Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Chemistry
Click here for the English version

Chemistry

Steady-state, Pre-steady-state, og Single-omsetningen Kinetic måling for DNA glykosylase aktivitet

Published: August 19, 2013 doi: 10.3791/50695
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Laboratory of Structural Biology, NIEHS, National Institutes of Health

Summary

Tid kurs for glykosylase aktiviteten til 8-oxoguanine DNA glykosylase er bifasisk stille et utbrudd av produktet dannelse og en lineær steady-state fasen. Utnytte slukke-flow teknikker, burst og steady-state priser kan måles, som tilsvarer eksisjon av 8-oxoguanine og utgivelsen av glykosylase fra produktet DNA, hhv.

Abstract

Humant 8-oxoguanine DNA-glykosylase (OGG1) excises den mutagene oksydativ DNA lesjon 8-okso-7 ,8-dihydroguanine (8-oxoG) fra DNA. Kinetisk karakterisering av OGG1 gjennomføres for å måle utbredelsen av 8-oxoG excision og produktet lanseres. Når OGG1 konsentrasjonen er lavere enn substrat DNA, tid kurs for produktdannelse er bifasisk, en hurtig eksponensiell fase (dvs. burst) av produktdannelse er etterfulgt av en lineær steady-state fase. Den første serie av produktdannelse tilsvarer konsentrasjonen av enzymet riktig festet på substratet, og den burst amplitude er avhengig av konsentrasjonen av enzymet. Den første orden hastighetskonstant av burst tilsvarer den iboende sats på 8-oxoG excision og tregere steady-state sats måler frekvensen av produktet lanseres (produkt DNA dissosiasjon hastighet konstant, k off). Her beskriver vi steady-state, pre-steady-state, og single-omsetningen tilnærminger for å isolere og måle specific trinn under OGG1 katalytisk sykling. En fluorescens-merkede lesjon-inneholdende oligonukleotid og renset OGG1 er brukt for å lette nøyaktige kinetiske målinger. Siden lave konsentrasjoner enzym blir brukt for å lage steady-state målinger, ved manuell blanding av reagenser og av reaksjonen kan bli utført for å fastslå den steady-state-verdien (koff). I tillegg indikerer ekstrapolering av steady-state sats til et punkt på ordinaten på null tid at et utbrudd av produktet dannelsen skjedde under den første omsetningen (dvs. y-aksen er positiv). Den første-ordens hastighetskonstant for den eksponentielle burst fase kan måles ved hjelp av et hurtig omrøring og avkjøling teknikk som undersøker mengden av produkt dannet ved korte tidsintervaller (<1 sekund) før steady-state fase og svarer til frekvensen av 8 -oxoG excision (dvs. kjemi). Det kjemiske trinn kan også måles ved hjelp av en enkelt-omsetning tilnærming hvor katalytisk sykling erforebygges ved metting av substratet med enzymet DNA (E> S). Disse tilnærmingene kan måle elementære hastighetskonstanter som påvirker effektiviteten av fjerning av en DNA-lesjon.

Introduction

En aerobic miljø iler genomisk ustabilitet. En stor promutagenic DNA lesjon resulterende fra oksidativt stress er 7,8-dihydro-8-oxoguanine (8-oxoG). Dette skyldes det tvetydige kodende potensiale av 8-oxoG. Menneskelig 8-oxoguanine DNA glykosylase (OGG1) er ansvarlig for å initiere basen excision reparasjon av 8-oxoG. Den glykosylase aktivitet OGG1 excises 8-oxoG basen resulterer i produkt DNA med en apurinic hotellet (AP-site). En svak lyase aktivitet OGG1 kan incise AP-området i enkelte tilfeller.

Kinetisk karakterisering av DNA glycosylases finner generelt at de viser bifasisk tid kurs. Etter en innledende rask fase av produktdannelse (dvs. burst), er en lineær steady-state fase observert 1-3. Denne atferden er et tegn på et trinn å følge kjemi (dvs. konformasjonsendringen eller produkt release) blir hastighetsbegrensende under den lineære delen av tiden selvfølgelig, mens burst fase, ofte referert til som den transiente fase, tilsvarer produkt-dannelse ved enzymet aktive setet under den første syklus av reaksjonen. Når produktet lanseres er hastighetsbegrensende under steady-state fasen, aktivitetsmålinger gi et kvalitativt mål på produktet DNA bindende affinitet, men gir ikke kinetisk informasjon om hendelser på enzymet aktive området (dvs. kjemi). Følgelig er metoder for å isolere og måle den eksponentielle pre-steady-state burst fase for å undersøke hendelser i løpet av første enzymatisk omsetning på enzymets aktive sete fire.

Det er tre standard kinetiske metoder for å karakterisere den katalytiske oppførselen til OGG1, (1) steady-state, (2) pre-steady-state, og (3) single-omsetning. Disse tilnærmingene skiller seg fra hverandre ved at konsentrasjonen av enzymet i reaksjonsblandingen, og enzymet til substrat-forhold benyttes i hver fremgangsmåte. I en typisk steady-state tilnærming,noen ganger referert til som flere omsetning kinetikk, er lave konsentrasjoner av enzym som brukes for å følge produktdannelse. Underlaget konsentrasjonen overstiger sterkt enzymkonsentrasjon slik at flere enzymatiske turnovers ikke påvirke substrat konsentrasjon. I denne situasjonen bør tid kurs være lineær, og det er ofte vanskelig å skjelne om et utbrudd forekom under den første omsetningen på grunn av den lave enzymkonsentrasjon som brukes i denne fremgangsmåten, merk at briste amplitude tilsvarer den enzymkonsentrasjon. Dette kan overvinnes ved bruk av en høyere enzym-konsentrasjon og ekstrapolere det lineære tidsforløpet til null tid til å detektere hvorvidt den første enzymatiske omsetningen skjedde raskt. Den skjæringspunkt på ordinaten (y-akse) bør være proporsjonal med den enzymkonsentrasjon og er et mål på det enzym aktivt engasjert med substratet. Selv om denne tilnærmingen kan i prinsippet gi bevis for eksistensen av en burst fase, en forskjellige tilnærming er nødvendig for å måle kinetikkene burst fase. I mange tilfeller burst fasen er for rask til å måle ved manuell miksing og slukker teknikker. I denne situasjonen, nærmer pre-steady-state og single-omsetning kinetisk (dvs. forbigående kinetisk) krever ofte en rask blanding og herding instrument for å følge tidlige tidspunkter av en reaksjon fem. En på forhånd steady-state tilnærming høye konsentrasjoner av enzymet blir brukt, slik at en betydelig mengde av produktet er dannet under den første omsetning. Siden flere turnovers er fulgt for å observere katalytisk sykling (dvs. lineær fase som følger burst), er substratkonsentrasjon større enn enzymet konsentrasjon ([enzym] <[substrat]). Å isolere hendelser på det aktive området av enzymet uten katalytisk sykling, er single-omsetning forholdene utnyttet. I dette tilfellet blir substratet mettet med enzym (E >> S), slik at alt av substratet vil delta in 'enkelt omsetning' og vil typisk utvise en enkelt-eksponensiell tidsforløp.

Som nevnt ovenfor for enzymer som viser en burst fase, produkt utgivelse (k off) begrenser ofte frekvensen av steady-state fasen av tiden kurset. Frekvensen av produkt utgivelse (v ss, kons. / Time) kan bestemmes fra skråningen av den lineære steady-state fasen. Det aktive enzym-konsentrasjon (E) er nødvendig for å omdanne frekvensen av produktet frigjøring til en iboende hastighetskonstanten hvor koff = v ss / [E]. Viktig er det at aktiv enzymkonsentrasjon vanligvis lavere enn den målte proteinkonsentrasjon på grunn av urenheter, inaktive enzymet, enzym ikke-produktivt bundet til substratet, og fremgangsmåten anvendt for å bestemme proteinkonsentrasjonen. Den aktive enzymkonsentrasjon kan bestemmes fra burst amplitude når produktet utgivelsen er treg. Dermed ekstrapolere en steady-state tidsforløpet tilnull tid gir et anslag på aktivt enzym som trengs for å beregne k off (produkt release) fra den observerte steady-state rate.

For å måle kinetikkene til svermen, er en pre-steady-state tilnærming nødvendig å følge produktdannelse under den første omsetning som inntreffer før den lineære steady-state fase. De burst kinetikk følger dannelsen av enzymet-produkt mellomfag. Når reaksjonen blir initiert ved å blande enzymet med substratet, øker mengden av det enzym-produktet hurtig inntil reaksjonen har nådd en stabil tilstand fase. Ved katalyse er langt hurtigere enn produkt frigjøring, er amplituden av burst lik aktivt enzym og den observerte eksponensiell tilnærming til likevekt (kobs) tilsvarer frekvensen av kjemisk omdannelse av substrat til produkt, forutsatt at den omvendte hastighet på kjemi er ubetydelig.

I noen tilfeller katalytisk cyklamre forstyrrer en pre-steady-state analyse, for eksempel når de størrelsene på prisene for kjemi og produkt utgivelse er ikke signifikant forskjellig. I dette tilfellet anvendelse av overskytende enzym i forhold til substratet forhindrer katalytisk sykling og grenser substrat bundet med enzymet til en enkelt omsetning. Følgelig kan det første trinn av kjemisk reaksjon isoleres og bestemmes nøyaktig som den første-ordens hastighetskonstant (kobs). Denne hastighetskonstanten bør være lik kobs bestemt fra den før-steady-state av fremgangsmåten som angitt ovenfor.

Her beskriver hvordan disse kinetiske metoder kan brukes for å analysere aktiviteten av OGG1 glycosylase.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

En. Fremstilling av enzym og DNA Substrat

  1. Over-express OGG1 som en GST-fusion protein i E. coli, utnytte GST-tag for rensing, og deretter fjerne GST-tag ved spalting med HRV-3C protease (figur 1) 6.
  2. Kjøp den kjemisk syntetiserte 5'-6-karboksyfluorescein (6-FAM) merket oligonukleotid som inneholder en enkelt 8-oxoG rest og dens komplementære tråd umerket oligonukleotid. Den 34-mer oligonukleotider som inneholder en 8-oxoG ved posisjon 17 fra 5'-enden. Rens disse oligonukleotider ved polyakrylamidgel-elektroforese.
  3. Forbered dobbelttrådet DNA-substrat inneholdende 8-oxoG ved blanding av 5'-6-FAM-merket oligonukleotid med sin komplementære tråden ved et molart forhold på 1:1,2 i annealing buffer (10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 50 mM NaCl, 1 mM EDTA) i et 1,5 ml mikro-sentrifugerør. Plasser røret på en flottør i kokende vann i 5 min. La røret på plass og deretter la vannet avkjøles langsomt å room temperatur (dette tar ca 2 timer).
  4. Utfør prøvepreparering og eksperimentet under dårlige lysforhold eller minimale, slik som å minimalisere fotobleking av det fluorescerende merke.

2. Måling av Steady-State Tid Kurs og aktive området Titrering av OGG1

2.1. Prøveopparbeidelse og steady-state tidsforløpet

  1. Forbered DNA-substrat og Ogg1 løsninger separat i reaksjonsbuffer (50 mM HEPES, pH 7,5, 20 mM KCl, 0,5 mM EDTA, og 0,1% bovint serum-albumin) i 1,5 ml mikrofugerør på is. Konsentrasjonen av DNA er 400 nm og den tilsynelatende konsentrasjon av OGG1 er 30, 60, 90 eller 120 nM som bestemt ved en Bradford protein-analysen. Sett i reaksjonsrørene i en varmeblokk sett ved 37 ° C. Pre-inkuberes enzym og DNA-substrat-løsninger separat ved 37 ° C i 1 min.
  2. Start reaksjonen ved å blande like volumer av OGG1 og DNA-substrat-løsninger ved pipettering. Etter blanding disse løsningersjoner 1:1 (volum / volum), var sluttkonsentrasjoner er 200 nM DNA og 15, 30, 45 eller 60 nM OGG1, henholdsvis. Fjern alikvoter (10 ul) ved tidsintervaller og stoppe reaksjonen ved å blande med en pl av 1 M NaOH. Som kontroll for den tid kurs, 10 ul av reaksjonsblandingen uten enzym ble blandet med 1 pl av 1 M NaOH.
  3. Plasser reaksjonsproduktene prøver i en 90 ° C varmeblokk i 5 min for å spalte det resulterende produktet AP-område. Etter oppvarming, tilsett 1 pl av 1 M HCl for å nøytralisere hver prøve.
  4. Legg et likt volum (12 ul) av gel loading buffer (95% formamid, 20 mM EDTA, 0,02% bromfenol og 0,02% xylen-cyanol) til hver reaksjon prøven, og deretter plassere blandingen i en varmeblokk satt ved 95 ° C i 2 min, deretter umiddelbart plassere røret på is.
  5. Last av prøvene (5 ul) på en 15% denaturerende polyakrylamidgel inneholdende 8 M urea i 89 mM Tris-HCl, pH 8,8, 89 mM borsyre, og 2 mM EDTA. Underlaget og kløyvde produkter er godt atskilt etterkjører gel.

2.2. Avbilding av gelen

  1. Skanne gel ved hjelp av en imager som kan oppdage fluorescensmerkede DNA og visualisere underlaget og produkt band.
  2. Kvantifisere band etter bildebehandling gelen. Legg merke til at noen bakgrunn spalting kan observeres etter behandling av substratet i seg selv med NaOH (figur 2A). Subtraher denne bakgrunn av den målte mengde av hvert reaksjonsprodukt.

2.3. Dataanalyse

  1. Plotte mengden av det produkt som dannes ved hver reaksjonstid (t) (figur 2B). Analyser rådata ved å bruke ligning 1 for å bestemme amplituden av sprekker (A 0, y-aksen), og hellingen for den lineære steady-state fase (v ss).

  1. Ploty-aksen i forhold til den totale proteinkonsentrasjonen (dvs. tilsynelatende enzymkonsentrasjon, figur 2C), som gir et mål på den aktive del av enzymet. Bruk av en lineær tilpasning med null skjæringspunkt for å muliggjøre korreksjon faktor for å bestemme den fraksjon av aktivt enzym.
  2. Plott steady-state hastighet i forhold til det aktive enzymet konsentrasjonen (figur 2D), som leverer produktet dissosiasjons konstant hastighet (det vil si helling av den monterte linje).

3. Måling av Pre-steady-state Tid Course

Som vist i figur 2, produktdannelse ved kontinuerlige fasen er for rask til å måle ved hjelp av manuell blanding og bråkjøling. Derfor kan en hurtig quench-nivåmåler gir en kraftig metode for å måle hurtige reaksjoner som oppstår på millisekund tidsskalaen (figur 3) 5. Instrumentet bruker en datastyrt motor til raskt å blande ennd slukke reaksjoner etter spesifiserte reaksjonstid. For eksempel bruke en Kintek RQF-3 Rapid Slukk-Flow Instrument for å måle første serie fase og påfølgende steady-state fasen av produktet dannelse katalysert av OGG1. Rapid Slukk-Flow Instruments er tilgjengelig fra flere produsenter.

3.1. Utarbeidelse av prøven

Separat forberede DNA-substrat og Ogg1 løsninger i 1,5 ml rør som beskrevet i 2-1. Konsentrasjonen av DNA og aktive OGG1 er 400 nM og 80 nM. Dette resulterer i sluttkonsentrasjoner på 200 nM og 40 nM DNA aktiv Ogg1 etter blanding av 01:01 (v / v).

3.2. Utarbeidelse av rask slukke-flow instrument

  1. Koble et sirkulerende vannbad til den raske quench-strømning Instrument for temperaturkontroll (37 ° C).
  2. Juster instrument parametere og velge riktig reaksjon løkke for ønsket tid peker i henhold til produsentens anvisningersjoner. Reaksjons-sløyfer er av varierende lengder for å gi alternative reaksjonstid.
  3. Forbered reaksjon buffer og NaOH slukke løsninger i 10 ml Luer Lock engangssprøyter og feste disse sprøytene til stasjonen Porter og laste Drive reservoarer med reaksjon buffer (sprøyter B) og 142 mM NaOH (sprøyte Q) (Sprøyte Load Ventiler i LOAD posisjon) . For å fjerne luftbobler fra sprøyten, jobbe løsningen frem og tilbake flere ganger.
  4. Senk stepper motor til det berører toppen av sprøyter (Sprøyte Load ventiler og Sample Load ventiler i FIRE posisjon).
  5. Spyl Eksempel Loops, den Reaction Loop, og Exit linje med vann og metanol. Tørk blussende områder helt (ventiler i FLUSH posisjon).

3.3. Pre-steady-state tidsforløpet

  1. Lag et hull i toppen av en korket 1,5 ml rør ved hjelp av en 16-gauge nål. Fest et rør på Exit linje for å samle slukket reaksjon.
  2. Still inn ønsket reaction tid (i sekunder) ved hjelp av tastaturet. Stepper motor skal sikkerhetskopiere å justere for sløyfe volum for derved å opprettholde konstant volum kvelende. Posisjon stempler for sprøyten B mot Stepper Motor plattformen ved å legge buffer med engangssprøyter fast på stasjonen Porter.
  3. Fyll en ml Luer Lock engangssprøyter med DNA underlaget og OGG1 løsninger, henholdsvis (sample ventiler i LOAD posisjon). Fest sprøyter med DNA underlaget og OGG1 løsninger til hver av de Sample Load Porter, og deretter fylle Eksempel Loops med DNA underlaget og OGG1 løsninger, henholdsvis (Eksempel Load Ventiler i LOAD posisjon).
  4. Sett alle Sprøyte Load Ventiler og Sample Load Ventiler til FIRE posisjon. Starte reaksjonen av et tastatur slag (f.eks trykk på "G" eller "START"-tasten). DNA-substrat og Ogg1 løsninger (18 mL hver) blir straks blandet i reaksjons-løkken.
  5. Vent inntil reaksjonen er automatisk bråkjølt ved den ønskede reaksjons-tid ved å blande 36 ul av reaction blanding med 86 pl av 142 mM NaOH. Etter bråkjøling av reaksjonen, prøven slippes ut fra utløpet linje.
  6. Legg sprøyten Load Ventiler til lasten posisjon og prøven Load Ventiler til flush posisjon. Spyl Eksempel Loops, den Reaction Loop, og Exit linje med vann og metanol og tørke som beskrevet i 3.2. Gjenta trinnene ovenfor for hvert tidspunkt.
  7. Utfør en kontroll eksperiment uten enzym for å avgjøre en bakgrunn korreksjon, noe som kan gjøres manuelt eller med raske slukke instrument. Å utføre en kontroll med den raske-slukke instrument, fyll Sample Loop for DNA med DNA underlaget men beholde Sample Loop for OGG1 tom. Sett reaksjonstid, utføre blandingen og slukke som beskrevet i 3.3.4-3.3.6.
  8. Vask Eksempel løkker og reaksjonen ring med 2 M NaOH, 2 M HCl, vann og metanol og deretter tørke den vaskede linjer. Etter innstilling av Stepper Motor til utgangsposisjonen, slå sprøyten Load Ventiler til lasten position og vaske Drive reservoarer med vann.
  9. Unn slukket reaksjonsprodukter prøver med varme, og deretter separat substrat og produkt-DNA med 15% denaturerende polyakrylamidgel-elektroforese som beskrevet i 2.1.
  10. Visualisere og kvantifisere båndene på gelen som beskrevet i 2.2.

3.4. Dataanalyse

Monter tid kurs av produktdannelse ved ikke-lineær regresjonsanalyse på en ligning med en stigende eksponential-og lineære form (Formel 2) tilveiebringelse av den første-ordens hastighetskonstant (kobs), amplituden av sprekker (A 0), og en lineær hastighet (v ss).

4. Single-omsetningen Tid Course

  1. Forbered DNA underlaget og OGG1 i separate 1,5 ml rør som beskrevet i 2-1. Den konsentrertesjoner av DNA og aktive OGG1 er 100 nM og 500 nM, og dette gir sluttkonsentrasjoner på 50 nM og 250 nM DNA OGG1 etter blanding av 01:01 (v / v).
  2. Forberede den raske slukke-flow instrument og forberede reaksjonen prøvene som beskrevet i 3.2 og 3.3.
  3. Behandle slukket reaksjon prøver med varme og utsett dem for 15% denaturing polyakrylamidgelelektroforese å skille underlaget og produkter som beskrevet i 2.1.
  4. Visualisere og kvantifisere båndene på gelen som beskrevet i 2.2.
  5. Monter tid kurs av produktdannelse til en enkelt eksponensiell å bestemme den første-ordens hastighetskonstant (kobs) som gitt i ligning 3..

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Steady-state kinetisk analyse ble utført ved å bruke 200 nM DNA-substrat og fire forskjellige konsentrasjoner av åpenbare OGG1 (15, 30, 45, og 60 nM) som bestemt ved en Bradford protein assay to. Tiden kurs av produktdannelse var passe til en lineær ligning for å bestemme med y-aksen, som var 2,2, 11, 15, og 26 nM, i forhold til hvert protein konsentrasjon (figur 2B). Y-avskjærer ble ytterligere plottet i forhold til hverandre faktiske proteinkonsentrasjon (figur 2C). Fraksjonen av aktivt enzym var bestemt på å være 38% fra skråningen av linjen i figur 2C. For å bestemme steady-state rate, v ss bestemmes ut fra de lineære passer i figur 2B ble plottet i forhold til y-avskjærer (figur 2D). Skråningen av linjen i figur 2D var 0,0028 sek -1, som tilsvarer dissosiasjon hastighetskonstantfor produktet AP-site og radert AP-site dannet av DNA glykosylase / lyase aktiviteter.

En pre-steady-state gang kurset ble fulgt ved å bruke 200 nM DNA underlaget og 40 nM aktive OGG1. Tiden kurs av produktet dannelsen kan være egnet til en ligning med stigende eksponentiell og lineær form. Som vist i figur 4, kobs og koff ble bestemt til å være 0,75 sek -1 og 0,0055 sek -1, henholdsvis 2. Amplituden for den sprakk fase (33 nM) var noe lavere enn forutsagt ut fra konsentrasjonen av den aktive OGG1 tilsatt (40 nM). Dette kan skyldes ikke-spesifikk binding av OGG1 til DNA-substrat som reduserer de tilgjengelige mengder enzym-molekyler.

Under enkelt-omsetning betingelser, ble 8-oxoG eksisjon reaksjonen ferdig i løpet av 6 sek (figur 5) 2. Tidsforløpet for produktdannelse kunne passe til en enkelt eksponensiellligningen og ga k obs på 0,74 sek -1. Spesielt, var amplituden for produktdannelse lavere enn den forventede 50 nM tilsatt DNA substrat. Dette kan ha vært delvis skyldes bakgrunn spaltning av DNA ved NaOH-behandlingen (figur 2A) eller tilstedeværelse av unannealed substrat oligonukleotider i reaksjonsblandingen.

Figur 1
Figur 1. Rensing av menneskelig OGG1 fra E. coli. Den menneskelige OGG1 genet ble klonet inn pGEX-6P-en og overexpressed i BL21 (DE3-celler). Lane 1; uninduced celler, to kjørefelt; IPTG-induserte celler, tre kjørefelt, løselig protein fraksjon, fire kjørefelt, glutation sepharose 4B etter inkubasjon med løselig protein fraksjon, fem kjørefelt, flyt gjennom brøkdel etter inkubasjon av glutation sepharose 4B med HRV 3C protease, felt 6, strømme gjennom fraksjon etter fjerning av forurensninger ved Mono Q kolonne. Et fotografi av Coomassie blå farget gel vises.

Figur 2
Figur 2. Steady-state kinetikk og aktive området titrering av renset OGG1 2 OGG1 (15 nM, ○, 30 nM, □, 45 nM ◊, eller 60 nM ×). Ble inkubert med 200 nM DNA substrat (5'-CTGCAGCTGATGCGCC X TACGGATCCCCGGGTAC -3 ', hvor X er 8-oxoG sammenkoblet med C) ved 37 ° C i 1-30 minutter, som angitt. Disse enzym-konsentrasjoner representerer tilsynelatende proteinkonsentrasjoner basert på en Bradford protein-analysen, kvantifiseres fra en BSA-standard kurve. A, Denaturing polyakrylamidgeler viser adskilte substrater (S) og produkter (P). OGG1 (30 nM) og 200 nM D NA substrat ble anvendt for reaksjonen. B, Tid kurs av produktdannelse. Dataene ble passer til en lineær ligning for å bestemme amplituden av burst fase (y-aksen) og en tilsynelatende hastighet av produkt frigjøring (helling). C, Plot av de avskjærer bestemt fra den lineære passer i panel B relativt til det som bestemmes ved Bradford-analysen. Hellingen av linjen tilsvarer brøkdel av aktivt enzym. Det feilfelt betegner feilen i amplituden utledes fra lineære passer til produktdannelse i panel B. D, Plot av bakkene bestemt fra den lineære passer i panel B i forhold til det aktive enzym konsentrasjon. Feilen bar betegner feilen i skråningen utledes fra lineære passer til produktet formasjonen i panel B. Skråningen av linjen tilsvarer steady-state rate (k off), 0,0028 sek -1.

jove_content "fo: keep-together.within-page =" always "> Figur 3
Figur 3. Oversikt over Rapid Slukk-Flow Instrument.

Figur 4
Figur 4. Pre-steady-state kinetikk 8-oxoG eksisjon av OGG1 to. OGG1 (40 nM aktivt enzym) ble inkubert med 200 nM DNA substrat (5'-CATGGGCGGCATGAACC X GAGGCCCATCCTCACC-3 ', hvor X er 8-oxoG sammen med C) ved 37 ° C i 0-100 sek. Den stiplede linjen viser en fremskrivning av steady-state fasen. Dataene ble passer til den sprakk ligning med en amplitude lik 33 ± 0,89 nM, kobs lik 0.75 ± 0.083sek -1, v s s lik 0,18 ± 0,018 nM sek -1 og k off lik 0,0055 ± 0,020 sek -1.

Figur 5
Figur 5. Enkelt omsetning kinetikk 8-oxoG eksisjon av OGG1 to. OGG1 (250 nM aktivt enzym) ble inkubert med 50 nM DNA substrat (5'-CTGCAGCTGATGCGCC X TACGGATCCCCGGGTAC-3 ', hvor X er 8-oxoG sammen med C) ved 37 ° C i 0-60 sek. Dataene ble plass til én eksponentiell ligningen med k obs lik 0,74 ± 0,015 sek -1. Den stiplede linjen viser ekstrapolert amplitude (dvs. produktet på uendelig tid).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Den kinetiske metoder beskrevet her skissere metoder for å definere elementære kinetiske konstanter. Hvis en gang løpet av produkt formasjonen er bifasisk med den første enzymatisk omsetningen skjer raskt, og deretter et skritt etter kjemi er hastighetsbegrensende under påfølgende katalytiske turnovers. I tilfelle av OGG1, kan den første omsetning måles ved hjelp av høye konsentrasjoner av enzymet med enten begrensende (S <E) eller høy (S> E) DNA-konsentrasjoner. I det første tilfellet, blir reaksjonen er begrenset til et "single-turnover" og er et mål på den katalytiske hastigheten på det aktive setet av enzymet. I sistnevnte tilfelle er flere enzymatiske turnovers vurdert. Den utbrudd av produktdannelse som oppstår under den første omsetningen er et mål på den kjemiske arrangement ved enzymets aktive sete, mens etterfølgende omsetning gir et mål på de trinn som begrenser katalytisk sykling. I tillegg gir amplituden av utbrudd av produktdannelse et mål på aktivt enzym. Dette må være kjent for å beregne produktet dissosiasjon hastigheten konstant fra steady-state hastighet (k off = v ss / E). For OGG1, begrenser utslipp av produktet DNA (dvs. produktet DNA dissosiasjon hastighetskonstant) katalytisk sykling og steady-state rente 7,8. Som vist i figur 4, er den DNA-produkt dissosiasjon hastighetskonstanten (k off = 0,0055 sek -1) for OGG1 to størrelsesordener lavere enn den observerte katalytiske hastighet (kobs = 0,75 sek -1). Det er en vanlig kinetisk funksjon av DNA glycosylases at avgifter skadede DNA-baser for å binde sine produkter (DNA med en abasic stedet) godt, slik at produktet utgivelsen er hastighetsbegrensende under steady-state målinger 1,8-10. Viktigere, steady-state aktivitetsmålinger dermed gir en enkel og grei måte å finne produktet DNA bindende affinitet; lavere aktivitet tilsier strammere produkt binding.

Som beskrevet i figur 2 og Representative resultater, er den aktive del av enzymet bestemt til å være 38%. Den aktive fraksjonen er lavere enn det som bestemmes av proteinkonsentrasjonen, selv om den fremstilte enzym er> 95% homogent (figur 1). Dette kan være på grunn av den ikke-spesifikke binding av enzymet til substratet og / eller metoden for proteinbestemmelse som kanskje ikke er nøyaktig vurdere den sanne proteinkonsentrasjon (f.eks Bradford protein assay bruker vanligvis bovint serumalbumin som en standard som kan være en god etterligne for enzymet av interesse). Alternativt kan proteinkonsentrasjon bestemmes ved andre metoder, eller estimert fra en beregnet molare ekstinksjonskoeffisienter ved 280 nm slik som det som er utviklet av Gill og von Hippel 11.

Som vist i figurene 4 og 5 kan størrelsen av kobs bestemmes from den før-steady-state tidsforløpet bør være i samsvar med det bestemmes fra en enkelt-omsetning eksperiment. Verdien til koff skal også være forenlig eksperimentelt mellom annet hvert kinetiske metoder. Hvis imidlertid disse hastighetskonstanter er forskjellige (f.eks k off er forskjellig mellom steady-state og pre-steady-state forhold), kan ulike trinn måles ved hver metode og en ny modell bør vurderes. Alternativt kan produktet hemming eller substrat uttømming påvirke den tilsynelatende steady-state hastighet i en forhåndsbestemt steady-state tidsforløp som forurenser den lineære delen.

I den situasjon hvor den sprakk og steady-state faser ikke er godt separert (dvs. kobs ~ k av), amplituden av sprekker og de ​​observerte hastighetskonstanter er sammensetninger av elementære hastighetskonstanter for flere trinn 12. Videre er hvis produktet utgivelsen rask (dvs. kDff> kobs), Tidsforløpet for produktdannelse er ikke bifasisk (første omsetning og etterfølgende omsetning er begrenset av det samme trinn, kjemi). I dette tilfelle kan en enkelt-omsetning eksperiment gir et mål på katalyse.

Hvis en enkelt-omsetning tilnærming er gjennomført for å avgjøre en iboende katalytisk rente, må tilstrekkelig enzymet brukes til å sikre at bindingen ikke er delvis hastighetsbegrensende. På samme måte må substrat binding også være slik at den ubehagelige burst hastighet ikke er begrenset av underlaget binding. For å bekrefte at enzymet binding er ikke hastighetsbegrensende løpet av en enkelt-omsetning eksperiment, er tidsforløpet gjentatt med et annet enzym-konsentrasjon for å bekrefte at den eksponentielle tidsforløpet er ikke endres. I tillegg, siden amplituden av serie-eller enkelt-omsetningen tidsforløpet er direkte proporsjonal med enzym eller substrat-konsentrasjoner, henholdsvis, bør disse konsentrasjonene velges so de kan måles pålitelig. Til slutt bør det nevnes at når de briste og steady-state priser ikke er godt separert, undervurderer burst amplitude den sanne aktivt enzym konsentrasjon 12.

Kinetikken tilnærminger beskrevet ovenfor gi en pålitelig metode for å isolere viktige skritt i løpet av katalytisk sykling av DNA glycosylases. Med disse referanse kinetiske konstanter, påvirkning av endret DNA sekvens / struktur 1,13-18 kan aktive site rester 19,20, metall ion 21 eller mobil tilbehør protein på katalyse eller enzym sykling nå evalueres 22-24.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ikke noe å avsløre.

Acknowledgments

Vi takker Dr. Julie K. Horton for kritisk lesing av manuskriptet og Dr. Rajendra Prasad for nyttige innspill og diskusjoner. Deler av denne forskningen ble opprinnelig publisert i The Journal of Biological Chemistry, Sassa A et. al., "DNA sekvens Kontekst Effekter på glykosylase aktivitet of Human 8-Oxoguanine DNA glykosylase." J Biol Chem. 287, 36702-36710 (2012) 2. Dette arbeidet ble støttet, helt eller delvis, ved National Institutes of Health Research Project Grant Z01-ES050158 i egenutført Research Program, NIEHS.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagent/Material
5’-6-FAM labeled oligonucleotides containing a single 8-oxoG Eurofins MWG Operon 5’-P32 radiolabeled oligonucleotides can be used as well. Polyacrylamide gel purification grade is recommended.
Unlabeled oligonucleotides (complementary strand) Eurofins MWG Operon Polyacrylamide gel purification grade is recommended.
1 ml BD Luer Lock disposable syringe BD Medical 309628 Lue Lock disposable syringe from other vendors can be used as well.
10 ml BD Luer Lock disposable syringe BE Medical 309604 Luer Lock disposable syringe from other vendors can be used as well.
Equipment
Circulating water bath Any vender
RQF-3 Rapid Quench-Flow Instrument KinTek Corporation Rapid Quench-Flow Instrument from other vendors can be used as well.
Typhoon Phosphorimager 8600 GE Healthcare Life Sciences Imager from other vendors can be used as well.
KaleidaGraph Synergy Software

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Porello, S. L., Leyes, A. E., David, S. S. Single-turnover and pre-steady-state kinetics of the reaction of the adenine glycosylase MutY with mismatch-containing DNA substrates. Biochemistry. 37, 14756-14764 (1998).
  2. Sassa, A., Beard, W. A., Prasad, R., Wilson, S. H. DNA sequence context effects on the glycosylase activity of human 8-oxoguanine DNA glycosylase. The Journal of Biological Chemistry. 287, 36702-36710 (2012).
  3. Wong, I., Lundquist, A. J., Bernards, A. S., Mosbaugh, D. W. Presteady-state analysis of a single catalytic turnover by Escherichia coli uracil-DNA glycosylase reveals a "pinch-pull-push" mechanism. The Journal of Biological Chemistry. 277, 19424-19432 (1074).
  4. Johnson, K. A. Advances in transient-state kinetics. Current Opinion in Biotechnology. 9, 87-89 (1998).
  5. Johnson, K. A. Rapid kinetic analysis of mechanochemical adenosinetriphosphatases. Methods in Enzymology. 134, 677-705 (1986).
  6. Kovtun, I. V., et al. OGG1 initiates age-dependent CAG trinucleotide expansion in somatic cells. Nature. 447, 447-452 (2007).
  7. Hill, J. W., Hazra, T. K., Izumi, T., Mitra, S. Stimulation of human 8-oxoguanine-DNA glycosylase by AP-endonuclease: potential coordination of the initial steps in base excision repair. Nucleic Acids Research. 29, 430-438 (2001).
  8. Zharkov, D. O., Rosenquist, T. A., Gerchman, S. E., Grollman, A. P. Substrate specificity and reaction mechanism of murine 8-oxoguanine-DNA glycosylase. The Journal of Biological Chemistry. 275, 28607-28617 (2000).
  9. Waters, T. R., Swann, P. F. Kinetics of the action of thymine DNA glycosylase. The Journal of Biological Chemistry. 273, 20007-20014 (1998).
  10. Nilsen, H., et al. Excision of deaminated cytosine from the vertebrate genome: role of the SMUG1 uracil-DNA glycosylase. The EMBO Journal. 20, 4278-4286 (2001).
  11. Gill, S. C., von Hippel, P. H. Calculation of protein extinction coefficients from amino acid sequence data. Analytical Biochemistry. 182, 319-326 (1989).
  12. Van de Berg,, Beard, B. J., A, W., Wilson, S. H. DNA structure and aspartate 276 influence nucleotide binding to human DNA polymerase beta. Implication for the identity of the rate-limiting conformational change. The Journal of Biological Chemistry. 276, 3408-3416 (2001).
  13. Krishnamurthy, N., Haraguchi, K., Greenberg, M. M., David, S. S. Efficient removal of formamidopyrimidines by 8-oxoguanine glycosylases. Biochemistry. 47, 1043-1050 (2008).
  14. Leipold, M. D., Muller, J. G., Burrows, C. J., David, S. S. Removal of hydantoin products of 8-oxoguanine oxidation by the Escherichia coli DNA repair enzyme, FPG. Biochemistry. 39, 14984-14992 (2000).
  15. Zhao, X., Krishnamurthy, N., Burrows, C. J., David, S. S. Mutation versus repair: NEIL1 removal of hydantoin lesions in single-stranded, bulge, bubble, and duplex DNA contexts. Biochemistry. 49, 1658-1666 (2010).
  16. Leipold, M. D., Workman, H., Muller, J. G., Burrows, C. J., David, S. S. Recognition and removal of oxidized guanines in duplex DNA by the base excision repair enzymes hOGG1, yOGG1, and yOGG2. Biochemistry. 42, 11373-11381 (2003).
  17. Robey-Bond, S. M., Barrantes-Reynolds, R., Bond, J. P., Wallace, S. S., Bandaru, V. Clostridium acetobutylicum 8-oxoguanine DNA glycosylase (Ogg) differs from eukaryotic Oggs with respect to opposite base discrimination. Biochemistry. 47, 7626-7636 (2008).
  18. Jarem, D. A., Wilson, N. R., Delaney, S. Structure-dependent DNA damage and repair in a trinucleotide repeat sequence. Biochemistry. 48, 6655-6663 (2009).
  19. Livingston, A. L., Kundu, S., Henderson Pozzi, M., Anderson, W. D., David, S. S. Insight into the roles of tyrosine 82 and glycine 253 in the Escherichia coli adenine glycosylase MutY. Biochemistry. 44, 14179-14190 (2005).
  20. Kundu, S., Brinkmeyer, M. K., Livingston, A. L., David, S. S. Adenine removal activity and bacterial complementation with the human MutY homologue (MUTYH) and Y165C, G382D, P391L and Q324R variants associated with colorectal cancer. DNA Repair. 8, 1400-1410 (2009).
  21. Zharkov, D. O., Rosenquist, T. A. Inactivation of mammalian 8-oxoguanine-DNA glycosylase by cadmium(II): implications for cadmium genotoxicity. DNA Repair. 1, 661-670 (2002).
  22. Jarem, D. A., Wilson, N. R., Schermerhorn, K. M., Delaney, S. Incidence and persistence of 8-oxo-7,8-dihydroguanine within a hairpin intermediate exacerbates a toxic oxidation cycle associated with trinucleotide repeat expansion. DNA Repair. 10, 887-896 (2011).
  23. Mokkapati, S. K., Wiederhold, L., Hazra, T. K., Mitra, S. Stimulation of DNA glycosylase activity of OGG1 by NEIL1: functional collaboration between two human DNA glycosylases. Biochemistry. 43, 11596-11604 (2004).
  24. Sidorenko, V. S., Nevinsky, G. A., Zharkov, D. O. Mechanism of interaction between human 8-oxoguanine-DNA glycosylase and AP endonuclease. DNA Repair. 6, 317-328 (2007).

Tags

Kjemi biokjemi genetikk molekylærbiologi mikrobiologi Structural Biology Chemical Biology Eukaryota aminosyrer peptider og proteiner nukleinsyrer nukleotider og Nukleosider Enzymer og Coenzymes miljø-og biovitenskap (General) enzymologi rask slukke-flow aktive området titrering steady-state pre-steady-state single-omsetning kinetikk base excision reparasjon DNA glykosylasen 8-oxo-7 ,8-dihydroguanine 8-oxoG sekvensering
Steady-state, Pre-steady-state, og Single-omsetningen Kinetic måling for DNA glykosylase aktivitet
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Sassa, A., Beard, W. A., Shock, D.… More

Sassa, A., Beard, W. A., Shock, D. D., Wilson, S. H. Steady-state, Pre-steady-state, and Single-turnover Kinetic Measurement for DNA Glycosylase Activity. J. Vis. Exp. (78), e50695, doi:10.3791/50695 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter