Summary
קורסי זמן לפעילות glycosylase של glycosylase-DNA של 8 oxoguanine הם biphasic מפגין פרץ של היווצרות מוצר ושלב מצב יציב ליניארי. תוך שימוש בטכניקות להרוות-זרימה, פרץ וניתן למדוד את שיעורי המצב יציב, אשר תואמות לכריתה של 8-oxoguanine ושחרורו של glycosylase מ-DNA של המוצר, בהתאמה.
Abstract
אדם 8-DNA oxoguanine glycosylase (OGG1) בולה נגע DNA חמצוני מוטגניות 8-אוקסו 7 ,8-dihydroguanine (8-oxoG) מ-DNA. אפיון הקינטית של OGG1 נעשה כדי למדוד את שיעורי הכריתה 8-oxoG ושחרור מוצר. כאשר ריכוז OGG1 הוא נמוך יותר מאשר ה-DNA המצע, קורסים בזמן של היווצרות המוצר הם biphasic; שלב מעריכי מהיר (כלומר פרץ) של היווצרות מוצר ואחריו שלב מצב יציב ליניארי. פרץ הראשוני של היווצרות המוצר מתאים לריכוז של אנזים עוסק כראוי על המצע, ואת המשרעת פרץ תלויה בריכוזו של אנזים. השיעור ראשון הסדר הקבוע של פרץ מתאים לקצב הפנימי של כריתת 8-oxoG וקצב איטי יותר מצב יציב מודד את קצב שחרור מוצר (מוצר ה-DNA שיעור קבוע דיסוציאציה, K כבוי). כאן, אנו מתארים מצב יציב, מראש מצב יציב, ואחת גישות מחזור לבודד ולמדוד SPצעדי ecific במהלך רכיבה על אופניים OGG1 קטליטיים. Oligonucleotide המכיל נגע שכותרת ניאון וOGG1 מטוהרים משמשים כדי להקל על מדידות מדויקות הקינטית. מאז ריכוזי אנזים נמוכים משמשים לביצוע מדידות מצב יציב, הוראות ערבוב של חומרים כימיים ומרווה של התגובה ניתן לבצע כדי לברר את שיעור המצב יציב (k כבוי). בנוסף, ניפוח של שיעור המצב יציב לנקודה על ordinate בזמן אפס מציין כי פרץ של היווצרות מוצר התרחש במהלך המחזור הראשון (כלומר חיתוך-y הוא חיובי). ניתן למדידה בשיעור הקבוע מהסדר הראשון של שלב פרץ מעריכי בטכניקת ערבוב ומרווה מהירה הבוחנת את כמות המוצר שנוצר במרווחי זמן קצרים (<1 שניות) לפני שלב המצב יציב ומתאים לשיעור של 8 oxoG-כריתה (כלומר כימיה). הצעד הכימי גם ניתן למדוד באמצעות גישה יחידה שבו רכיבה על אופניים מחזור הקטליטי הואלמנוע על ידי דנ"א מצע להרוות עם אנזים (E> S). גישות אלו יכולות למדוד את קבועי קצב יסודיים המשפיעים על היעילות של הסרת נגע ה-DNA.
Introduction
סביבה אירובית ממהרת חוסר יציבות גנומית. נגע DNA promutagenic גדול כתוצאה מלחץ חמצוני הוא 7,8-dihydro-8-oxoguanine (8-oxoG). זאת בשל פוטנציאל הקידוד המעורפל של 8-oxoG. אדם 8-DNA oxoguanine glycosylase (OGG1) הוא אחראי לייזום תיקון כריתת בסיס של 8-oxoG. פעילות glycosylase של OGG1 בולה בסיס 8-oxoG וכתוצאה מכך ה-DNA של המוצר עם אתר apurinic (AP באתר). פעילות lyase חלשה של OGG1 יכולה לחתוך את AP באתר במקרים מסוימים.
אפיון הקינטית של glycosylases DNA בדרך כלל מגלה שהם מפגינים קורסי זמן biphasic. לאחר שלב ראשוני של היווצרות מהירה של מוצר (כלומר פרץ), שלב מצב יציב ליניארי הוא ציין 1-3. התנהגות זו מעידה על צעד בעקבות כימיה (שינוי קונפורמציה כלומר או שחרור מוצר) ששיעור הגבלה במהלך החלק ליניארית של הזמן כמובן, ואילו ספחתרח שלב, המכונה לעתים קרובות את השלב החולף, מתאים להיווצרות מוצר באתר הפעיל אנזים במהלך המחזור של התגובה הראשונה. כאשר שחרור המוצר הוא שיעור הגבלה בשלב המצב יציב, מדידות פעילות לספק מידה איכותית של זיקה המחייבת DNA של מוצר, אך אינו מספקות מידע בנוגע לאירועים בהקינטית אנזים האתר הפעיל (כלומר כימיה). בהתאם לכך, שיטות לבודד ולמדוד את שלב פרץ מראש מצב יציב מעריכי יש צורך לחקור אירועים במהלך המחזור האנזימטית הראשון בשעה 4 האתר הפעיל של האנזים.
קיימות שלוש גישות סטנדרטיות להקינטית מאפיינות את ההתנהגות הקטליטית של OGG1, (1) מצב יציב, (2) מראש מצב יציב, וכן (3) חד המחזור. גישות אלה שונות זו מזו על ידי הריכוז של אנזים בתערובת התגובה ואת האנזים ליחס מצע מנוצל בכל גישה. בגישת מצב יציב טיפוסי,מכונה קינטיקה תחלופה מרובות לפעמים, ריכוזים נמוכים של אנזים המשמשים למעקב היווצרות מוצר. ריכוז המצע עולה בהרבה על ריכוז האנזים כך שאיבודים אנזימטיות מרובים אינם משפיעים על ריכוז מצע באופן משמעותי. במצב זה, קורסי זמן צריכים להיות ליניארי, ולעתים קרובות קשה להבחין אם פרץ התרחש במהלך המחזור הראשון בשל ריכוז האנזים הנמוך בשימוש בגישה זו; לב שהמשרעת פרץ היא שווה ערך לריכוז האנזים. זו ניתן להתגבר על ידי שימוש בריכוז גבוה יותר והשערת אנזים כמובן הזמן ליניארי לאפס זמן כדי לזהות אם המחזור האנזימטית הראשון התרחש במהירות. ליירט בordinate (ציר y) צריך להיות פרופורציונלי לריכוז האנזים ומספק מידה מסוימת של האנזים מעורב באופן פעיל עם מצע. למרות שגישה זו יכולה באופן עקרוני לספק ראיות לקיומו של שלב פרץ, אונטערשיידגישה שונה שממפה נדרש למדוד את הקינטיקה של שלב פרץ. במקרים רבים שלב פרץ הוא מהיר מדי למדידה על ידי טכניקות ערבוב ומרווה ידניות. במצב זה, הקינטית מראש מצב יציב וחד מחזור (כלומר הקינטית חולף) מתקרב לעתים קרובות דורש מכשיר ערבוב מהיר ומרווה לעקוב אחרי נקודות זמן מוקדמות של תגובה 5. בגישה מראש מצב יציב ריכוזים גבוהים של אנזים נמצאים בשימוש, כך שכמות משמעותית של מוצר נוצר במהלך המחזור הראשון. מאז מחזורים מרובים ואחרי רכיבה על אופניים כדי לבחון קטליטי (כלומר השלב ליניארי שאחרי פרץ), ריכוז מצע גדול מריכוז האנזים ([אנזים] <[מצע]). לבודד אירועים באתר הפעיל של האנזים ללא רכיבה על אופניים קטליטי, תנאים יחיד מחזור מנוצלים. במקרה זה, מצע רווי באנזים (E >> S) כך שכל המצע ישתתףn 'התחלופה היחידה ", ובדרך כלל תפגין כמובן זמן יחיד מעריכים.
כפי שצוין לעיל לאנזימים כי תערוכת שלב פרץ, שחרור מוצר (k כבוי) לעתים קרובות מגביל את השיעור של השלב היציב של מהלך הזמן. קצב השחרור של מוצר (. / שעת V ss, קונצרט כלשהו) ניתן לקבוע מן המדרון של שלב המצב יציב ליניארי. ריכוז האנזים הפעיל (ה) יש צורך להמיר את קצב שחרור מוצר לקצב פנימי מתמיד כאשר k = v את ss / [E]. חשוב לציין, ריכוז האנזים הפעיל הוא בדרך כלל נמוך יותר מהריכוז שנמדד החלבון בשל זיהומים, האנזים פעיל, אנזים שאינם פרודוקטיבית חייב מצע, ואת השיטה המשמשת לקביעת ריכוז חלבון. ריכוז האנזים הפעיל ניתן לקבוע ממשרעת פרץ, כאשר שחרורו של המוצר הוא איטי. לפיכך, חיוץ כמובן זמן מצב יציב לזמן אפס מספק אומדן של האנזים הפעיל הדרושים כדי לחשב את K (שחרור מוצר) מהשיעור שנצפה המצב יציב.
כדי למדוד את הקינטיקה של פרץ, גישה מראש מצב יציב היא צורך לעקוב אחר היווצרות המוצר במהלך המחזור הראשון המתרחש לפני שלב המצב יציב ליניארי. קינטיקה הפרץ כדלקמן היווצרות אנזימים מוצר ביניים. ברגע שהתגובה היא שיזמה אנזים ערבוב עם מצע, את כמות אנזים התוצר מגבירה במהירות עד שהתגובה מגיעה שלב מצב יציב. אם קטליזה היא הרבה יותר מהיר מאשר שחרור מוצר, את המשרעת של פרץ שווה לאנזים מעורב באופן פעיל וגישת מעריכי שנצפו לשיווי משקל (K obs) מתאימה לשיעור ההמרה כימית של מצע למוצר, בהנחת שהשיעור ההפוך של כימיה היא זניחה.
בכמה מקרים CY קטליטינאחזים מפריע לניתוח מראש מצב יציב, כגון כאשר הבהירויות של שיעורי כימיה ושחרור המוצר אינן שונות באופן משמעותי. במקרה זה, העסקת קרוב משפחה אנזים עודף לרכיבה על אופניים מונעת מצע הקטליטי ומצע מגבלות כרוכות באנזים למחזור אחד. בהתאם לכך, הצעד הכימי הראשון של התגובה יכול להיות מבודד ונקבע במדויק כקבוע קצב מהסדר ראשון (k תצפיות). שיעור זה קבוע צריך להיות דומה לK obs נקבע מהגישה מראש המצב יציב שתוארה לעיל.
כאן אנו מתארים כיצד ניתן להשתמש בגישות אלה הקינטית לנתח את פעילות glycosylase של OGG1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. הכנה של אנזים ומצע DNA
- מעל מפורש OGG1 כחלבון GST-היתוך בE. coli, לנצל GST, התגית לטיהור, ולאחר מכן להסיר את GST-תג על ידי מחשוף עם HRV-3C פרוטאז (איור 1) 6.
- לרכוש מסונתז כימי oligonucleotide שכותרת גדיל oligonucleotide ללא תווית משלימה 5'-6-carboxyfluorescein (6-FAM) המכיל שאריות של 8 oxoG אחת ו. את oligonucleotides 34-mer מכיל 8-oxoG במיקום 17 מ5'-end. לטהר oligonucleotides אלה על ידי ג'ל אלקטרופורזה polyacrylamide.
- הכן את מצע גדילי הדנ"א כפול המכיל 8-oxoG ידי oligonucleotide ערבוב 5'-6-FAM שכותרתו עם הגדיל המשלים שלו ביחס טוחנת של 1:1.2 במאגר חישול (10 מ"מ טריס-HCl, pH 7.5, 50 מ"מ NaCl, 1 mM EDTA) בצינור 1.5 מיליליטר microfuge. מניחים את הצינור בלצוף במים רותחים למשך 5 דקות. השאר את הצינור למקום ולאחר מכן לתת את המים קרים באיטיות לימיןטמפרטורת Oom (זה לוקח כ 2 שעות).
- בצע הכנת מדגם והניסוי בתנאי תאורה נמוכה או מינימאלי כדי למזער photobleaching של תווית הניאון.
2. מדידה כמובן זמן מצב יציב וטיטרציה אתר פעילה של OGG1
2.1. הכנת מדגם וכמובן זמן מצב יציב
- הכן את מצע ה-DNA ופתרוני OGG1 בנפרד במאגר התגובה (50 HEPES מ"מ, pH 7.5, 20 מ"מ KCl, 0.5 mM EDTA, ו -0.1% אלבומין בסרום שור) ב1.5 צינורות microfuge מ"ל על קרח. הריכוז של ה-DNA של 400 ננומטר והריכוז לכאורה של OGG1 הוא 30, 60, 90, או 120 ננומטר, כפי שנקבעו על ידי assay חלבון ברדפורד. מניחים את צינורות התגובה בסט גוש חום על 37 ° C. אנזים טרום דגירה ופתרונות מצע DNA בנפרד על 37 מעלות צלזיוס במשך דקות 1.
- להתחיל את התגובה על ידי ערבוב כמויות שווה של את פתרונות מצע OGG1 וה-DNA על ידי pipetting. לאחר ערבוב solu אלהtions 1:1 (V / V), את הריכוזים הסופיים הם דנ"א 200 ננומטר ו 15, 30, 45, או 60 ננומטר OGG1, בהתאמה. הסר aliquots (10 μl) במרווחי זמן ולהרוות את התגובה על ידי ערבוב עם μl 1 של 1 M NaOH. כשליטה לקורסים בזמן, 10 μl של תערובת התגובה ללא אנזים הוא מעורבב עם μl 1 של 1 M NaOH.
- מניחים את דגימות תגובה ב90 ° גוש חום צלזיוס למשך 5 דקות לדבוק מוצר הסופי AP באתר. לאחר חימום, להוסיף μl 1 של 1 M HCl לנטרל מדגם זה.
- הוסף נפח שווה (12 μl) של חיץ טעינת ג'ל (לפוראמיד 95%, 20 מ"מ EDTA, 0.02% bromophenol, ו0.02% cyanol קסילן) לכל דגימת תגובה, ולאחר מכן הנח את התערובת בגוש חום נקבע על 95 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות, ואז למקם את הצינור מייד על קרח.
- טען את הדגימות (5 μl) על גבי 15% ג'ל המכיל אוריאה polyacrylamide denaturing ז 8 ב89 מ"מ טריס-HCl, pH 8.8, חומצה בור 89 מ"מ, 2 מ"מ וEDTA. את המוצרים בקעו המצע ומופרדים היטב לאחרפועל ג'ל.
2.2. הדמיה של ג'ל
- סרוק את הג'ל באמצעות imager שיכול לזהות את ה-DNA שכותרתו fluorescently ולדמיין את המצע ולהקות מוצר.
- לכמת את הלהקות לאחר ההדמיה ג'ל. שים לב שחלק מחשוף רקע אפשר לראות לאחר טיפול של המצע עצמו עם NaOH (איור 2 א). לחסר רקע זה מכמות המדודה של כל מוצר תגובה.
2.3. ניתוח נתונים
- להתוות את כמות המוצר שנוצרה בכל פעם תגובה (t) (איור 2). לנתח את נתוני הגלם באמצעות משוואה 1 כדי לקבוע את המשרעת של פרץ (0, חיתוך-y) והשיפוע של שלב המצב יציב ליניארית (V-SS).
- עלילהיחסית חיתוך-y לריכוז החלבון הכולל (ריכוז אנזים לכאורה כלומר; איור 2 ג), מתן מידה של החלק הפעיל של אנזים. השתמש בכושר ליניארי עם ליירט אפס לספק גורם התיקון לקביעת החלק של אנזים פעיל.
- עלילה שיעור המצב יציב יחסית לריכוז האנזים הפעיל (איור 2 ד), מתן לדרג את מוצר הניתוק קבוע (כלומר שיפוע של הקו המצויד).
3. מדידה כמובן זמן טרום מצב יציב
כפי שמוצג באיור 2, היווצרות מוצר בשלב פרץ הוא מהיר מדי למדידה על ידי ערבוב ומרווה ידני. לפיכך, מכשיר להרוות-זרימה מהירה יכול לספק שיטה רב עוצמה כדי למדוד תגובה מהירה המתרחשות בקנה מידת זמן אלפית השנייה (איור 3) 5. המכשיר משתמש במנוע מבוקר מחשב לערבב במהירותND להרוות את התגובות אחרי זמני תגובה מצוינים. כך, למשל, להשתמש באמצעי להרוות-Flow RQF-3 ראפיד Kintek למדוד את השלב הראשוני ושלב פרץ מצב יציב הבא של היווצרות מוצר catalyzed ידי OGG1. מכשירים להרוות-זרימה מהירות זמינים ממספר יצרנים.
3.1. הכנת המדגם
בנפרד להכין את מצע ה-DNA ופתרוני OGG1 בצינורות 1.5 מ"ל כפי שתואר ב2-1. הריכוזים של ה-DNA וOGG1 הפעיל הנן 400 ננומטר ו -80 ננומטר, בהתאמה. כתוצאה מכך ריכוזים סופיים של ה-DNA ו200 ננומטר 40 ננומטר OGG1 הפעיל לאחר ערבוב 1:1 (V / V).
3.2. הכנת המכשיר להרוות-זרימה מהירה
- חבר אמבט מים במחזור למכשיר להרוות-הזרימה המהיר לבקרת טמפרטורה (37 מעלות צלזיוס).
- להתאים את הפרמטרים של המכשיר ובחר את לולאת התגובה המתאימה לזמן הרצוי נקודות בהתאם להוראתו של היצרןtions. הלולאות הן התגובה של אורכים משתנים כדי לספק זמני תגובה חלופיים.
- הכן את חיץ תגובה וNaOH להרוות פתרונות ב10 מ"ל מזרקים luer נעל חד פעמי ולצרף המזרקים האלה ליציאות הכונן ולטעון את מאגרי הכונן עם מאגר התגובה (מזרקים B) ו142 מ"מ NaOH (מזרק ש) (שסתום טען מזרק בעמדת טעינה) . כדי להסיר את בועות אוויר מהמזרק, יעבדו פתרון הלוך ושוב כמה פעמים.
- מנמיכים את מנוע צעד עד שהוא קשר העליון של המזרקים (שסתומים טען מזרק וטען שסתומים לדוגמה בעמדת אש).
- לשטוף את לולאות לדוגמה, לולאת התגובה, ושורת סיום במים ומתנול. ייבש את האזורים הסמוקים לחלוטין (שסתומים בעמדת סומק).
3.3. כמובן זמן מראש מצב יציב
- לעשות חור בחלקו העליון של צינור כתרים 1.5 מ"ל באמצעות מחט 16 מד. צרף צינור בקו היציאה לאסוף את התגובה הרווה.
- הגדר את reactio הרצויזמן n (בשניות) באמצעות לוח המקשים. מנוע צעד יהיה לגבות להתאים לנפח לולאה כדי לשמור על נפח להרוות מתמיד. בוכנות עמדה עבור B המזרק נגד פלטפורמת מנוע צעד על ידי הוספת חיץ עם המזרקים חד פעמיים המחוברים ליציאות הכונן.
- מלא 1 מ"ל מזרקים luer נעל חד פעמי עם מצע ה-DNA ופתרוני OGG1, בהתאמה (שסתומים לדוגמה בעמדת טעינה). צרף מזרקים עם מצע ה-DNA וOGG1 פתרונות לכל אחת מיציאות טעינת המדגם, ולאחר מכן למלא את לולאות לדוגמה עם מצע ה-DNA ופתרוני OGG1, בהתאמה (לדוגמה טען שסתום בעמדת טעינה).
- כוון את כל השסתומים טען מזרק וטען שסתומים לדוגמה למצב האש. התחל את התגובה על ידי שבץ לוח מקשים (עיתונות לדוגמה של "G" או על מקש "התחל"). מצע ה-DNA ופתרוני OGG1 (18 μl כל אחד) מעורבבים באופן מיידי בלופ התגובה.
- חכה עד שהתגובה הוא רווה באופן אוטומטי בזמן התגובה הרצוי על ידי ערבוב של 36 μl Rתערובת eaction עם 86 μl של 142 מ"מ NaOH. לאחר מרווה התגובה, המדגם ריקה מהקו היציאה.
- הגדר את סתום טען מזרק לעמדת הטעינה וטען שסתום לדוגמא לעמדת הסומק. לשטוף את לולאות לדוגמה, לולאת התגובה, ושורת סיום במים ומתנול ולייבש כמתואר ב3.2. חזור על התהליך לעיל לכל נקודת זמן.
- לבצע ניסוי שליטה ללא אנזים כדי לקבוע תיקון רקע, אשר יכול להיעשות באופן ידני או עם המכשיר מהיר להרוות. כדי לבצע בקרה עם המכשיר מהיר להרוות, למלא את לולאת דגימת DNA עם מצע לדנ"א אבל לשמור לולאת דוגמה עבור OGG1 ריק. הגדר את זמן התגובה, לבצע את התמהיל ולהרוות כפי שמתואר ב3.3.4-3.3.6.
- שטוף את לולאות לדוגמה ואת לולאת התגובה עם 2 M NaOH, 2 M HCl, מים ומתנול ולאחר מכן לייבש את קווי שטף. לאחר הגדרת מנוע צעד לעמדת הבית, לעבור את סתום טען מזרק כדי positio העומסn ולשטוף את הכונן עם מאגרי מים.
- פנק את הדגימות הרווות תגובה עם חום, ולאחר מכן מצע נפרד וה-DNA של המוצר ב -15% denaturing ג'ל אלקטרופורזה polyacrylamide כפי שמתואר ב2.1.
- לחזות ולכמת את הלהקות על הג'ל כמתואר ב2.2.
3.4. ניתוח נתונים
להתאים את הקורסים בזמן של היווצרות מוצר על ידי ניתוח רגרסיה ליניארי למשוואה עם עלייה במונחי מעריכי וליניארית (משוואה 2) מספקים שיעור מהסדר הראשון הקבוע (K obs), המשרעת של פרץ (0), ו שיעור ליניארי (V-SS).
4. כמובן זמן יחיד מחזור
- הכן את ה-DNA ומצע OGG1 בצינורות 1.5 מ"ל נפרד כמתואר ב2-1. הריכוזtions של ה-DNA וOGG1 הפעיל הנן 100 ננומטר ו 500 ננומטר, בהתאמה; זה מניב ריכוזים סופיים של ה-DNA ננומטר 50 ננומטר ו250 OGG1 לאחר ערבוב 1:1 (V / V).
- הכן את המכשיר להרוות-הזרימה המהירה ולהכין את דגימות התגובה, כמתואר ב3.2 ו -3.3.
- פנק את דגימות תגובה הרווות עם חום ולייחד להם עד 15% denaturing ג'ל אלקטרופורזה polyacrylamide למוצרי מצע ונפרד כמתואר ב2.1.
- לחזות ולכמת את הלהקות על הג'ל כמתואר ב2.2.
- להתאים את הקורסים בזמן של היווצרות מוצר לאחד מעריכי לקבוע שיעור קבוע מהסדר הראשון (K obs) כנתון במשוואה 3.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ניתוח הקינטית מצב יציב בוצע על ידי שימוש במצע DNA ננומטר 200 וארבעה ריכוזים שונים של OGG1 לכאורה (15, 30, 45, ו -60 ננומטר), כפי שנקבע על ידי רדפורד assay חלבון 2. את הקורסים בזמן של היווצרות מוצר שיתאימו למשוואה ליניארית כדי לקבוע 26 ננומטר, בהתאמה, ביחס לכל ריכוז חלבון (איור 2) החיתוך-y, שהיו 2.2, 11, 15, ו. ה-Y מיירט נוסף היו זמם ביחס לכל ריכוז חלבון בפועל (איור 2 ג). החלק של אנזים פעיל נקבע להיות 38% מהשיפוע של הקו באיור 2 ג. כדי לקבוע את שיעור המצב יציב, שנקבע מהתקפי יניארי באיור 2 ב V ss היו זמם ביחס ל-y מיירט (איור 2 ד). השיפוע של הקו באיור 2D היה 0.0028 שניות -1, שהוא שווה ערך לשיעור קבוע דיסוציאציהלמוצר AP אתר וחרות באתר שהוקם על ידי AP-DNA glycosylase פעילויות / lyase.
כמובן זמן מראש מצב יציב בעקבות שימוש במצע DNA ננומטר 200 ננומטר פעילים ו40 OGG1. את הקורסים בזמן של היווצרות המוצר ניתן להתאים למשוואה עם תנאי מעריכי וליניארי עולים. כפי שניתן לראות באיור 4, K ו-K את התצפיות היו נחוש להיות 0.75 שניות -1 ו0.0055 שניות -1, בהתאמה 2. המשרעת לשלב פרץ (33 ננומטר) הייתה מעט נמוכה מצפוי מהריכוז של OGG1 הפעיל הוסיף (40 ננומטר). זה יכול להיות בגלל כריכה ספציפיות של OGG1 למצע ה-DNA המפחית את המספרים הזמינים של מולקולות אנזים.
בתנאים יחיד מחזור, תגובת כריתת 8-oxoG הסתיימה בתוך 6 שניות (איור 5) 2. מהלך הזמן של היווצרות מוצר יכול להיות כשיר לאחד מעריכימשוואה והניב K obs של 0.74 שניות -1. יש לציין, משרעת להיווצרות המוצר היה נמוך מהצפויים 50 ננומטר הוסיפו מצע ה-DNA. זה היה יכול להיות בין שאר כתוצאה מחשוף רקע של ה-DNA על ידי NaOH טיפול (איור 2 א) או הנוכחות של oligonucleotides מצע unannealed בתערובת התגובה.
איור 1. טיהור של OGG1 אדם מא coli. OGG1 הגן האנושי היה משובטים לpGEX-6P-1 וביטוי יתר בBL21 (DE3) תאים. ליין 1; תאי uninduced, ליין 2; תאים המושרה IPTG, מסלול 3; שברים חלבון מסיסים, מסלול 4; גלוטתיון Sepharose 4B לאחר דגירה עם שבריר חלבון מסיס, מסלול 5; לזרום דרך שבריר לאחר דגירה של גלוטתיון Sepharose 4B עם HRV 3זרימה דרך שבריר לאחר הסרת מזהמים לפי עמודת Q מונו; C פרוטאז, 6 נתיבים. תצלום של ג'ל הצבעוני הכחול Coomassie מוצג.
איור 2. קינטיקה מצב יציב וטיטרציה אתר פעילה של מטוהרים OGG1 2 OGG1 (15 ננומטר, ○, 30 ננומטר, 45 ננומטר, □, ◊; או 60 ננומטר, ×). הודגר עם 200 מצע DNA ננומטר (5'-X CTGCAGCTGATGCGCC TACGGATCCCCGGGTAC -3 ', כאשר X הוא 8-oxoG יחד עם C) על 37 מעלות צלזיוס למשך 1-30 דקות כפי שצוין. ריכוזי אנזימים אלה מייצגים ריכוזי חלבון לכאורה המבוססים על assay החלבון ברדפורד, נבדקים ומעקומת סטנדרט BSA., Denaturing ג'ל polyacrylamide מראה מצעים מופרדים (S) ומוצרים (P). OGG1 (30 ננומטר) ו200 ננומטר D מצע NA שימש לתגובה. ב ', קורסים בזמן של היווצרות מוצר. הנתונים שיתאימו למשוואה ליניארית כדי לקבוע את המשרעת של שלב פרץ (חיתוך-y) ושיעור ניכר של שחרור מוצר (שיפוע). C, עלילה של מיירט נקבע מהתקפי יניארי בלוח ב 'ביחס לזה שנקבע על ידי assay ברדפורד. השיפוע של הקו מתאים לכל החלק של אנזים פעיל. בר השגיאה מציין את השגיאה במשרעת המשתמעות מהתקפי יניארי להיווצרות המוצר בלוח ב '. ד', עלילה של המדרונות נקבעו מהתקפי יניארי בלוח ב 'ביחס לריכוז האנזים הפעיל. בר השגיאה מציין את השגיאה בשיפוע המשתמע מהתקפי יניארי להיווצרות המוצר בלוח ב '. השיפוע של הקו מקביל לשיעור המצב יציב (k כבוי), 0.0028 שניות -1.
איור 3. סקירה כללית של מכשיר להרוות-זרימה מהירה.
איור 4. קינטיקה טרום יציב של כריתת 8-oxoG ידי OGG1 2. OGG1 (40 ננומטר אנזים פעיל) הודגר עם 200 מצע DNA ננומטר (5'-X CATGGGCGGCATGAACC GAGGCCCATCCTCACC-3 ", כאשר X הוא 8-oxoG יחד עם C) ב 37 מעלות צלזיוס במשך 0-100 שניות. הקו המקווקו מציין ניפוח של שלב המצב יציב. הנתונים שיתאימו למשוואת פרץ עם המשרעת שווה 33 ± 0.89 ננומטר, K תצפיות שווה ל -0.75 ± 0.083שנייה -1, V S S שווה ל -0.18 ± 0.018 שניות ננומטר -1 ואת k שווה ל 0.0055 ± 0.020 שניות -1.
איור 5. קינטיקה מחזור אחד של כריתת 8-oxoG ידי OGG1 2. OGG1 (אנזים 250 ננומטר פעילים) הודגר עם 50 מצע DNA ננומטר (5'-X CTGCAGCTGATGCGCC TACGGATCCCCGGGTAC-3 ", כאשר X הוא 8-oxoG יחד עם C) על 37 מעלות צלזיוס למשך 0-60 שניות. הנתונים שיתאימו למשוואה מעריכית היחידה עם K obs שווה 0.74 ± 0.015 שניות -1. הקו המקווקו מציין את המשרעת אקסטרפולציה (כלומר מוצר בזמן אינסופי).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
את הקינטית הגישות מתוארות כאן מתארים שיטות להגדרת קבועים קינטיים יסודיים. אם מהלך זמן של היווצרות המוצר הוא biphasic עם המחזור הראשון האנזימטית מתרחש במהירות, ולאחר מכן צעד אחרי הכימיה הוא שיעור הגבלה במהלך מחזורים קטליטיים שלאחר מכן. במקרה של OGG1, ניתן למדוד את המחזור הראשון באמצעות ריכוזי אנזים גבוהים עם או הגבלה (S <E) או (S> E גבוהה) ריכוזי ה-DNA. במקרה הראשון, התגובה מוגבלת ל 'יחיד מחזור' ומספקת מדד של שיעור קטליטי באתר הפעיל של האנזים. במקרה האחרון, מחזורים אנזימטיות מרובים מוערכים. פרץ של היווצרות מוצר המתרחשת במהלך המחזור הראשון מספק מדד של האירוע הכימי באתר הפעיל של האנזים, ואילו מחזורים שלאחר מכן לספק מידה של הצעד שמגביל את רכיבה על אופניים קטליטי. בנוסף, את המשרעת של פרץ של היווצרות המוצר מספקת מידה מסוימת של אנזים מעורב באופן פעיל. זה חייב להיות ידוע על מנת לחשב את השיעור קבוע ממוצר דיסוציאציה מהירות המצב יציב (k = v את ss / E). לOGG1, על שחרורו של ה-DNA של המוצר (כלומר שיעור ה-DNA של מוצר ניתוק קבוע) מגביל את רכיבה על אופניים קטליטי ושיעור המצב היציב שלה 7,8. כפי שניתן לראות באיור 4, מוצר שיעור ה-DNA הניתוק הקבוע (k = 0.0055 שניות את -1) לOGG1 הוא בשני סדרי גודל נמוך יותר מהשיעור שנצפה קטליטי (K obs = 0.75 שניות -1). זוהי תכונה נפוצה הקינטית של glycosylases DNA שבסיסי DNA פגום בלו כדי לאגד את המוצרים שלהם (DNA עם אתר abasic) בחוזקה, כך ששחרורו של המוצר הוא שיעור הגבלה במהלך מדידות מצב יציב 1,8-10. חשוב לציין, מדידות פעילות מצב יציב ובכך מספקות דרך פשוטה וישירה כדי לקבוע זיקה מחייבת DNA מוצר; פעילות נמוכה מרמזת ב מוצר הדוק יותרinding.
כמתואר באיור 2 ונציג תוצאות, החלק הפעיל של אנזים נקבע להיות 38%. החלק הפעיל הוא נמוך יותר מזה שנקבע מריכוז החלבון, למרות שהאנזים המוכן הוא> הומוגנית 95% (איור 1). זה יכול להיות בגלל המחייב הלא הספציפי של האנזים על המצע ו / או בשיטה של קביעת חלבון שלא יכול להעריך במדויק את ריכוז החלבון האמיתי (assay החלבון ברדפורד לדוגמה משתמש בדרך כלל בסרום שור אלבומין כסטנדרט שלא יכול להיות טוב לחקות לאנזים של עניין). לחלופין, ניתן לקבוע ריכוז חלבון בשיטות אחרות או מוערך ממקדמי הכחדה טוחנים מחושבים לפי 280 ננומטר כגון שפותח על ידי גיל ופון היפל 11.
כפי שניתן לראות באיורים 4 ו 5, את סדר הגודל של K obs נקבעו הלוך ושובמ 'כמובן הזמן מראש המצב יציב צריכים להיות בקנה אחד עם שנקבע מניסוי יחיד מחזור. הערך של k את צריך להיות גם בניסוי עקבי בין שיטות הקינטיות חלופיות. אם, לעומת זאת, קבועי קצב האלה הם שונים (לדוגמה: את K הוא שונה בין תנאי מצב יציב ומראש מצב יציב), שלבים שונים ניתן למדוד על ידי כל אחת משיטות ויש לשקול מודל חדש. לחלופין, עיכוב מוצר או דלדול מצע יכול להשפיע על שיעור המצב יציב לכאורה בקורס זמן מראש מצב יציב שמזהם את החלק ליניארי.
במצב שבו פרץ ושלבי המצב יציב אינם מופרדים היטב (כלומר K obs ~ k כבוי), את המשרעת של פרץ וקבועי השיעור שנצפו הם מרוכבים של קבועי קצב יסודיים למספר שלבים 12. יתר על כן, שחרורו, אם המוצר הוא מהיר (כלומר K obs את> k), מהלך הזמן של היווצרות המוצר אינו biphasic (המחזור ראשון ומחזורים שלאחר מכן מוגבלים על ידי אותו צעד, כימיה). במקרה זה, ניסוי יחיד מחזור יכול לספק מידה של קטליזה.
אם גישה יחידה מחזור נעשית כדי לקבוע שיעור קטליטי מהותי, יש להשתמש באנזים מספיק כדי להבטיח שאינו מחייבות באופן חלקי שיעור מגביל. כמו כן, מצע מחייב גם חייב להיות מהיר כדי ששיעור פרץ אינו מוגבל על ידי קשירת מצע. כדי לוודא שלא מחייב אנזים שער הגבלה במהלך ניסוי יחיד מחזור, כמובן הזמן חוזר על עצמו עם ריכוז אנזים שונה כדי לוודא שמהלך זמן מעריכי לא משתנה. בנוסף, מאז את המשרעת של פרץ כמובן הזמן או חד מחזור היא ביחס ישר לאנזים או ריכוז מצע, בהתאמה, יש לבחור בריכוזים אלה שלo הם ניתנים למדידה באופן מהימן. לבסוף, יש לציין כי כאשר שיעורי הפרץ ומצב יציב אינם מופרדים היטב, משרעת פרץ underestimates ריכוז האנזים הפעיל האמיתי 12.
קינטיקה הגישות שתוארו לעיל לספק שיטה אמינה לבודד את השלבים עיקריים בעת רכיבה על אופניים קטליטי של glycosylases DNA. עם קבועים קינטיים התייחסות לאלה, השפעתו של רצף ה-DNA / מבנה 1,13-18 שינה, יכולה כעת להיות מוערכים שאריות פעילה באתר 19,20, 21 יונים מתכת, או חלבון אבזר הסלולר בקטליזה או רכיבה על אופניים אנזים 22-24.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
יש מחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
אנו מודים לד"ר ג'ולי ק הורטון לקריאה ביקורתית של כתב היד וRajendra פראסאד ד"ר להצעות ודיונים מועילים. חלקים ממחקר זה פורסמו במקור בכתב העת לכימיה ביולוגית, סאסא ואחרים. אל., "השפעות רצף ה-DNA הקשר על פעילות Glycosylase של Glycosylase-DNA של 8 Oxoguanine האנושי". J Biol Chem. 287, 36,702-36,710 (2012) 2. עבודה זו נתמכה, במלואו או בחלקו, על ידי המכונים הלאומי לבריאות מחקר פרויקט גרנט Z01-ES050158 בתכנית המחקר העירוני, NIEHS.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent/Material | |||
| 5’-6-FAM labeled oligonucleotides containing a single 8-oxoG | Eurofins MWG Operon | 5’-P32 radiolabeled oligonucleotides can be used as well. Polyacrylamide gel purification grade is recommended. | |
| Unlabeled oligonucleotides (complementary strand) | Eurofins MWG Operon | Polyacrylamide gel purification grade is recommended. | |
| 1 ml BD Luer Lock disposable syringe | BD Medical | 309628 | Lue Lock disposable syringe from other vendors can be used as well. |
| 10 ml BD Luer Lock disposable syringe | BE Medical | 309604 | Luer Lock disposable syringe from other vendors can be used as well. |
| Equipment | |||
| Circulating water bath | Any vender | ||
| RQF-3 Rapid Quench-Flow Instrument | KinTek Corporation | Rapid Quench-Flow Instrument from other vendors can be used as well. | |
| Typhoon Phosphorimager 8600 | GE Healthcare Life Sciences | Imager from other vendors can be used as well. | |
| KaleidaGraph | Synergy Software | ||
References
- Porello, S. L., Leyes, A. E., David, S. S. Single-turnover and pre-steady-state kinetics of the reaction of the adenine glycosylase MutY with mismatch-containing DNA substrates. Biochemistry. 37, 14756-14764 (1998).
- Sassa, A., Beard, W. A., Prasad, R., Wilson, S. H. DNA sequence context effects on the glycosylase activity of human 8-oxoguanine DNA glycosylase. The Journal of Biological Chemistry. 287, 36702-36710 (2012).
- Wong, I., Lundquist, A. J., Bernards, A. S., Mosbaugh, D. W. Presteady-state analysis of a single catalytic turnover by Escherichia coli uracil-DNA glycosylase reveals a "pinch-pull-push" mechanism. The Journal of Biological Chemistry. 277, 19424-19432 (1074).
- Johnson, K. A. Advances in transient-state kinetics. Current Opinion in Biotechnology. 9, 87-89 (1998).
- Johnson, K. A. Rapid kinetic analysis of mechanochemical adenosinetriphosphatases. Methods in Enzymology. 134, 677-705 (1986).
- Kovtun, I. V., et al. OGG1 initiates age-dependent CAG trinucleotide expansion in somatic cells. Nature. 447, 447-452 (2007).
- Hill, J. W., Hazra, T. K., Izumi, T., Mitra, S. Stimulation of human 8-oxoguanine-DNA glycosylase by AP-endonuclease: potential coordination of the initial steps in base excision repair. Nucleic Acids Research. 29, 430-438 (2001).
- Zharkov, D. O., Rosenquist, T. A., Gerchman, S. E., Grollman, A. P. Substrate specificity and reaction mechanism of murine 8-oxoguanine-DNA glycosylase. The Journal of Biological Chemistry. 275, 28607-28617 (2000).
- Waters, T. R., Swann, P. F. Kinetics of the action of thymine DNA glycosylase. The Journal of Biological Chemistry. 273, 20007-20014 (1998).
- Nilsen, H., et al. Excision of deaminated cytosine from the vertebrate genome: role of the SMUG1 uracil-DNA glycosylase. The EMBO Journal. 20, 4278-4286 (2001).
- Gill, S. C., von Hippel, P. H. Calculation of protein extinction coefficients from amino acid sequence data. Analytical Biochemistry. 182, 319-326 (1989).
- Van de Berg,, Beard, B. J., A, W., Wilson, S. H. DNA structure and aspartate 276 influence nucleotide binding to human DNA polymerase beta. Implication for the identity of the rate-limiting conformational change. The Journal of Biological Chemistry. 276, 3408-3416 (2001).
- Krishnamurthy, N., Haraguchi, K., Greenberg, M. M., David, S. S. Efficient removal of formamidopyrimidines by 8-oxoguanine glycosylases. Biochemistry. 47, 1043-1050 (2008).
- Leipold, M. D., Muller, J. G., Burrows, C. J., David, S. S. Removal of hydantoin products of 8-oxoguanine oxidation by the Escherichia coli DNA repair enzyme, FPG. Biochemistry. 39, 14984-14992 (2000).
- Zhao, X., Krishnamurthy, N., Burrows, C. J., David, S. S. Mutation versus repair: NEIL1 removal of hydantoin lesions in single-stranded, bulge, bubble, and duplex DNA contexts. Biochemistry. 49, 1658-1666 (2010).
- Leipold, M. D., Workman, H., Muller, J. G., Burrows, C. J., David, S. S. Recognition and removal of oxidized guanines in duplex DNA by the base excision repair enzymes hOGG1, yOGG1, and yOGG2. Biochemistry. 42, 11373-11381 (2003).
- Robey-Bond, S. M., Barrantes-Reynolds, R., Bond, J. P., Wallace, S. S., Bandaru, V. Clostridium acetobutylicum 8-oxoguanine DNA glycosylase (Ogg) differs from eukaryotic Oggs with respect to opposite base discrimination. Biochemistry. 47, 7626-7636 (2008).
- Jarem, D. A., Wilson, N. R., Delaney, S. Structure-dependent DNA damage and repair in a trinucleotide repeat sequence. Biochemistry. 48, 6655-6663 (2009).
- Livingston, A. L., Kundu, S., Henderson Pozzi, M., Anderson, W. D., David, S. S. Insight into the roles of tyrosine 82 and glycine 253 in the Escherichia coli adenine glycosylase MutY. Biochemistry. 44, 14179-14190 (2005).
- Kundu, S., Brinkmeyer, M. K., Livingston, A. L., David, S. S. Adenine removal activity and bacterial complementation with the human MutY homologue (MUTYH) and Y165C, G382D, P391L and Q324R variants associated with colorectal cancer. DNA Repair. 8, 1400-1410 (2009).
- Zharkov, D. O., Rosenquist, T. A. Inactivation of mammalian 8-oxoguanine-DNA glycosylase by cadmium(II): implications for cadmium genotoxicity. DNA Repair. 1, 661-670 (2002).
- Jarem, D. A., Wilson, N. R., Schermerhorn, K. M., Delaney, S. Incidence and persistence of 8-oxo-7,8-dihydroguanine within a hairpin intermediate exacerbates a toxic oxidation cycle associated with trinucleotide repeat expansion. DNA Repair. 10, 887-896 (2011).
- Mokkapati, S. K., Wiederhold, L., Hazra, T. K., Mitra, S. Stimulation of DNA glycosylase activity of OGG1 by NEIL1: functional collaboration between two human DNA glycosylases. Biochemistry. 43, 11596-11604 (2004).
- Sidorenko, V. S., Nevinsky, G. A., Zharkov, D. O. Mechanism of interaction between human 8-oxoguanine-DNA glycosylase and AP endonuclease. DNA Repair. 6, 317-328 (2007).
