige betingelser. Men dette assay kræver tilstrækkeligmængder HMVECs at danne sammenflydende monolag, og dermed HMVECs ekspanderes og anvendes efter flere passager. Denne proces med ekspansion kan føre til fænotypiske ændringer i ECS, som ville skulle tages i betragtning ved udformningen af ​​studier med primær ECs fra patienter med EF-baserede sygdomme. Alligevel alsidigheden af ​​dette assay tillader det kan tilpasses til mange andre vedhæftende og leukocyt celletyper. Faktisk har dette assay, eller varianter af det, er blevet anvendt med succes med andre endotelceller typer, og primære celler og cellelinier, såsom monocytter, THP-1, Jurkat, HL-60 og U937 28,31,41. Dette assay har vist sig at være hurtig, let at udføre, reproducerbar og meget følsomme, og er derfor et meget nyttigt værktøj til at detektere endotelcelle aktivering af inflammatoriske mediatorer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ikke noget at afsløre.

Acknowledgments

Dette arbejde blev støttet af UCSF Institut for Anæstesi og Perioperative Care.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
HMVEC-Lung Lonza CC-2527
EGM-2 MV Lonza CC-3202
HBSS Life Technologies 14175-095 Can be substituted with any vendor
48-well Tissue Culture Plates BD Falcon 353078
PBS (without phenol red) UCSF Cell Culture Facility CCFAL001 Can be substituted with any vendor
D-PBS (without Ca2+ and Mg2+ and phenol red) UCSF Cell Culture Facility CCFAL003 Can be substituted with any vendor
RPMI-1640 (without phenol red) Life Technologies 11835-030
Polymorphprep Axis-Shield 1114683
calcein AM Life Technologies C3099 (0.995 mM) stock soln
Trypan Blue Solution Sigma-Aldrich T8154
40 μM filters VWR 21008-949 Can be substituted with any vendor
FLUOstar OPTIMA Spectrophotometer BMG LABTECH -

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. I., Nourshargh, S. Getting to the site of inflammation: the leukocyte adhesion cascade updated. Nat. Rev. Immunol. 7, 678-689 (2007).
  2. Collins, T., et al. Transcriptional regulation of endothelial cell adhesion molecules: NF-kappa B and cytokine-inducible enhancers. FASEB Journal : Official Publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 9, 899-909 (1995).
  3. Medzhitov, R. Origin and physiological roles of inflammation. Nature. 454, 428-435 (2008).
  4. Chen, G. Y., Nunez, G. Sterile inflammation: sensing and reacting to damage. Nat. Rev. Immunol. 10, 826-837 (2010).
  5. Middleton, J., et al. Transcytosis and surface presentation of IL-8 by venular endothelial cells. Cell. 91, 385-395 (1997).
  6. Rot, A. Endothelial cell binding of NAP-1/IL-8: role in neutrophil emigration. Immunol. Today. 13, 291-294 (1992).
  7. Detmers, P. A., et al. Neutrophil-activating protein 1/interleukin 8 stimulates the binding activity of the leukocyte adhesion receptor CD11b/CD18 on human neutrophils. J. Exp. Med. 171, 1155-1162 (1990).
  8. Laudanna, C., Kim, J. Y., Constantin, G., Butcher, E. Rapid leukocyte integrin activation by chemokines. Immunol. Rev. 186, 37-46 (2002).
  9. Simon, S. I., Hu, Y., Vestweber, D., Smith, C. W. Neutrophil tethering on E-selectin activates beta 2 integrin binding to ICAM-1 through a mitogen-activated protein kinase signal transduction pathway. J. Immunol. 164, 4348-4358 (2000).
  10. Zarbock, A., Ley, K. Mechanisms and consequences of neutrophil interaction with the endothelium. The American Journal of Pathology. 172, 1-7 (2008).
  11. Muller, W. A. Mechanisms of leukocyte transendothelial migration. Annu. Rev. Pathol. 6, 323-344 (2011).
  12. Brinkmann, V., et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303, 1532-1535 (2004).
  13. Kumar, V., Sharma, A. Neutrophils: Cinderella of innate immune system. International Immunopharmacology. 10, 1325-1334 (2010).
  14. McDonald, B., et al. Intravascular danger signals guide neutrophils to sites of sterile inflammation. Science. 330, 362-366 (2010).
  15. Nathan, C. Neutrophils and immunity: challenges and opportunities. Nat. Rev. Immunol. 6, 173-182 (2006).
  16. Soehnlein, O., Lindbom, L., Weber, C. Mechanisms underlying neutrophil-mediated monocyte recruitment. Blood. 114, 4613-4623 (2009).
  17. Wilhelmsen, K., Mesa, K. R., Prakash, A., Xu, F., Hellman, J. Activation of endothelial TLR2 by bacterial lipoprotein upregulates proteins specific for the neutrophil response. Innate Immun. 18, 602-616 (2012).
  18. Haugland, R. P., Johnson, I. D., Basey, A. The Handbook: A Guide to Fluorescent Probes and Labelling Technologies. , 10, (2005).
  19. Shin, H. S., et al. Bacterial lipoprotein TLR2 agonists broadly modulate endothelial function and coagulation pathways in vitro and in vivo. J. Immunol. 186, 1119-1130 (2011).
  20. Wilhelmsen, K., Mesa, K. R., Lucero, J., Xu, F., Hellman, J. ERK5 protein promotes, whereas MEK1 protein differentially regulates, the Toll-like receptor 2 protein-dependent activation of human endothelial cells and monocytes. J. Biol. Chem. 287, 26478-26494 (2012).
  21. Pober, J. S., Sessa, W. C. Evolving functions of endothelial cells in inflammation. Nat. Rev. Immunol. 7, 803-815 (2007).
  22. Oh, H., Siano, B., Diamond, S. Neutrophil isolation protocol. J. Vis. Exp. (17), e745 (2008).
  23. Nuzzi, P. A., Lokuta, M. A., Huttenlocher, A. Analysis of neutrophil chemotaxis. Methods Mol. Biol. 370, 23-36 (2007).
  24. Garcia-Garcia, E., Uribe-Querol, E., Rosales, C. A simple and efficient method to detect nuclear factor activation in human neutrophils by flow cytometry. J. Vis. Exp. (74), e50410 (2013).
  25. Kuma, Y., et al. BIRB796 inhibits all p38 MAPK isoforms in vitro and in vivo. J. Biol. Chem. 280, 19472-19479 (2005).
  26. Westra, J., Kuldo, J. M., van Rijswijk, M. H., Molema, G., Limburg, P. C. Chemokine production and E-selectin expression in activated endothelial cells are inhibited by p38 MAPK (mitogen activated protein kinase) inhibitor RWJ 67657. International Immunopharmacology. 5, 1259-1269 (2005).
  27. Leeuwenberg, J. F., Jeunhomme, G. M., Buurman, W. A. Adhesion of polymorphonuclear cells to human endothelial cells. Adhesion-molecule-dependent, and Fc receptor-mediated adhesion-molecule-independent mechanisms. Clinical and Experimental Immunology. 81, 496-500 (1990).
  28. Akeson, A. L., Woods, C. W. A fluorometric assay for the quantitation of cell adherence to endothelial cells. Journal of Immunological Methods. 163, 181-185 (1993).
  29. Vaporciyan, A. A., Jones, M. L., Ward, P. A. Rapid analysis of leukocyte-endothelial adhesion. Journal of Immunological Methods. 159, 93-100 (1993).
  30. De Clerck, L. S., Bridts, C. H., Mertens, A. M., Moens, M. M., Stevens, W. J. Use of fluorescent dyes in the determination of adherence of human leucocytes to endothelial cells and the effect of fluorochromes on cellular function. Journal of Immunological Methods. 172, 115-124 (1994).
  31. Bevilacqua, M. P., Pober, J. S., Wheeler, M. E., Cotran, R. S., Gimbrone, M. A. Interleukin 1 acts on cultured human vascular endothelium to increase the adhesion of polymorphonuclear leukocytes, monocytes, and related leukocyte cell lines. The Journal of Clinical Investigation. 76, (1985).
  32. Schleimer, R. P., Rutledge, B. K. Cultured human vascular endothelial cells acquire adhesiveness for neutrophils after stimulation with interleukin 1, endotoxin, and tumor-promoting phorbol diesters. J. Immunol. 136, 649-654 (1986).
  33. Gamble, J. R., Harlan, J. M., Klebanoff, S. J., Vadas, M. A. Stimulation of the adherence of neutrophils to umbilical vein endothelium by human recombinant tumor necrosis factor. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82, 8667-8671 (1985).
  34. Braut-Boucher, F., et al. A non-isotopic, highly sensitive, fluorimetric, cell-cell adhesion microplate assay using calcein AM-labeled lymphocytes. Journal of Immunological Methods. 178, 41-51 (1995).
  35. Ait-Oufella, H., Maury, E., Lehoux, S., Guidet, B., Offenstadt, G. The endothelium: physiological functions and role in microcirculatory failure during severe sepsis. Intensive Care Medicine. 36, 1286-1298 (2010).
  36. Andonegui, G., et al. Endothelium-derived Toll-like receptor-4 is the key molecule in LPS-induced neutrophil sequestration into lungs. The Journal of Clinical Investigation. 111, 1011-1020 (2003).
  37. Sharma, J., et al. Lung endothelial cell platelet-activating factor production and inflammatory cell adherence are increased in response to cigarette smoke component exposure. American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 302, L47-L55 (2012).
  38. Deban, L., Correale, C., Vetrano, S., Malesci, A., Danese, S. Multiple pathogenic roles of microvasculature in inflammatory bowel disease: a Jack of all trades. The American Journal of Pathology. 172, 1457-1466 (2008).
  39. Gross, W. L., Trabandt, A., Csernok, E. Pathogenesis of Wegener's granulomatosis. Annales de Medecine Interne. 149, 280-286 (1998).
  40. Chen, Y., et al. Evidence of inflammatory cell involvement in brain arteriovenous malformations. Neurosurgery. 62, 1340-1349 (2008).
  41. Martens, C. L., et al. Peptides which bind to E-selectin and block neutrophil adhesion. J. Biol. Chem. 270, 21129-21136 (1995).

Tags

Immunologi cellebiologi infektion molekylærbiologi medicin Biomedical Engineering Biofysik Endothelium vaskulær Neutrophils Inflammation inflammatoriske mediatorer Neutrophil leukocytadhæsion endotelceller assay
Kvantitative<em&gt; In vitro</em&gt; Assay til måling neutrofiladhæsion til Aktiverede primære humane mikrovaskulære endotelceller under statiske forhold
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Wilhelmsen, K., Farrar, K., Hellman, … More

Wilhelmsen, K., Farrar, K., Hellman, J. Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions. J. Vis. Exp. (78), e50677, doi:10.3791/50677 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter