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Chemistry

Medición cinética de estado estable, Pre-estado de equilibrio, y un solo volumen de negocios de ADN glicosilasa Actividad

Published: August 19, 2013 doi: 10.3791/50695
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Laboratory of Structural Biology, NIEHS, National Institutes of Health

Summary

Tiempo de cursos para la actividad glicosilasa de 8-oxoguanina ADN glicosilasa son bifásicos exhibiendo una explosión de la formación de producto y una fase de estado estacionario lineal. La utilización de técnicas de flujo de enfriamiento rápido, la ráfaga y las tasas de estado estable se pueden medir, que corresponden a la escisión de 8-oxoguanina y la liberación de la glicosilasa a partir del ADN del producto, respectivamente.

Abstract

Humano 8-oxoguanina ADN glicosilasa (OGG1) escinde el mutagénico oxidativo lesión del ADN 8-oxo-7 ,8-dihydroguanine (8-oxo G) a partir de ADN. La caracterización cinética de OGG1 se llevó a cabo para medir las tasas de escisión 8-oxo G y la versión del producto. Cuando la concentración es más baja que OGG1 sustrato de ADN, la evolución temporal de la formación de producto son bifásicos; una fase exponencial rápida (es decir ráfaga) de formación de producto es seguida por una fase de estado estacionario lineal. El estallido inicial de la formación de producto corresponde a la concentración de enzima debidamente enganchado sobre el sustrato, y la amplitud de la ráfaga depende de la concentración de enzima. La constante de la ráfaga de velocidad de primer orden corresponde a la frecuencia intrínseca de la escisión 8-oxo G y la tasa de estado estacionario más lenta mide la tasa de liberación del producto (producto de ADN de disociación constante de velocidad, k fuera). A continuación, se describen los enfoques de estado estacionario, pre-estado de equilibrio, y de un solo volumen para aislar y medir sppasos ecific durante OGG1 ciclo catalítico. Un oligonucleótido marcado con fluorescente lesión que contiene y OGG1 purificados se utilizan para facilitar mediciones cinéticas exactas. Dado que las concentraciones bajas de enzimas se utilizan para realizar mediciones en estado estacionario, la mezcla manual de los reactivos y el temple de la reacción se puede realizar para determinar la tasa de estado estacionario (k fuera). Además, la extrapolación de la tasa de estado estacionario a un punto en el eje de ordenadas en el tiempo cero indica que un estallido de formación de producto se produjo durante el primer volumen de negocios (es decir, intersección y es positivo). La constante de la fase de estallido exponencial de velocidad de primer orden se puede medir usando una técnica de mezcla y enfriamiento rápido que examina la cantidad de producto formado a intervalos de tiempo cortos (<1 seg) antes de la fase de estado estacionario y corresponde a la tasa de 8 -oxo G escisión (es decir, química). El paso química también se puede medir usando un enfoque de un solo volumen de negocios donde el ciclismo es catalíticaimpedido por el ADN sustrato saturando con la enzima (E> S). Estos enfoques pueden medir constantes de velocidad elementales que influyen en la eficacia de la eliminación de una lesión del ADN.

Introduction

Un ambiente aeróbico acelera la inestabilidad genómica. Una importante lesión del ADN promutagenic resultante de estrés oxidativo es 7,8-dihidro-8-oxoguanina (8-oxo G). Esto es debido al potencial de codificación ambigua de 8-oxo G. Human 8-oxoguanine DNA glicosilasa (OGG1) es responsable de iniciar la base de reparación por escisión de 8-oxo G. La actividad glicosilasa de OGG1 extirpa la base 8-oxo G resulta en ADN producto con un sitio apurinic (AP-site). Una actividad liasa débil OGG1 puede incidir la AP-site en algunos casos.

La caracterización cinética de ADN glycosylases general encuentra que exhiben cursos de tiempo bifásicos. Después de una fase rápida inicial de la formación de producto (es decir ráfaga), una fase de estado estacionario lineal se observó 1-3. Este comportamiento es indicativo de un paso después de la química (es decir, el cambio conformacional o liberación del producto) siendo limitante de la velocidad durante la parte lineal del curso del tiempo, mientras que la fresaª fase, conocida como la fase transitoria a menudo, corresponde a la formación de producto en el sitio activo de la enzima durante el primer ciclo de la reacción. Cuando liberación del producto es limitante de la velocidad durante la fase de estado estacionario, las mediciones de actividad proporcionan una medida cualitativa del producto afinidad de unión de ADN, pero no proporcionan información cinética relativa a eventos en el sitio activo de la enzima (es decir, química). En consecuencia, se necesitan métodos para aislar y medir la fase de explosión pre-estado estacionario exponencial para investigar los acontecimientos durante la primera rotación enzimática en el sitio activo de la enzima 4.

Hay tres métodos cinéticos estándar para caracterizar el comportamiento catalítico de OGG1, (1) en estado estacionario, (2) pre-estado de equilibrio, y (3) un solo volumen. Estos enfoques se diferencian entre sí por la concentración de enzima en la mezcla de reacción y la relación de enzima a sustrato utilizado en cada enfoque. En un enfoque típico de estado estacionario,a veces referido como múltiples cinética de volumen de negocios, bajas concentraciones de enzima se utilizan para seguir la formación de producto. La concentración de sustrato excede en gran medida la concentración de la enzima de manera que múltiples pérdidas de balón enzimáticas no afectan significativamente a la concentración de sustrato. En esta situación, los cursos de tiempo debe ser lineal y es a menudo difícil de discernir si un estallido se produjo durante la primera rotación debido a la baja concentración de la enzima utilizada en este enfoque; tenga en cuenta que la amplitud de ráfaga es equivalente a la concentración de la enzima. Esto se puede superar mediante el uso de una mayor concentración de la enzima y la extrapolación de la evolución en el tiempo lineal a tiempo cero para detectar si la primera rotación enzimática ocurrió rápidamente. La intersección con el eje de ordenadas (eje y) debe ser proporcional a la concentración de enzima y proporciona una medida de la enzima participa activamente con el sustrato. Aunque este enfoque puede, en principio, proporcionar evidencia de la existencia de una fase de estallido, un DIFSe requiere enfoque rente para medir la cinética de la fase de estallido. En muchos casos, la fase de estallido es demasiado rápido para medir por técnicas de mezcla y enfriamiento rápido manuales. En esta situación, antes de la cinética de estado estacionario y de un solo volumen de negocios (es decir, cinética transitoria) se acerca a menudo requieren un instrumento rápido de mezcla y enfriamiento rápido para seguir los puntos de tiempo tempranos de una reacción 5. En un enfoque de pre-estado estacionario se utilizan altas concentraciones de enzima de manera que se forma una cantidad significativa de producto durante la primera rotación. Desde múltiples pérdidas de balón son seguidos para observar bicicleta catalítica (es decir, la fase lineal que sigue a la ráfaga), la concentración de sustrato es mayor que la concentración de la enzima ([enzima] <[sustrato]). Para aislar los eventos en el sitio activo de la enzima sin bicicleta catalítica, se utilizan condiciones de un solo volumen de negocios. En este caso, el sustrato está saturado con la enzima (E >> S) de modo que todo el sustrato participarán in el volumen de negocios único "y normalmente muestran una evolución en el tiempo de un solo exponencial.

Como se ha señalado anteriormente para las enzimas que exhiben una fase de estallido, liberación del producto (k fuera) a menudo limita la tasa de la fase de estado estacionario de la evolución en el tiempo. La tasa de liberación del producto (v ss, conc. / Tiempo) se puede determinar a partir de la pendiente de la fase de estado estacionario lineal. Es necesaria la concentración de enzima activa (E) para convertir la tasa de liberación del producto a una constante de velocidad intrínseca donde k off = v ss / [E]. Es importante destacar que la concentración de la enzima activa es típicamente más bajo que la concentración medida de proteína debido a las impurezas, enzima inactiva, enzima no productiva obligado a sustrato, y el método utilizado para determinar la concentración de proteína. La concentración de enzima activa puede determinarse a partir de la amplitud de la ráfaga cuando la liberación del producto es lento. Por lo tanto, la extrapolación de un curso de tiempo de estado estacionario atiempo cero proporciona una estimación de la enzima activa necesaria para calcular k fuera (liberación de producto) de la tasa de estado estacionario observada.

Para medir la cinética de la explosión, un enfoque pre-estado de equilibrio, es necesario seguir la formación de producto durante la primera rotación que se produce antes de la fase de estado estacionario lineal. La cinética de ráfaga sigue la formación de enzima-producto intermedio. Una vez que la reacción se inicia por la enzima de mezclado con el sustrato, la cantidad de la enzima-producto aumenta rápidamente hasta que la reacción alcanza una fase de estado estacionario. Si la catálisis es mucho más rápida que la versión del producto, la amplitud de la ráfaga es igual a enzima participa activamente y el enfoque exponencial observada al equilibrio (k obs) corresponde a la tasa de conversión química del sustrato a producto, suponiendo que la velocidad inversa de química es insignificante.

