Kvantitativ Published: August 23, 2013 doi: 10.3791/50677

DOI

Automatic Translation

• English (Original)
• العربية (Arabic)
• 中文 (Chinese)
• dansk (Danish)
• Nederlands (Dutch)
• français (French)
• Deutsch (German)
• עברית (Hebrew)
• हिंदी (Hindi)
• italiano (Italian)
• 日本語 (Japanese)
• 한국어 (Korean)
• norsk (Norwegian)
• português (Portugese)
• русский (Russian)
• español (Spanish)
• svenska (Swedish)
• Türkçe (Turkish)

Kevin Wilhelmsen¹, Katherine Farrar^1,2, Judith Hellman¹

¹Department of Anesthesia and Perioperative Care, University of California, San Francisco, ²Graduate Program in Biomedical Sciences, University of California, San Francisco

Summary

Nøytrofile tilslutning til aktivert endotel på nettstedene til infeksjon er en integrert del av vertens inflammatorisk respons. Beskrevet i denne rapporten er en nøytrofile bindingsanalyse som gir mulighet for

Abstract

Blodåreendotelets spiller en vesentlig rolle i den inflammatoriske respons. I den akutte fasen av betennelse, er endotelceller (ECS) aktiveres av vert meklere eller direkte av konserverte mikrobielle komponenter eller host-avledet fare molekyler. Aktiverte egenkapitalbevis uttrykke cytokiner, chemokiner og adhesjonsmolekyler som mobiliserer, aktivere og beholde leukocytter på stedet av infeksjon eller skade. Nøytrofile granulocytter er de første leukocytter å ankomme, og holder seg til endotelet gjennom en rekke adhesjonsmolekyler tilstede på overflaten av begge celler. De viktigste funksjonene til nøytrofile er å direkte eliminere mikrobielle trusler, fremme rekruttering av andre leukocytter gjennom utgivelsen av flere faktorer, og initiere sår reparasjon. Derfor er rekruttering og vedlegg til endotelet et kritisk punkt i initiering av den inflammatoriske respons. I denne rapporten beskriver vi en in vitro nøytrofile vedheft analysen hjelpCalcein AM-merket primære humane neutrofiler til å kvantifisere omfanget av mikrovaskulær endotelial celleaktivering under statiske forhold. Denne metode har den ytterligere fordel at de samme prøvene kvantifisert ved fluoresens-spektrofotometri kan også visualiseres direkte ved hjelp av fluorescens-mikroskopi for en mer kvalitativ vurdering av nøytrofil binding.

Introduction

Siden det vaskulære endotel er i direkte kontakt med det sirkulerende blod, er det en unik plassert for å initiere en hurtig inflammatorisk respons under infeksjon eller skade. Endotelceller (ECS) uttrykte mønstergjenkjenning reseptorer som gjenkjenner en rekke bevarte bakterielle komponenter og fare molekyler, og reseptorer for vert inflammatoriske mediatorer som TNF-alfa. Aktivering av disse reseptorene ECS å utskille cytokiner (for eksempel IL-6, IL-8, CXCL1 og CCL2), og å oppregulere adhesjonsmolekyler (f.eks E / P-selektin, VCAM-1 og ICAM-1) på deres celleoverflate ^{ett , 2..} Disse molekylene alt til rette for lokalisering av leukocytter til nettsteder for infeksjon og skade for å fjerne vert for smittestoffer og initiere vev reparasjon ^3,4. Den nøytrofile responsen på infeksjon innebærer en godt koordinert samspill mellom blodåreendotelets og svarer nøytrofile. Ved EF-aktivering, IL-8 utskilles og danner en intravaskulær gradient på endotelet som gjør at nøytrofile hjemme på stedet for infeksjon eller skade ^5,6. E / P-selectins megle nøytrofile fangst og rulle gjennom relativt svake assosiasjoner med glycomolecules på nøytrofile celleoverflaten. Disse interaksjonene, sammen med IL-8 binding til sine beslektede reseptorer, lette robust, integrinantistoff-mediert vedlegg og eventuell arrestasjon av nøytrofile på endotelceller overflaten ^7-10. Etter arrestasjonen, kan nøytrofile migrere ut av blodkar til de spesifikke områder av smitte til direkte eliminere patogener, generere nøytrofile ekstracellulære feller for å hindre spredning av patogener, fremme sårheling og utgi flere faktorer som rekrutterer andre leukocytter som monocytter, makrofager og dendrittiske celler ^11-17.

Beskrevet i denne rapporten er en in vitro metode for å kvantifisere nøytrofile tilslutning til microVascular egenkapitalbevis etter aktivering av verten inflammatorisk megler TNF-alfa. Denne analysen er laget for å vurdere aktivering av egenkapitalbevis, og ikke nøytrofile. Primære humane neutrofiler er først isolert ved hjelp av densitetsgradient separasjon, og blir deretter merket med Calcein acetoksymetyl (AM). Esterasene innenfor levende celler hydrolyze Calcein AM til den svært fluorescerende Calcein molekyl med en eksitasjon av 492-495 nm og utslipp av 513-516 nm ^18. De fluorescently-merket nøytrofile blir deretter inkubert med EF monolagene, og ikke-heftende nøytrofile senere blir fjernet. Fluorescensen av de gjenværende, bundne nøytrofiler blir så målt ved hjelp av et fluorescens-spektrofotometer, og beregnes som en prosent av total neutrofil fluorescens inndata per brønn. Denne metode har den ytterligere fordel at de bundne Calcein-merkede nøytrofiler som brukes i spektrofotometri direkte kan visualiseres ved hjelp av fluorescens-mikroskopi for å gi en mer kvalitativ lest ut av EC acaktiverings. Siden denne analysen er utført under statiske forhold, vil bare de aller første hendelser som oppstår i nøytrofile vedheft kaskade bli vurdert. Dette bekreftes i denne rapporten bruker E-selektinantistoffer blokkerende antistoffer for å vise at nøytrofile tilslutning til TNF-alfa-behandlet menneskelig lunge microvascular EC (HMVEC-Lung) monolagene er drastisk redusert når samspillet med E-selectin blir forstyrret.

I tillegg til TNF-alfa, har vi med hell brukt denne analysen for å fastslå omfanget av menneskelig umbilical vein EC (HUVEC) aktivering av Toll-like receptor 1/2 agonister peptidoglycan-assosiert lipoprotein (PAL), murein lipoprotein (MLP) og Pam3Cys og HMVEC-Lung aktivering av Pam3Cys ^19,20. I tillegg har vi med hell brukt denne analysen med kinase hemmere og etter RNAi-mediert knockdown av overflaten og cytoplasmatiske proteiner i HMVEC-Lung, som tyder på at denne metodikken er kompatibel med en rekke biokjemiske og screening-analyser ^20. Oppsummert gir denne analysen en lett å bruke, reproduserbar, mer funksjonell måte å få tilgang til omfanget av EC aktivering av inflammatoriske mediatorer in vitro.

Protocol

En. Platekledning og vedlikehold av mikrovaskulær endotelceller

1. Tine og vokse din mikrovaskulære endotelceller i henhold til produsentene følger instruksjonene. I denne protokollen, ble cellene dyrket i EGM-2 medium MV (Lonza), og det anbefales at alle eksperimenter utføres i løpet av to uker etter opptining for å redusere mulig variasjon på grunn av passasje nummer. Våre eksperimenter med HMVEC-Lung utføres mellom passasjer 4-9.
2. Dag 1: Når cellene nå 80-90% confluency, trypsinize og resuspender på 120.000 celler per ml. Plate 36 000 celler (0,3 ml) ved hver brønn inn i 48-brønn, polystyren vevskultur plate (e). Omfatte brønner HMVEC som ikke vil bli inkubert med neutrofiler for å oppnå en bakgrunnsfluorescens lesing. Med mindre du bruker 48-brønners plater spesielt utviklet for fluorescens analyser, vekslende rader eller kolonner vil minimere noen lys forurensning fra nærliggende brønner. MERK: Wells kan være pre-belagt med poly-lysine, kollagen eller fibronectin.
3. Dag 2: Legg friske media.
4. Dag 3: Ved fasekontrast mikroskopi, bekrefte at cellene er friske (dvs. «Cobblestone» utseende og lite celleavfall), og de ​​er 100% sammenflytende (figur 1). Hvis cellene ikke er 100% konfluent, endre media hver dag før de er klare.
5. Når HMVEC monolag er klar for behandling, vaskes cellene én gang med Hanks balanserte saltløsning (HBSS) og tilsett 0,3 ml friskt EGM-2 mV media eller medier inneholdende inflammatorisk agonist til de egnede brønner. I denne protokollen HMVEC-Lung ble behandlet med TNF-alfa [100 ng / ml] (PeproTech, New Jersey) i 3 timer siden dette er en godt beskrevet aktivator av egenkapitalbevis ^21. MERK: Det anbefales at du tid eksperimentet slik at aktiverte HMVEC celler (trinn 4.1) og Calcein AM merket nøytrofile (trinn 3,5) er klare til bruk på samme tid. Det tar oss ca 2,5 time å isolere og merke neutrophils.

2. Nøytrofile Isolation hjelp Polymorphprep

1. Isolere neutrofiler som beskrevet tidligere ^22, eller med en ferdig tetthetsgradient løsning for å isolere polymorfonukleære granulocytter fra fullblod. Ansette Polymorphprep følge protokollen ved Nuzzi, et al. 2007 resultater i avkastning på ca 2-3 x 10 ⁶ nøytrofile per ml fullblod ^23. MERK: For å unngå overdreven erytrocytt lysis, en dekstran sedimentering å fjerne røde blodlegemer kan utføres før tettshetsgradient sentrifugering ^24.
2. Ta med Polymorphprep tettshetsgradient løsning på RT.
3. Samle 30 ml helblod fra en frisk frivillig menneske i nærvær av en anti-koagulant som heparin, citrat eller EDTA. Blodet bør brukes i løpet av 2 timer, og holdt mellom 18-22 ° C.
4. Lag 5 ml helblod over 5 ml av tetthetsgradient-løsning i et 15 ml konisk rør (
5. Sentrifuger ved 450 xg i 30 min ved 18-22 ° C. Kontroller for sakte hastighet opp og ned i sentrifugen (dvs. slå av sentrifugen brems), og balansere rørene godt for å hindre vibrasjoner for å bidra til å redusere aktiveringen av nøytrofiler og forhindre sammenblanding av lagene. Lengre sentrifugeringstider ganger eller høyere sentrifugalkraft vil resultere i den nedre leukocytt-sjikt, som inneholder nøytrofile, å migrere videre nedover mot de pelleterte røde blodlegemer.
6. Aspirer plasma og øvre leukocytt-båndet inneholdende PBMC for å hindre forurensning av laget som inneholder nøytrofile (Figur 2B).
7. Bruk en 1-2 ml serologisk pipette for å ta ut den nedre leukocytter laget som inneholder nøytrofile. Kombiner de nøytrofile sjikt inn i 30 ml PBS (uten Ca ^{2 +} og ^{Mg2 +)} i en 50 mlkonisk tube.
8. Bringe volumet opp til 50 ml med PBS (uten Ca ^{2 +} og ^{Mg2 +)} og sentrifuger ved 450 xg i 10 min ved 18-22 ° C.

Merk: Trinn 2,9 og 2,10 er valgfritt, men sterkt anbefalt.

9. Aspirer supernatanten. Resuspender neutrofilene i 8 ml sterilt vann i 30 sek for å lysere røde blodceller, straks legge cellesuspensjonen til 2 ml av 5x PBS (uten Ca ^{2 +} og ^{Mg2 +)} og blandes forsiktig for hånd. IKKE inkuberes cellene i vann i mer enn 30 sek siden signifikant neutrofil død, kan forekomme.
10. Sentrifuger ved 250 xg i 5 min ved 18-22 ° C.
11. Vask cellene en gang med 10 ml PBS (uten Ca ^{2 +} og ^{Mg2 +)} og sentrifugeres på nytt ved 250 xg i 5 min ved 18-22 ° C.
12. Resuspender neutrofilene i 10 ml RPMI-1640-medium (uten fenolrødt) og telle de levende celler ved hjelp av trypan blue fargestoffeksklusjon metoden. Unngå lengre perioder med celletetthet større enn 5 x 10 ^6. per ml siden dette kan resultere i aktivering av neutrofiler.

3. Nøytrofile Merking med Calcein AM

1. 6 x 10 ⁵ neutrofiler benyttes per brønn av en 48-brønns plate.
2. Etter telling, overføre resuspenderte celler til en 50 ml konisk tube og fortynne nøytrofile til 2-4 x 10 ⁶ celler per ml med fenol rød-fri RPMI-1640.
3. Legg Calcein AM stamløsning til tre mikrometer (dvs. 2,98 mL av Calcein AM lager (1 mg / ml) per ml av media) og bland godt ved forsiktig knipse røret. Større enn 5 uM Calcein AM vil resultere i lekkasje fra neutrofilene. Merk: Ikke-fluorescerende Calcein AM spaltes inne i cellene av endogene esteraser til å produsere den sterkt fluorescerende molekyl Calcein (dvs. døde celler vil ikke fluorescerer).
4. Dekke røret med aluminiumsfolie og ruge feller 30 min ved 37 ° C i mørke. Merk: lengre inkubasjonstid ganger kan resultere i mer Calcein frigis fra neutrofilene i løpet av vedheft-analysen.
5. Sentrifuger ved 450 xg i 5 minutter ved 18-22 ° C, og vaske neutrofilene 2x med 10 ml RPMI-1640-medium (uten fenolrødt, forvarmes til 37 ° C). Etter resuspendering av cellene for den andre vask, først passere neutrofilene skjønt en 40 pm sterilt filter for å fjerne klumper, og deretter sentrifugeres en gang til ved 450 xg i 5 min ved 18-22 ° C.
6. Resuspender neutrofilene i RPMI 1640 (uten fenolrødt, forvarmet til 37 ° C) ved 2 x 10 ⁶ neutrofiler per ml.

4. Nøytrofile Bindingsforsøk

1. Vask HMVEC monolag 3x med 0,5 ml filter-sterilisert (0,22 mikrometer) RPMI 1640 (uten fenolrødt) inneholdende 3% BSA per brønn.
2. Aspirer media og legge til 6 x 10 ⁵ Calcein-merket nøytrofile (0,3 ml celle suspensioN), eller 0,3 ml RPMI 1640 (uten fenolrødt) uten nøytrofiler til de egnede brønner av 48-brønns plate. Merk: Dette er lik 8 x 10 ⁵ nøytrofiler pr ^cm2.
3. Inkuber i 20 min i en 37 ° C, 5% CO ₂ inkubator.
4. Totalt Neutrophil Fluorescens (forvask): måle fluorescensintensiteten av hver brønn med en eksitasjonsbølgelengde på 485 nm og en emisjonsbølgelengde på 520 nm (fluorescein filter set) i en FLUOstar, eller tilsvarende, spektrofotometer. Utføre dette trinnet like før inkubering endepunkt Merk: I denne protokollen, ble Calcein eksitasjon og detektering av utsendt lys utføres fra toppen av de udekkede brønner, men kan begge også utføres fra bunnen av brønnene..
5. Vask brønnene som inneholdt monolagene HMVEC og nøytrofile 5x med 0,5 ml per brønn av PBS (w / Ca ^{2 +} og ^{Mg2 +).} Ta ut papiret og vaskerved å snu platen, og klapper forsiktig på tørkepapir for å fjerne gjenværende væske.
6. Legg tilbake 0,3 ml RPMI 1640 (uten fenolrødt) per brønn.
7. Adherent Neutrophil Fluorescens (POST vask): Mål fluorescens intensiteten i hver brønn som i trinn 4.4.
8. Bestem prosent etterlevelse og relativ tilslutning per brønn:

Merk: På dette stadiet, kan bilder av Calcein-merket nøytrofile oppnås ved hjelp av en fluorescens stand mikroskop utstyrt med standard fluorescein filtre. Bildene i figur 4 ble innhentet på en Olympus IX51 invertert mikroskop utstyrt med en Retiga 2000R kamera (Q Imaging) ved hjelp av Q-Capture Pro7 programvare (Q Imaging).

Representative Results

For å oppnå pålitelige, reproduserbare resultater ved hjelp av en neutrofil bindingsanalyse, er det viktig at helse og sammenflyting av de mikrovaskulære endotelceller er optimal på dagen for analysen, som illustrert med HMVEC-Lung i figur 1.. I tillegg er det viktig at lav passasje antall microvascular egenkapitalbevis brukes (dvs. mindre enn ni passasjer), og følgelig anbefaler vi utfører alle eksperimenter innen to uker etter tining. Helsen til neutrofiler er også av største betydning, spesielt siden Calcein AM vil ikke bli metabolisert til den fluorescerende Calcein molekyl hvis cellene er omfattet på noen måte. Vi bruker trypan blå eksklusjon metode, og ikke fortsette analysen dersom en signifikant andel av cellene er døde (dvs. farget).

Det er flere måter å isolere nøytrofile, inkludert tettshetsgradient og antigen-baserte kolonne separasjonsmetoder, og noen avdisse bør være nok for denne prosedyren. Vi valgte å bruke Polymorphprep ferdige tettshetsgradient løsning fra Axis-Shield. Som kan sees i figur 2, de er til stede i PBMC det øverste laget, mens de neutrofile innenfor det nedre lag etter sentrifugering. Den PBMC sjikt suges inn for å unngå kontaminering av granulocyttene når deres fjerning. Det er viktig å merke seg at trinn 2.9, i hvilket vann tilsettes til å lysere eventuelle gjenværende røde blodceller, er valgfri. Imidlertid, mens den gjør det enkelt å fjerne alle kontaminerende erytrocytter, er det kritisk at neutrofilene ikke sitter i rent vann i mer enn 30 sek hvoretter betydelig død, kan forekomme.

Endelig er de nøytrofile celler inkubert med Calcein AM i 30 minutter, vasket og resuspendert i forvarmet (37 ° C) RPMI-1640 media (uten fenolrødt). Det er viktig å bruke medium uten fenolrødt, som kan interferere med lesingen fluorescens. Antallet neutrophils tilsatt brønnene er ganske vilkårlig, forutsatt at fluorescens avlesninger før og etter vask-er innenfor det lineære området for spektrofotometeret, og forskjellene mellom behandlingene som enten fremmer eller hindre neutrofil tilslutning kan være reproduserbart påvises (se nedenfor). Vi finner at fluorescens OD _520nm er innenfor det lineære område når 10.000 til 1.000.000 merkede nøytrofiler blir analysert (figur 3A). Interessant, finner vi også at prosent tilslutning øker etter hvert som flere nøytrofile legges til HMVEC-Lung monolagene behandlet med TNFa [100 ng / ml] i 3 timer (Figur 3B). Vi valgte å ruge på HMVEC-Lung og Calcein-merket nøytrofile sammen i 20 min, siden vi finner at andelen av vedheft ikke øker vesentlig etter dette tidspunkt (data ikke vist). Til opplysning, i denne test som benyttes vi standard, klar polystyren 48-brønners plater og funnet at nivået av fluorescens kryss-spissen avlesninger mellom than brønner ikke utgjøre mer enn 0,5% av den totale fluorescens inngang (data ikke vist). Likevel anbefaler vi å bruke 48-brønners plater med hensikt laget for fluorescens spektrofotometer målinger for mer sensitive eksperimenter, hvis tilgjengelig, eller i det minste, å utforme eksperimentet redusere kryss-over-målinger (se trinn 1.2).

For å demonstrere at antallet nøytrofiler tilsettes brønnene er ganske vilkårlig så lenge som antallet tilsettes, er innenfor det lineære området for spektrofotometeret, utførte vi en neutrofil adhesjon analysen med TNFa-behandlet HMVEC-Lung i fravær eller nærvær av p38 -MAPK inhibitor BIRB7906, ved hjelp av ulike innsatsfaktorer mengder nøytrofile (dvs. 40000 / brønn, 200000 / brønn eller 1000000 / brønn) ^25. p38 MAPK-har tidligere vært vist å være nødvendig for E-selektin ekspresjon i TNFa-behandlet human ECS og dens inhibering bør derfor redusere nøytrofil binding til TNF-alfa-aktivert HMVEC-Lung26. Faktisk, dette er hva vi observerer (Figur 3C). Selv om vi finner at prosent tilslutning øker etter hvert som flere nøytrofile er lagt til, og prosent etterlevelse kan variere mellom eksperimenter, på grunn av ulike faktorer som inter-donor variasjoner, kvaliteten på de nøytrofile granulocytter og tettheten av HMVEC ved samløpet, den relative etterlevelse mellom forholdene forblir relativt konstant i hver uavhengig eksperiment uavhengig av antall nøytrofile lagt (figur 3C og data ikke vist). Disse dataene også eksempler på hvorfor det er bedre å vise vedheft data som i forhold til en positiv kontroll for inter-eksperimentell konsistens.

For å fullt illustrere hvordan denne analysen fungerer, utførte vi en nøytrofile vedheft analysen med TNF-alfa-behandlede HMVEC-Lung pre-inkubert med enten kontroll antistoff eller en e-selectin blokkerende antistoff. E-selectin er uttrykt på EC overflaten etter behandling med TNFa og fanger neutrophils fra blodkar via elektrostatiske interaksjoner med glycomolecules stede på nøytrofile overflaten ^1,27. Som vist numerisk i figur 4A, grafisk på figur 4B og visuelt i figur 4C, den TNFa-behandlet HMVEC-Lung pre-inkubert med E-selectin antistoff bundet ~ 75% mindre enn neutrofiler den TNFa-behandlet HMVEC-Lung-inkubert med kontroll IgG. Dette tyder på E-selectin spiller en viktig rolle i tethering nøytrofile til HMVEC-Lung i vår statisk feste analysen.

Figur 1. Eksempel på sunne, konfluerende HMVEC-Lung monolagene. Legg merke til "brostein" utseende og total confluency av monolayers. Bilder ble tatt på 4X og 10X forstørrelse på en Fisher Scientific Micromaster invertert digitalt mikroskop.
Figur 2. Fullblod og Polymorphprep lagdelte før sentrifugering, (A) og separert etter sentrifugering (B). Merk at etter sentrifugering, de PBMC danne et distinkt øvre båndet, mens de polymorfonukleære granulocytter (neutrofiler) danner en distinkt nedre bånd.

Figur 3. Forholdet mellom nøytrofile nummer og fluorescens OD _520nm er lineær, den prosent vedheft av nøytrofile til TNF-alfa-behandlede HMVEC-Lung øker etter hvert som flere nøytrofile er lagt, p38-MAPK fremmer nøytrofile tilslutning til TNF-alfa-aktiverte HMVEC-Lung monolagene (A) Graph. skildrer linear forholdet mellom fluorescens OD _520nm og nøytrofile tall over to størrelsesordener. En R2-verdi på 0,996 viser et lineært forhold mellom antallet nøytrofile og fluorescens OD _520nm når 10.000 til 1.000.000 nøytrofiler blir analysert (B). Grafisk fremstilling av prosent tilslutning når ulike antall Calcein-merkede nøytrofiler ble tilsatt til ubehandlet eller TNFa-behandlet ( 100 ng / ml;. 3 hr) HMVEC-Lung monolayers i 48-brønners plater (C) HMVEC-Lung monolagene ble pre-inkubert med p38-MAPK inhibitor BIRB796 (10 mm) (Axon medchem) eller DMSO (kontroll) for 1 time før TNFa (100 ng / ml) behandling i 3 timer, mens i den kontinuerlige tilstedeværelsen av BIRB796 (10 mM). Den relative etterlevelse ble beregnet som i trinn 4.8. Data ble uttrykt som gjennomsnitt ± SD. GraphPad Prism uparet t-test ble anvendt for statistisk analyse (n = 3) (TNFa-behandlet vs TNFa-behandlet pluss BIRB796). p-verdi ** <0,01; *** &# 60;. 0.001 Klikk her for å se større figur .

Figur 4. E-selectin fremmer etterlevelse av nøytrofile til TNFa-behandlet HMVEC-Lung. HMVEC-Lung ble behandlet med TNF-alfa [100 ng / ml] i 3 timer. Etter vask av HMVEC-Lung med RPMI 1640 inneholdende 3% BSA (trinn 4.1), enten sau IgG [50 mikrogram / ml] (5-001-A, R & D Systems) eller E-selectin polyclonal antistoff (pAb) [50 mg / ml] (AF724, R & D Systems) ble lagt til de aktuelle brønnene for 20 min. De HMVEC-Lung monolag ble så vasket en gang med RPMI-1640-medium før 6 x 10 ⁵ nøytrofiler ble tilsatt per brønn i ytterligere 20 min. (A) De beregninger for å bestemme prosent og relativ tilslutning er vist. Calceinlys utslipp måles til OD _{520 nm.} Bakgrunn OD _520nm gjennomsnitt er avledet fra HMVEC-Lung i fravær av TNFa behandling og nøytrofiler (B). Grafisk representasjon av relativ prosent vedheftingsevne Calcein-merkede nøytrofiler til ubehandlede eller TNFa-behandlet HMVEC-Lung monolag etter pre-inkubering med enten kontroll IgG eller E-selectin blokkering pAb. Data ble uttrykt som gjennomsnitt ± SD. GraphPad Prism uparet t-test ble brukt for statistisk analyse (n = 3). Beregnet p-verdien var <0,001. (C) Bilder av Calcein-merket nøytrofile bundet til ubehandlede og TNF-alfa-behandlede HMVEC-Lung monolagene pre-inkubert med enten kontroll IgG eller E-selectin pAb. Et eksempel godt med 6 x 10 ⁵ nøytrofile før vask med PBS vises (PRE vask). Gjennomskinnelig lys mikroskopi bilder vises i høyre kolonne, mens fluorescens bilder av samme felt av referansen, ved hjelp av en fluorescein filtersatt, vises i venstre kolonne. Bilder ble tatt på 10X forstørrelse på en Olympus IX51 invertert mikroskop utstyrt med en Retiga 2000R kamera (Q Imaging). PRE vask = total nøytrofile fluorescens OD _520nm (trinn 4.4); POST vask = tilhenger nøytrofile fluorescens OD _520nm (trinn 4.7); PMN - polymorfnukleære granulocytter, avg - gjennomsnitt; IgG - sau IgG kontroll; E-sel/α-E-selectin - E-selectin blokkerer pAb. Klikk her for å se større figur .

Discussion

De mest kritiske trinn for en vellykket neutrofil / mikrovaskulær endotelcelle-adhesjon analysen er: 1) Anvendelse av lav passasje nummer (<9), sunne endotelceller, 2) opprettholdelse av de isolerte nøytrofiler ved en lav tetthet (dvs. <5 x 10 celler ⁶ / ml) og bruker dem innen to timer med isolasjon, og 3) Smakfullt vask av Calcein AM-merket nøytrofile og bruk av Calcein AM-merket nøytrofile i tide for å minimere EC forurensning og tap av Calcein fra de nøytrofile, henholdsvis .

Vi legger til 8 x 10 ⁵ nøytrofile per cm ² av vev kultur godt areal (dvs. 600.000 nøytrofile per brønn av en 48-brønn plate). Vi finner at en inngang på 600.000 nøytrofile er innenfor lineære området av spektrofotometer vår, og pålitelig gjengir data når relative adherences måles. Det er imidlertid en svært lik nedgang i nøytrofile binding observert ip38 MAPK-inhiberingsanalyse (figur 3C) når 40.000, 200.000 eller 1.000.000 nøytrofiler blir tilsatt per brønn, noe som tyder på at mindre enn 600.000 nøytrofiler kan brukes.

Protokollen er beskrevet her vurderer bare omfanget av endotelial aktivering siden nøytrofile selv er ikke pre-aktivert, eller behandles på noen måte, som er selvfølgelig et alternativ om din analysen krever det. Vi viser at uttrykket av E-selectin på TNFa-behandlet HMVEC-Lung er viktig for feste av nøytrofile i denne analysen, i samsvar med tidligere observasjoner ^27. Den elektrostatiske binding av E-selectin til glycomolecules tilstede på nøytrofile overflaten er relativt svak, men under strømningsforhold, er disse interaksjonene tenkt å indusere høy affinitet integrin-medierte vedlegg mellom nøytrofile og egenkapitalbevis ^1,7-10. Derfor kan denne analysen være mer en indikasjon på de første trinnene i betennelse som are nødvendig å fange nøytrofile granulocytter fra blodkar. Likevel har vi bekreftet at våre resultater oppnådd med TNFa i denne rapport var meget like, om ikke identiske, til de oppnådd ved anvendelse av et flyt-modul (data ikke vist), som indikerer resultatene av dette assay er statisk fysiologisk relevant og antyder at denne analysen er spesielt anvendelig for forskere som ikke har adgang til et strømningssystem.

Variasjoner av den beskrevne assay, ved hjelp av Calcein eksempel detektering fluorofor, ble først beskrevet i 1993 ^28,29. Viktigere, disse innledende rapportene fant at Calcein ikke påvirke celle levedyktighet og hadde minst effekt på celle funksjon i vedheft analyser i forhold til andre fluorescein-deriverte fargestoffer ^29,30. Det ble også rapportert at celle nummer er lineær med hensyn til fluorescerende intensitet, i samsvar med det vi observerer (figur 3A) ^28. Første rapportene også fremhevet at enstor fordel ved fluorometriske analyser, er at de ikke krever radiomerking (for eksempel ¹¹¹ På eller ⁵¹ Cr) av de rensede leukocytter ^31-33. Fordelene og konsistenser ved å bruke Calcein AM-merkede celler i løpet radiomerkede celler har blitt grundig diskutert tidligere ^28,29,34. Selv om vi bruker Calcein AM å merke nøytrofile i våre analyser, flere andre celle permeant fargestoffer som er esterase substrater er tilgjengelig. For eksempel selger Life Technologies CellTrace Calcein rød-oransje (C34852), Calcein fiolett (C34858) og Calcein blå (C34853) som opphisse / utslipp på ulike bølgelengder. De ulike fargestoffer har hver sine fordeler og ulemper. For eksempel har Calcein AM rød-oransje fargestoff noen iboende fluorescens før hydrolyse ^18..

Vi bruker denne metoden for å studere inflammatorisk aktivering av endotel som reaksjon på bakterie-og endogene faktorer (slik som TNFa), og thoss bruke HMVECs hentet fra kadavre, som kan utvides i tilstrekkelig mengde for å gjøre analysen med forsvarlig kontroll og nok gjentak å utføre statistiske analyser. Muligens vil dette assay også kan brukes som et verktøy for å studere endotelial-baserte sykdommer som involverer leukocytt binding til mikrovaskulær endotel. Eksempler på lidelser som kan bli studert ved hjelp HMVECs fra pasienter inkluderer kronisk obstruktiv lungesykdom (KOLS), sepsis, inflammatorisk tarmsykdom, vaskulitter, slik som anti-neutrofil cytoplasmatisk autoantistoff (ANCA)-assosierte vaskulitter og hjerne vaskulære misdannelser ^35-40 . For eksempel kan HMVECs hentes fra mennesker med vaskulitter eller sepsis post-mortem, eller potensielt fra pasienter med endotelceller baserte sykdom prosesser som har gjennomgått en biopsi eller kirurgisk fjerning av et organ, og deres binding til nøytrofile vurderes under forskjellige forhold. Dette krever imidlertid at analysen tilstrekkeligmengder HMVECs å danne konfluente monolag, og dermed HMVECs og anvendes etter flere passeringer. Denne prosessen med utvidelsen kan føre til fenotypiske endringer i egenkapitalbevis, som trenger å bli tatt hensyn til i utformingen av studier med primær egenkapitalbevis fra pasienter med EF-baserte sykdommer. Likevel tillater allsidighet av denne analysen er det for å tilpasses mange andre adherente leukocytter og celletyper. Faktisk har denne analysen, eller varianter av det, blitt brukt med andre endotelceller typer, og primære celler og cellelinjer som monocytter, THP-1, Jurkat, HL-60 og U937 ^28,31,41. Denne analysen har vist seg å være rask, enkel å utføre, reproduserbar og svært sensitive, og er derfor et svært nyttig verktøy for å oppdage endotelceller aktivering av inflammatoriske mediatorer.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
HMVEC-Lung	Lonza	CC-2527
EGM-2 MV	Lonza	CC-3202
HBSS	Life Technologies	14175-095	Can be substituted with any vendor
48-well Tissue Culture Plates	BD Falcon	353078
PBS (without phenol red)	UCSF Cell Culture Facility	CCFAL001	Can be substituted with any vendor
D-PBS (without Ca2+ and Mg2+ and phenol red)	UCSF Cell Culture Facility	CCFAL003	Can be substituted with any vendor
RPMI-1640 (without phenol red)	Life Technologies	11835-030
Polymorphprep	Axis-Shield	1114683
calcein AM	Life Technologies	C3099	(0.995 mM) stock soln
Trypan Blue Solution	Sigma-Aldrich	T8154
40 μM filters	VWR	21008-949	Can be substituted with any vendor
FLUOstar OPTIMA Spectrophotometer	BMG LABTECH	-