En algunos casos CY catalíticaaferrarse interfiere con un análisis previo de estado estacionario, por ejemplo, cuando la magnitud de las tasas para la química y la liberación de productos no son significativamente diferentes. En este caso, el empleo de exceso de enzima con respecto al sustrato evita ciclo catalítico y el sustrato límites unido con la enzima a una sola rotación. En consecuencia, la primera etapa química de la reacción se puede aislar y determinar con precisión como la constante de velocidad de primer orden (k obs). Esta constante de velocidad debe ser similar a k obs determinado a partir del enfoque de pre-estado de equilibrio se ha descrito anteriormente.

Aquí se describe cómo estos enfoques cinéticos pueden ser utilizados para analizar la actividad glicosilasa de OGG1.

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Protocol

1. Preparación de la enzima y el sustrato de ADN

  1. Over-express OGG1 como una proteína de fusión GST en E. coli, utilizan la etiqueta de GST para la purificación, y luego retire la etiqueta de GST por escisión con HRV-3C proteasa (Figura 1) 6.
  2. Compre la síntesis química 5'-6-carboxifluoresceína (6-FAM) oligonucleótido marcado que contiene un único residuo de 8-oxo G y su cadena de oligonucleótido no marcado complementaria. Los oligonucleótidos 34-mer contienen una 8-oxo G en la posición 17 desde el extremo 5 '. Purificar estos oligonucleótidos mediante electroforesis en gel de poliacrilamida.
  3. Preparar sustrato de ADN de doble cadena que contiene 8-oxo G mediante la mezcla de 5'-6-FAM oligonucleótido marcado con su cadena complementaria a una relación molar de 1:1,2 en tampón de reasociación (10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 50 mM de NaCl, 1 mM de EDTA) en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Colocar el tubo en un flotador en agua hirviendo durante 5 min. Deje el tubo en su lugar y luego dejar que el agua se enfríe lentamente a rtemperatura oom (esto toma aproximadamente 2 horas).
  4. Realizar la preparación de muestras y el experimento en condiciones de baja o mínima de luz a fin de minimizar photobleaching de la etiqueta fluorescente.

2. Medición de golf Tiempo en estado estable y activo Titulación sitio de OGG1

2.1. Preparación de la muestra y el curso de tiempo de estado estacionario

  1. Preparar sustrato de ADN y OGG1 soluciones por separado en tampón de reacción (50 mM HEPES, pH 7,5, 20 mM KCl, 0,5 mM de EDTA, y 0,1% albúmina de suero bovino) en tubos de microcentrífuga de 1,5 ml en hielo. La concentración de ADN es 400 nM y la concentración aparente de OGG1 es 30, 60, 90, o 120 nM tal como se determina mediante un ensayo de proteínas de Bradford. Coloque los tubos de reacción en un conjunto de bloque de calor a 37 ° C. Enzima pre-incubar y soluciones de sustrato de ADN por separado a 37 ° C durante 1 min.
  2. Se inicia la reacción mediante la mezcla de volúmenes iguales de las soluciones de sustrato y OGG1 ADN mediante pipeteo. Después de mezclar estas solucionesciones 01:01 (v / v), las concentraciones finales son 200 nM de ADN y 15, 30, 45, o 60 nM OGG1, respectivamente. Retirar alícuotas (10 l) a intervalos de tiempo y enfriar rápidamente la reacción mediante la mezcla con 1 l de 1 M de NaOH. Como el control para los cursos de tiempo, 10 l de la mezcla de reacción sin enzima se mezcla con 1 l de 1 M de NaOH.
  3. Colocar las muestras de reacción en un bloque de 90 ° C de calor durante 5 min para escindir el producto resultante AP-sitio. Después de calentar, añadir 1 l de HCl 1 M para neutralizar cada muestra.
  4. Añadir un volumen igual (12 l) de tampón de carga de gel (95% formamida, 20 mM EDTA, 0,02% bromofenol y 0,02% xilenocianol) a cada muestra de reacción, y luego colocar la mezcla en un bloque térmico fijado en 95 ° C durante 2 min, a continuación, colocar inmediatamente el tubo en hielo.
  5. Cargar las muestras (5 l) en un gel desnaturalizante de poliacrilamida 15% que contiene urea 8 M en 89 mM de Tris-HCl, pH 8,8, ácido bórico 89 mM y EDTA 2 mM. El sustrato y los productos escindidos se separaron bien después decorrer el gel.

2.2. Las imágenes del gel de

  1. Escanear el gel usando un generador de imágenes que puede detectar el ADN marcado con fluorescencia y visualizar el sustrato y las bandas de productos.
  2. Cuantificar las bandas después de la proyección de imagen del gel. Tenga en cuenta que algunas división de fondo puede ser observada después del tratamiento del propio sustrato con NaOH (Figura 2A). Restar este fondo a partir de la cantidad medida de cada producto de reacción.

2.3. Análisis de los datos

  1. Trazar la cantidad de producto formado en cada tiempo de reacción (t) (Figura 2B). Analizar los datos en bruto utilizando la Ecuación 1 para determinar la amplitud de la ráfaga (un 0, el eje y) y la pendiente de la fase lineal de estado estacionario (V ss).

  1. Parcelael punto de intersección con respecto a la concentración de proteína total (es decir, concentración de la enzima aparente; Figura 2C), que proporciona una medida de la fracción activa de la enzima. Utilice un ajuste lineal con una ordenada cero para proporcionar el factor de corrección para la determinación de la fracción de enzima activa.
  2. Trazar la tasa de estado estacionario con respecto a la concentración de la enzima activa (Figura 2D), que proporciona la constante de velocidad de disociación del producto (es decir, la pendiente de la línea ajustada).

3. Medición de golf Tiempo Pre-estado estacionario

Como se muestra en la Figura 2, la formación de producto durante la fase de estallido es demasiado rápido para medir por mezcla manual y enfriamiento rápido. Por lo tanto, un instrumento de flujo de enfriamiento rápido puede proporcionar un poderoso método para medir reacciones rápidas que se producen en la escala de tiempo de un milisegundo (Figura 3) 5. El instrumento utiliza un motor de accionamiento controlado por ordenador para mezclar rápidamente unaND saciar reacciones después de tiempos de reacción especificados. Por ejemplo, utilizar un instrumento Quench-Flujo RQF-3 Rapid Kintek para medir la fase de estallido inicial y la subsiguiente fase de estado estacionario de la formación de producto catalizada por OGG1. Instrumentos de enfriamiento rápido de Flujo están disponibles de varios fabricantes.

3.1. Preparación de la muestra

Por separado, preparar sustrato de ADN y OGG1 soluciones en tubos de 1,5 ml, como se describe en 2-1. Las concentraciones de ADN y OGG1 activos son 400 nM y 80 nM, respectivamente. Esto da lugar a concentraciones finales de 200 nM de ADN y 40 nM OGG1 activo después de la mezcla 01:01 (v / v).

3.2. Preparación de un rápido instrumento de flujo de enfriamiento rápido

  1. Conecte un baño de agua circulante en el instrumento de flujo de enfriamiento rápido para el control de la temperatura (37 ° C).
  2. Ajuste los parámetros del instrumento y seleccione el circuito de reacción adecuada durante el tiempo deseado apunta según las instrucciones del fabricanteciones. Los bucles de reacción son de longitudes variables para proporcionar tiempos de reacción alternativos.
  3. Prepare el buffer de reacción y NaOH saciar soluciones en 10 ml Luer Lock jeringas desechables y adjuntar estas jeringas a los puertos de unidad y cargar los depósitos de unidad con el tampón de reacción (jeringas B) y NaOH 142 mM (jeringa Q) (válvulas de carga de jeringa en posición de carga) . Para eliminar las burbujas de aire de la jeringa, funcionan de la solución de ida y vuelta varias veces.
  4. Baje el motor paso a paso hasta que haga contacto con la parte superior de las jeringas (válvulas de carga de jeringa y válvulas de carga de muestra en posición de fuego).
  5. Lave los bucles de muestra, el circuito de reacción, y la línea de salida con agua y metanol. Seque las áreas enrojecidas por completo (válvulas en posición FLUSH).

3.3. Evolución en el tiempo de pre-estado de equilibrio

  1. Hacer un agujero en la parte superior de un tubo de 1,5 ml con tapa usando una aguja de calibre 16. Conecte un tubo en la línea de salida para recoger la reacción apagada.
  2. Ajuste el reactio deseadan tiempo (en segundos) con el teclado. El motor paso a paso se copia de seguridad para ajustar el volumen de bucle con el fin de mantener el volumen de enfriamiento constante. Posición émbolos de la jeringa B contra la plataforma del motor paso a paso mediante la adición de tampón con las jeringas desechables conectados a los puertos de unidad.
  3. Llene 1 ml Luer Lock jeringas desechables con sustrato de ADN y OGG1 soluciones, respectivamente (válvulas de muestra en la posición de carga). Coloque las jeringas con el sustrato de ADN y OGG1 soluciones a cada uno de los puertos de carga de muestra, y luego llenar los Loops de muestra con un sustrato de ADN y OGG1 soluciones, respectivamente (válvulas de carga de muestra en la posición de carga).
  4. Ajuste todas las válvulas de carga de jeringa y válvulas de carga de muestra en la posición de FUEGO. Se inicia la reacción por un golpe teclado (por ejemplo, pulsar la tecla "START", "G" o). Sustrato de ADN y OGG1 soluciones (18 l cada uno) se mezclan inmediatamente en el circuito de reacción.
  5. Esperar hasta que la reacción se apaga automáticamente en el tiempo de reacción deseado mediante la mezcla de 36 l de la rmezcla eaction con 86 l de NaOH 142 mM. Después de inactivar la reacción, la muestra se descarga desde la línea de salida.
  6. Ajuste las válvulas de carga de jeringa a la posición de la carga y las válvulas de carga de muestra en la posición de descarga. Lave los bucles de muestra, el circuito de reacción, y la línea de salida con agua y metanol y secar como se describe en 3.2. Repita el procedimiento anterior para cada momento.
  7. Realizar un experimento de control sin enzima para determinar una corrección de fondo, lo que puede hacerse manualmente o con el instrumento rápido enfriamiento rápido. Para realizar un control con el instrumento de rápido enfriamiento, llene el Loop de muestra de ADN con ADN sustrato pero mantener el lazo de la muestra para OGG1 vacía. Configurar el tiempo de reacción, realizar la mezcla y enfriamiento según se describe en 3.3.4-3.3.6.
  8. Lavar los bucles de muestra y del circuito de reacción con NaOH 2 M, HCl 2 M, agua y metanol y luego secar las líneas lavadas. Después de ajustar el motor paso a paso a la posición inicial, cambie las válvulas de carga de jeringa a la positio CARGAn y lavar los depósitos de accionamiento con agua.
  9. Tratar las muestras inactivadas de reacción con calor, y luego sustrato separado y ADN producto por 15% de desnaturalización de electroforesis en gel de poliacrilamida como se describe en 2.1.
  10. Visualizar y cuantificar las bandas en el gel como se describe en 2.2.

3.4. Análisis de los datos

Montar los cursos de tiempo de la formación de producto por análisis de regresión no lineal a una ecuación con un aumento de los términos exponenciales y lineal (Ecuación 2) que proporcionan la velocidad de primer orden constante (k obs), la amplitud de la ráfaga (A 0), y una velocidad lineal (v ss).

4. Lapso de tiempo de un solo volumen

  1. Preparar sustrato de ADN y OGG1 en tubos separados de 1,5 ml como se describe en 2-1. La concentraciónciones de ADN y OGG1 activos son 100 nM y 500 nM, respectivamente; esto produce una concentración final de 50 nM de ADN y 250 nM OGG1 después de la mezcla 01:01 (v / v).
  2. Preparar el rápido instrumento de flujo de enfriamiento rápido y preparar las muestras de la reacción como se describe en 3.2 y 3.3.
  3. Tratar las muestras de reacción se inactivó con calor y someterlas a 15% electroforesis en gel desnaturalizante de poliacrilamida al sustrato y de los productos por separado como se describe en 2.1.
  4. Visualizar y cuantificar las bandas en el gel como se describe en 2.2.
  5. Montar los cursos de tiempo de la formación de producto a un solo exponencial para determinar la constante de velocidad de primer orden (k obs) como se indica en la Ecuación 3.

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Representative Results

Análisis de la cinética de estado estable se realizó mediante el uso de 200 nM sustrato de ADN y cuatro diferentes concentraciones aparentes de OGG1 (15, 30, 45, y 60 nM) como se determinó por un ensayo de proteínas Bradford 2. Los cursos de tiempo de formación de producto se ajustaron a una ecuación lineal para determinar la ordenada en el origen, que fueron 2,2, 11, 15, y 26 nM, respectivamente, en relación a cada concentración de proteína (Figura 2B). Las intersecciones se representaron más con relación a la concentración de proteína real (Figura 2 C). La fracción de enzima activa se determinó que era 38% a partir de la pendiente de la línea en la Figura 2C. Para determinar la tasa de estado estacionario, v ss determinado a partir de los ajustes lineales de la Figura 2B se representaron gráficamente con respecto a las intersecciones (Figura 2D). La pendiente de la línea en la Figura 2D era 0,0028 seg -1, que es equivalente a la tasa constante de disociaciónpara el producto AP-sitio y incisa AP-site formado por ADN glicosilasa / actividades liasa.

Una evolución en el tiempo pre-estado de equilibrio fue seguido por el uso de sustrato de ADN 200 nM y 40 nM activos OGG1. Los cursos de tiempo de la formación de producto se pueden encajar en una ecuación con el aumento de los términos exponenciales y lineales. Como se muestra en la Figura 4, k obs yk off estaban decididos a ser de 0,75 s-1 y 0,0055 s -1, respectivamente 2. La amplitud de la fase de explosión (33 nM) fue ligeramente inferior a predecir a partir de la concentración de la OGG1 activa añadida (40 nM). Esto puede ser debido a la unión no específica de OGG1 al sustrato de ADN que reduce los números disponibles de moléculas de enzima.

En condiciones de un solo volumen de negocios, la reacción de escisión 8-oxo G se terminó en 6 segundos (Figura 5) 2. El curso temporal de la formación de producto podría estar en forma de un solo exponencialecuación y dado k obs de 0,74 s-1. Cabe destacar que la amplitud de la formación de producto era inferior a los esperados 50 nM añadieron sustrato de ADN. Esto podría haber sido debido en parte al fondo de la escisión del ADN mediante NaOH-tratamiento (Figura 2A) o la presencia de oligonucleótidos de sustrato no recocido en la mezcla de reacción.

Figura 1
Figura 1. La purificación de OGG1 humana de E. coli. El gen humano OGG1 se clonó en pGEX-6P-1 y sobreexpresa en células BL21 (DE3) células. El carril 1, las células no inducidas, carril 2; células inducidas por IPTG, carril 3; fracción de proteína soluble, carril 4; glutatión Sepharose 4B después de la incubación con la fracción de proteína soluble, carril 5; de flujo a través de fracción después de la incubación de glutatión Sepharose 4B con HRV 3C proteasa, carril 6; flujo a través de fracción después de la eliminación de contaminantes por la columna Mono Q. Se muestra una fotografía del gel teñido con azul de Coomassie.

La figura 2
Figura 2. La cinética de estado estable y sitio activo de valoración de purificado OGG1 2 OGG1 (15 nM, 30 nM; ○, □, 45 nM, ◊, o 60 nM, ×). Se incubó con 200 nM sustrato de ADN (5'-CTGCAGCTGATGCGCC X TACGGATCCCCGGGTAC -3 ', donde X es 8-oxo G empareja con C) a 37 ° C durante 1-30 min, como se indica. Estas concentraciones de la enzima representan las concentraciones de proteína aparentes sobre la base de un ensayo de proteínas de Bradford, se cuantificó a partir de una curva estándar de BSA. Una, desnaturalización geles de poliacrilamida que muestran sustratos separados (S) y los productos (P). OGG1 (30 nM) y 200 nM D NA sustrato se utilizó para la reacción. B, Tiempo de cursos de formación de producto. Los datos se ajustaron a una ecuación lineal para determinar la amplitud de la fase de explosión (interceptación) y una tasa aparente de liberación del producto (pendiente). C, Parcela de las intersecciones determinados a partir de los ajustes lineales en el panel B con respecto a la determinada por el ensayo de Bradford. La pendiente de la línea corresponde a la fracción de enzima activa. La barra de error indica el error en la amplitud inferirse de ajustes lineales a la formación de producto en el panel B. D, Parcela de las pendientes determinadas a partir de los ajustes lineales en el panel B con relación a la concentración de la enzima activa. La barra de error indica el error en la pendiente inferirse de ajustes lineales a la formación de producto en el panel B. La pendiente de la línea corresponde a la tasa de estado estacionario (k off), 0,0028 s -1.

jove_content "fo: keep-together.within-page =" always "> Figura 3
Figura 3. Descripción general del instrumento Rapid Quench-Flow.

Figura 4
La Figura 4. Cinética de Pre-estado de equilibrio de la escisión 8-oxo G por OGG1 2. OGG1 (40 nM enzima activa) se incubó con 200 nM sustrato de ADN (5'-CATGGGCGGCATGAACC GAGGCCCATCCTCACC X-3 ', donde X es 8-oxo G empareja con C) a 37 ° C durante 0-100 segundos. La línea de puntos indica una extrapolación de la fase de estado estacionario. Los datos se ajustaron a la ecuación de ráfaga con una amplitud igual a 33 ± 0,89 nM, k obs igual a 0,75 ± 0,083s -1, v s s igual a 0,18 ± 0,018 nM s -1 y k fuera igual a 0,0055 ± 0,020 s -1.

La figura 5
Figura 5. Cinética de rotación individuales de escisión 8-oxo G por OGG1 2. OGG1 (250 nM de enzima activa) se incubó con 50 nM de sustrato de ADN (5'-CTGCAGCTGATGCGCC X TACGGATCCCCGGGTAC-3 ', donde X es 8-oxo G empareja con C) a 37 ° C durante 0-60 seg. Los datos se ajustaron a la ecuación exponencial simple con k obs igual a 0,74 ± 0,015 seg -1. La línea punteada indica la amplitud extrapolado (es decir, el producto a tiempo infinito).

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Discussion

Los enfoques cinéticos descritos aquí perfilar métodos para definir las constantes cinéticas primarias. Si un curso de tiempo de formación de producto es bifásica, con la primera rotación enzimática ocurre rápidamente, a continuación, un paso después de la química es limitante de la velocidad durante pérdidas de balón catalíticos subsiguientes. En el caso de OGG1, la primera rotación se puede medir utilizando altas concentraciones de enzimas, ya sea con la limitación (S <E) o alta (S> E) las concentraciones de ADN. En el primer caso, la reacción se limita a un "solo volumen de negocios 'y proporciona una medida de la velocidad catalítica en el sitio activo de la enzima. En este último caso, se evalúan múltiples pérdidas de balón enzimáticas. El estallido de formación de producto se produce durante la primera rotación proporciona una medida de la evento químico en el sitio activo de la enzima, mientras que pérdidas de balón posteriores proporcionan una medida de la etapa que limita ciclo catalítico. Además, la amplitud de la ráfaga de formación de producto proporciona una medida de la enzima participa activamente. Esto se debe conocer a fin de calcular la tasa de disociación constante del producto de la velocidad de estado estacionario (k off = v ss / E). Para OGG1, la liberación de ADN del producto (es decir, producto constante de velocidad de disociación de ADN) limita el ciclismo catalítica y su tasa de estado estacionario 7,8. Como se muestra en la Figura 4, el producto de ADN de disociación constante de velocidad (k fuera = 0,0055 seg -1) para OGG1 es dos órdenes de magnitud más baja que la velocidad catalítica observada (k obs = 0,75 seg-1). Es una característica común cinética de ADN glycosylases que las bases de ADN dañadas especiales se unen a sus productos (ADN con un sitio abásico) adecuadamente, de modo que la liberación de producto es limitante de la velocidad durante las mediciones de estado estacionario 1,8-10. Es importante destacar que, mediciones de la actividad en estado estacionario con ello proporcionan una forma simple y directo para determinar la afinidad de unión del producto de ADN; menor actividad sugiere más apretado producto bncontrar.

Como se describe en la Figura 2 y resultados representativos, la fracción activa de la enzima se determina que es 38%. La fracción activa es inferior a la determinada a partir de la concentración de proteínas, a pesar de que la enzima preparada es> 95% homogénea (Figura 1). Esto puede ser debido la unión no específica de la enzima al sustrato y / o el método de determinación de proteínas que pueden no evaluar con precisión la concentración de proteína verdadera (por ejemplo, ensayo de proteínas de Bradford típicamente utiliza albúmina de suero bovino como un estándar que puede no ser una buen imitador de la enzima de interés). Alternativamente, la concentración de proteína se puede determinar por otros métodos o estimarse a partir de una calcularon los coeficientes de extinción molar a 280 nm, como la desarrollada por Gill y von Hippel 11.

Como se muestra en las figuras 4 y 5, la magnitud de k obs determinó lado a otrom el transcurso del tiempo pre-estado de equilibrio debe ser coherente con lo que está determinado a partir de un experimento de un solo volumen. El valor de k fuera también debe ser consistente entre experimentalmente métodos cinéticos alternos. Si, sin embargo, estas constantes de velocidad son diferentes (por ejemplo, k fuera es diferente entre las condiciones de estado estacionario y pre-estado estacionario), diferentes pasos pueden ser medidos por cada método y un nuevo modelo deben ser considerados. Por otra parte, la inhibición del producto o el agotamiento sustrato pueden influir en la tasa de estado estacionario de manifiesto en un curso de tiempo pre-estado de equilibrio que contamina la parte lineal.

En la situación en la que la ráfaga y las fases de estado estacionario no están bien separados (es decir, k obs ~ k fuera), la amplitud de la ráfaga y las constantes de velocidad observadas son compuestos de constantes de velocidad para múltiples pasos elementales 12. Por otra parte, si la liberación del producto es rápida (es decir, fuera k> k obs), el curso temporal de la formación de producto no es bifásica (primera rotación y pérdidas de balón posteriores están limitados por el mismo paso; química). En este caso, un experimento de un solo volumen de negocios puede proporcionar una medida de la catálisis.

Si se lleva a cabo un enfoque de un solo volumen de negocios para determinar una tasa catalítica intrínseca, suficiente enzima debe ser utilizado para asegurar que la unión está parcialmente no limitante de la velocidad. Del mismo modo, la unión de sustrato también debe ser rápido para que la velocidad de tiro no está limitado por unión al sustrato. Para verificar que la unión enzima no es limitante de la velocidad durante un experimento de un solo volumen de negocios, el curso de tiempo se repite con una concentración de enzima diferente para confirmar que el curso de tiempo exponencial no se altera. Además, ya que la amplitud de la evolución en el tiempo ráfaga o de un solo volumen de ventas es directamente proporcional a la enzima o las concentraciones de sustrato, respectivamente, estas concentraciones deben ser elegidos so Ellos pueden ser valorados con fiabilidad. Por último, cabe señalar que cuando las tasas de ráfaga y en estado estacionario no están bien separados, la amplitud de la ráfaga subestima la verdadera concentración de la enzima activa 12.

Los enfoques descritos anteriormente cinética de proporcionar un método fiable para aislar pasos clave durante el ciclo catalítico de ADN glycosylases. Con estas constantes cinéticas de referencia, la influencia de la alteración de la secuencia de ADN / estructura de 1,13-18, los residuos de sitio activo de iones de metal 19,20, 21, o proteína accesoria celular en la catálisis o en bicicleta enzima puede ahora ser evaluado 22-24.

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Disclosures

Los autores tienen nada que revelar.

Acknowledgments

Damos las gracias a la Dra. Julie K. Horton para la lectura crítica del manuscrito y el Dr. Rajendra Prasad por sus útiles sugerencias y discusiones. Parte de esta investigación fueron publicados originalmente en The Journal of Biological Chemistry, Sassa A et. al., "Efectos de la secuencia de ADN del contexto de la actividad glicosilasa de ADN humano glucosilasa 8 oxoguanine." J Biol Chem. 287, 36702-36710 (2012) 2. Esta obra fue financiada en su totalidad o en parte, por los Institutos Nacionales de Investigación en Salud Proyecto de Donación Z01-ES050158 en el Programa de Investigación Intramural, NIEHS.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagent/Material
5’-6-FAM labeled oligonucleotides containing a single 8-oxoG Eurofins MWG Operon 5’-P32 radiolabeled oligonucleotides can be used as well. Polyacrylamide gel purification grade is recommended.
Unlabeled oligonucleotides (complementary strand) Eurofins MWG Operon Polyacrylamide gel purification grade is recommended.
1 ml BD Luer Lock disposable syringe BD Medical 309628 Lue Lock disposable syringe from other vendors can be used as well.
10 ml BD Luer Lock disposable syringe BE Medical 309604 Luer Lock disposable syringe from other vendors can be used as well.
Equipment
Circulating water bath Any vender
RQF-3 Rapid Quench-Flow Instrument KinTek Corporation Rapid Quench-Flow Instrument from other vendors can be used as well.
Typhoon Phosphorimager 8600 GE Healthcare Life Sciences Imager from other vendors can be used as well.
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Sassa, A., Beard, W. A., Shock, D. D., Wilson, S. H. Steady-state, Pre-steady-state, and Single-turnover Kinetic Measurement for DNA Glycosylase Activity. J. Vis. Exp. (78), e50695, doi:10.3791/50695 (2013).

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