Summary
Tidsforløb for glycosylase aktivitet af 8-oxoguanine DNA-glycosylase er bifasisk udviser en byge af produktdannelse og en lineær steady state fase. Ved hjælp quench-flow teknikker burst og steady state satser kan måles, der svarer til excision 8-oxoguanine og frigivelse af glycosylase fra produktet DNA, hhv.
Abstract
Human 8-oxoguanine DNA-glycosylase (OGG1) udskærer den mutagene oxidativ DNA læsion 8-oxo-7 ,8-dihydroguanine (8-oxoG) fra DNA. Kinetisk karakterisering af OGG1 foretages for at måle satserne for 8-oxoG excision og produktudvikling udgivelse. Når OGG1 koncentrationen er lavere end substrat-DNA, tidsforløb for produktdannelse er bifasisk, en hurtig eksponentiel fase (dvs. burst) produkt dannelse efterfølges af en lineær steady state fase. Den initielle afgivelse af produkt dannelse svarer til koncentrationen af enzymet i korrekt indgreb på substratet, og burst amplitude afhænger af koncentrationen af enzym. Den første ordens hastighedskonstant for burst svarer til den spontane frekvens af 8-oxoG udskæring og den langsommere steady-state rate måler hastigheden af produktets frigivelse (produkt-DNA dissociationshastighed konstanten k slukket). Her beskriver vi steady-state, præ-steady-state, og single-omsætningen tilgange til at isolere og måle specific trin under OGG1 katalytiske cykling. En fluorescerende mærkede læsion-holdigt oligonukleotid og oprensede OGG1 anvendes til at fremme nøjagtige kinetiske målinger. Da lave enzymkoncentrationer bruges til at lave steady-state målinger, manuel blanding af reagenser og standsning af reaktionen kan udføres for at fastslå steady-state rate (koff). Derudover ekstrapolation af steady-state sats til et punkt på ordinaten på nul tid indikerer, at et udbrud af produktets dannelse opstod under den første omsætning (dvs. y-aksen er positiv). Den første ordens hastighedskonstant af den eksponentielle burst fase kan måles ved hjælp af en hurtig blanding og afkølende teknik, der undersøger den mængde produkt, der dannes med korte tidsintervaller (<1 sek), inden steady state fase og svarer til den sats på 8 -oxoG excision (dvs. kemi). Den kemiske trin kan også måles ved hjælp af en enkelt-omsætning tilgang, hvor katalytisk cykling erforebygges ved at mætte substrat DNA med enzym (E> S). Disse metoder kan måle elementære hastighedskonstanter, der påvirker effektiviteten af fjernelsen af en DNA-læsion.
Introduction
En aerob miljø iler genomisk ustabilitet. En stor promutagenic DNA læsion som følge af oxidativt stress er 7,8-dihydro-8-oxoguanine (8-oxoG). Dette skyldes den tvetydige kodning potentiale 8-oxoG. Humant 8-oxoguanine DNA glycosylase (OGG1) er ansvarlig for at iværksætte bunden excision reparation af 8-oxoG. Den glycosylase aktivitet OGG1 udskærer den 8-oxoG bund resulterer i produkt-DNA med et apurin stedet (AP-site). En svag lyaseaktivitet af OGG1 kan incise AP-stedet i nogle tilfælde.
Kinetisk karakterisering af DNA glycosylaser generelt finder, at de udviser bifasisk tidsforløb. Efter en indledende hurtig fase af produktets dannelse (dvs. burst) er en lineær steady state fase observeret 1-3. Denne adfærd er tegn på et skridt efter kemi (dvs. konformationsændring eller produkt frigivelse) er hastighedsbegrænsende i den lineære del af tidsforløbet, hvorimod boretførste fase, der ofte omtales som den forbigående fase, svarer til produktdannelse på enzymet aktive sted under den første cyklus af reaktionen. Når produktet udgivelse er hastighedsbegrænsende under steady-state fase aktivitet målinger giver en kvalitativ måling af produktets DNA bindingsaffinitet, men giver ikke kinetisk oplysninger vedrørende begivenheder på enzymet aktive site (dvs. kemi). Derfor er metoder til at isolere og måle den eksponentielle præ-steady state burst fase er nødvendig for at undersøge begivenheder i den første enzymatiske omsætning på enzymets aktive site 4..
Der er tre standard kinetiske metoder til at karakterisere den katalytiske adfærd OGG1, (1) steady state (2) pre-steady-state, og (3) single-omsætning. Disse metoder adskiller sig fra hinanden ved koncentrationen af enzymet i reaktionsblandingen, og enzymet og substrat anvendt i hver fremgangsmåde. I en typisk steady state fremgangsmåde,undertiden benævnt multiple omsætning kinetik, er lave koncentrationer af enzym, der anvendes til at følge produktet formation. Substratkoncentrationen langt overstiger enzymkoncentrationen således at multiple enzymatiske omsætning ikke væsentligt påvirker substratkoncentration. I denne situation bør tidsforløbet være lineær og det er ofte vanskeligt at skelne, om et udbrud fandt sted i første omsætning på grund af den lave enzymkoncentration anvendes i denne fremgangsmåde, bemærk at briste amplitude svarer til enzymkoncentration. Dette kan overvindes ved at anvende en højere enzymkoncentration og ekstrapolere den lineære tidsforløb til nul tid til at detektere, om den første enzymatiske omsætning forekom hurtigt. Skæringspunktet på ordinaten (y-aksen), bør være proportional med enzymets koncentration og tilvejebringer et mål for enzymet aktivt engageret med substrat. Selv om denne fremgangsmåde kan i princippet give bevis for eksistensen af en burst fase en difderledes fremgangsmåde er påkrævet for at måle kinetikken af burst fase. I mange tilfælde burst fase er for hurtig til at måle ved manuel blanding og standsning teknikker. I denne situation, nærmer præ-steady-state og enkelt omsætning kinetiske (dvs. forbigående kinetisk) kræver ofte en hurtig blanding og afkølende instrument til at følge tidlige tidspunkter af en reaktion 5.. I en præ-steady-state tilgang høje koncentrationer af enzym anvendes således, at en betydelig mængde af produktet dannes under den første omsætning. Da flere omsætninger følges at observere katalytisk cykling (dvs. den lineære fase, der følger burst), substratkoncentration er større end den enzymkoncentration ([enzym] <[substrat]). At isolere begivenheder på det aktive site af enzymet uden katalysator cykling, er single-omsætning betingelser udnyttet. I dette tilfælde er substrat mættet med enzym (E >> S), således at alle underlaget vil deltage in det »indre omsætning« og vil typisk udvise en enkelt eksponentiel tidsforløb.
Som bemærket ovenfor for enzymer, der udviser en burst fase produkt release (k off) ofte begrænser hastigheden af steady-state fase af tidsforløbet. Hastigheden af produktets frigivelse (v ss, koncentreret. / Tid) kan bestemmes ud fra hældningen af den lineære steady state fase. Den aktive enzym koncentration (E), der er nødvendig for at konvertere hastigheden af produktets frigivelse til en iboende hastighedskonstant hvor k off = v ss / [E]. Vigtigere er det, aktive enzymkoncentration er typisk lavere end den målte proteinkoncentration grund urenheder, inaktive enzym, enzym ikke-produktivt bundet til underlaget, og den anvendte metode til at bestemme proteinkoncentration. Den aktive enzym koncentration kan bestemmes ud fra burst amplitude, når produktet release er langsom. Således ekstrapolere en steady-state tidsforløb tiltiden nul giver et skøn over aktivt enzym nødvendige for at beregne koff (produkt frigivelse) fra den observerede steady-state hastighed.
At måle kinetikken af burst, en præ-steady-state tilgang er nødvendigt at følge produktet dannelse under den første omsætning, der finder sted før den lineære steady state fase. Burst kinetik følger dannelsen af enzym-produkt mellemprodukt. Når reaktionen er initieret ved at blande enzym med substrat, mængden af enzym-produkt stiger hurtigt indtil reaktionen når en steady state fase. Hvis katalyse er langt hurtigere end produkt udgivelse, amplituden af burst er lig med aktivt engageret enzym og den observerede eksponentielle tilgang til ligevægt (k obs) svarer til hastigheden af kemisk omdannelse af substrat til produkt, forudsat at den omvendte sats kemi er ubetydelig.
I nogle tilfælde katalytisk cyklamre forstyrrer en pre-steady-state analyser, som når omfanget af satser for kemi og produkt udgivelse ikke er væsentligt anderledes. I dette tilfælde forhindrer anvendelse overskydende enzym i forhold til substrat katalytisk cykling og grænser substrat bundet med enzym til en enkelt omsætning. Følgelig kan den første kemiske reaktionstrin isoleres og nøjagtigt som den første ordens hastighedskonstant (k obs.). Denne hastighedskonstant bør svare til k obs. bestemt ud fra præ-steady-state ovenfor beskrevne fremgangsmåde.
Her beskriver vi, hvordan disse kinetiske metoder kan anvendes til at analysere glycosylase aktivitet OGG1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1.. Fremstilling af enzym og DNA Substrat
- Overudtrykker OGG1 som et GST-fusionsprotein i E. coli udnytte GST-tag for rensning, og fjern derefter GST-tag ved spaltning med HRV-3C protease (figur 1) 6.
- Købe kemisk syntetiseret 5'-6-carboxyfluorescein (6-FAM) mærket oligonucleotid indeholdende en enkelt 8 oxoG rest og dens komplementære umærket oligonukleotidstreng. De 34-mer oligonucleotider indeholder en 8-oxoG ved position 17 fra 5'-enden. Renses disse oligonukleotider ved polyacrylamidgelelektroforese.
- Forbered dobbeltstrenget DNA substrat indeholdende 8-oxoG ved at blande 5'-6-FAM mærket oligonukleotid med sin komplementære streng i et molforhold på 1:1,2 i annealing-puffer (10 mM Tris-HCI, pH 7,5, 50 mM NaCl, 1 mM EDTA) i et 1,5 ml mikrofugerør. Glasset anbringes i en svømmer i kogende vand i 5 min. Lad slangen på plads, og derefter lade vandet køle langsomt til room temperatur (dette tager ca 2 timer).
- Udfør prøveforberedelse og forsøget under lav eller minimal lysforhold for at minimere fotoblegning af fluorescerende mærke.
2.. Måling af Steady-State Time Course og Active site Titrering af OGG1
2.1. Prøveforberedelse og steady-state tidsforløb
- Forbered DNA substrat og OGG1 løsninger separat i reaktionsbuffer (50 mM HEPES, pH 7,5, 20 mM KCI, 0,5 mM EDTA og 0,1% bovint serumalbumin) i 1,5 ml mikrofugerør på is. Koncentrationen af DNA er 400 nm og den tilsyneladende koncentration af OGG1 er 30, 60, 90 eller 120 nM som bestemt ved en Bradford protein assay. Placer reaktionsrørene i en varmeblok ved 37 ° C. Pre-inkuber enzym og DNA substratopløsninger separat ved 37 ° C i 1 min.
- Starte reaktionen ved at blande lige volumener af OGG1 og DNA substratopløsninger ved pipettering. Efter blanding disse løsningertioner 1:1 (v / v), de endelige koncentrationer er 200 nM DNA og 15, 30, 45, eller 60 nM OGG1 hhv. Fjern alikvoter (10 pi) med tidsintervaller og standse reaktionen ved blanding med 1 ml af 1 M NaOH. Som kontrol for tidsforløbene, 10 ul af reaktionsblandingen uden enzym blandes med 1 ml af 1 M NaOH.
- Placer reaktionen prøverne i en 90 ° C varmeblok i 5 min til spalte det resulterende produkt AP-stedet. Efter opvarmning, tilsættes 1 ml af 1 M HCI at neutralisere hver prøve.
- Tilføj en tilsvarende mængde (12 ul) i gelpåsætning buffer (95% formamid, 20 mM EDTA, 0,02% bromphenol og 0,02% xylencyanol) til hver reaktion prøve og derefter anbringe blandingen i en varmeblok indstillet til 95 ° C i 2 min, straks derefter placere røret på is.
- Load prøverne (5 pi) på en 15% denaturerende polyacrylamidgel indeholdende 8 M urinstof i 89 mM Tris-HCI, pH 8,8, 89 mM borsyre og 2 mM EDTA. Substratet og de spaltede produkter er godt adskilt efterkører gelen.
2.2. Billeddannelse af gelen
- Scan gelen ved hjælp af en billeddanner, som kan detektere fluorescens-mærkede DNA og visualisere underlaget og produkt bands.
- Kvantificere båndene efter billeddannelse gelen. Bemærk, at nogle baggrundsoplysninger spaltning kan observeres efter behandling af selve substratet med NaOH (figur 2A). Fratræk denne baggrund fra den målte mængde af hver reaktion produkt.
2.3. Dataanalyse
- Afbildes mængde af produktet dannet ved hver reaktion tid (t) (figur 2B). Analyser de rå data ved hjælp af ligning 1 for at bestemme amplituden af burst (A 0, y-skæringspunkt) og hældningen af den lineære steady state fase (v ss).
- Ploty-aksen i forhold til den totale proteinkoncentration (dvs. tilsyneladende enzymkoncentration, figur 2C), hvilket giver et mål for den aktive del af enzymet. Brug en lineær pasform med nulpunktet for at give korrektionsfaktoren for at bestemme den brøkdel af aktivt enzym.
- Plotte steady-state hastighed i forhold til det aktive enzym koncentration (figur 2D), der leverer produktet dissociationshastighed konstant (dvs. hældning monteret linje).
3.. Måling af Pre-steady state Time Course
Som vist i figur 2, produkt dannelse under burst fase er for hurtig til at måle ved manuel blanding og standsning. Derfor kan en hurtig bratkøling-flow-instrument give en kraftfuld metode til at måle hurtige reaktioner, der opstår på millisekund skala (figur 3) 5. Instrumentet bruger en computerstyret drivmotor til hurtigt at blande ennd slukke reaktioner efter angivne reaktionstider. For eksempel bruger en Kintek RQF-3 Hurtig Quench-Flow Instrument til at måle den indledende burst fase og efterfølgende steady-state fase af produktets dannelse katalyseret af OGG1. Rapid Quench-Flow Instruments er tilgængelige fra flere producenter.
3.1. Klargøring af prøven
Separat forberede DNA substrat og OGG1 løsninger i 1,5 ml rør som beskrevet i 2-1. Koncentrationerne af DNA og aktive OGG1 er 400 nm og 80 Nm, hhv. Dette resulterer i slutkoncentrationer på 200 nM DNA og 40 nM aktiv OGG1 efter blanding 1:1 (v / v).
3.2. Fremstilling af hurtig bratkøling-flowmeter
- Tilslut en cirkulerende vandbad til den hurtige quench-flow Instrument til temperaturkontrol (37 ° C).
- Juster instrumentets parametre, og vælg den relevante reaktion loop for den ønskede tid peger ifølge producentens instruktionertioner. Reaktions loops er af variable længder til at give alternative reaktionstider.
- Forbered Reaktionsbufferen og NaOH slukke løsninger i 10 ml Luer Lock engangssprøjter og vedhæfte disse sprøjter til drevet Havne og indlæse Drive Reservoirer med reaktion buffer (sprøjter B) og 142 mM NaOH (sprøjte Q) (Syringe Load Ventiler i belastningen position) . at fjerne luftbobler fra sprøjten arbejder løsningen frem og tilbage flere gange.
- Sænk stepmotor indtil det kontakter i toppen af sprøjterne (Syringe Load ventiler og Sample Load ventiler i FIRE position).
- Skyl Sample Loops, den Reaction Loop, og Exit Line med vand og methanol. Tør skyllede områder fuldstændigt (ventiler i FLUSH position).
3.3. Pre-steady state tidsforløb
- Lave et hul i toppen af en hætte 1,5 ml glas med en 16-gauge nål. Sæt en slange på Exit linje til at indsamle den bratkølede reaktion.
- Indstil den ønskede reaction tid (i sekunder) ved hjælp af tastaturet. Den Stepper Motor vil bakke op for at justere for loop lydstyrke for at opretholde konstant dæmpning volumen. Position stemplerne til sprøjte B mod Stepper Motor-platformen ved at tilføje buffer med engangssprøjter knyttet til Drive Havne.
- Fyld 1 ml luer lock engangssprøjter med DNA substrat og OGG1 løsninger, henholdsvis (prøve ventiler i LOAD position). Vedhæft sprøjter med DNA substrat og OGG1 løsninger til hver af Sample Load Ports, og derefter udfylde de Sample Loops med DNA substrat og OGG1 løsninger hhv (Sample Load Ventiler i LOAD position).
- Indstil alle Sprøjte Load Ventiler og Sample Load Ventiler til ilden position. Start reaktionen ved et tastatur slagtilfælde (fx tryk på "G" eller "START"-tasten). DNA substrat og OGG1 løsninger (18 ul hver) blandes straks i reaktionsskema Loop.
- Vent, indtil reaktionen automatisk standses på det ønskede reaktionstid ved at blande 36 pi af reaction blanding med 86 pi 142 mM NaOH. Efter standsning af reaktionen, er prøven udledes fra Exit Line.
- Indstil sprøjten Load Ventiler til belastningen position og prøven Load Ventiler til FLUSH position. Skyl Sample Loops, den Reaction Loop, og Exit Line med vand og methanol og tørres som beskrevet i punkt 3.2. Gentag den ovenstående procedure for hvert tidspunkt.
- Udføre et kontrolforsøg uden enzym til at bestemme en baggrund korrektion, hvilket kan gøres manuelt eller med den hurtige bratkøling instrument. For at udføre en kontrol med den hurtige-quench instrument, fylde Sample Loop for DNA med DNA substrat, men holde Sample Loop for OGG1 tom. Indstil reaktionstid, udføre mix og Quench som beskrevet i 3.3.4-3.3.6.
- Vask Sample Loops og Reaktion Loop med 2 M NaOH, 2 M HCI, vand og methanol og derpå tørre de vaskede linjer. Efter indstilling af Stepper Motor til startposition, skal du skifte sprøjten Load Ventiler til belastningen position og vaske Drive Reservoirer med vand.
- Behandl quenchede reaktions prøver med varme, og derefter separat substrat og produkt-DNA med 15% denaturerende polyacrylamidgelelektroforese som beskrevet i 2.1.
- Visualisere og kvantificere båndene på gelen som beskrevet i 2.2.
3.4. Dataanalyse
Monter tidsforløb for produkt dannelse af ikke-lineær regressionsanalyse til en ligning med et stigende eksponentielle og lineære termer (ligning 2) leverer den første ordens hastighedskonstant (k obs), amplituden af burst (A 0), og en lineær hastighed (v ss).
4.. Single-omsætningen Time Course
- Forbered DNA substrat og OGG1 i separate 1,5 ml rør, som beskrevet i 2-1. Koncentrationentioner af DNA og aktive OGG1 er 100 nM og 500 nM, dette giver slutkoncentrationer på 50 nM DNA og 250 nM OGG1 efter blanding 1:1 (v / v).
- Forbered den hurtige quench-flow instrument og forberede reaktions prøver som beskrevet i punkt 3.2 og 3.3.
- Behandl quenchede reaktions prøver med varme og underkaste dem 15% denaturerende polyakrylamidgelelektroforese at adskille substrat og produkter som beskrevet i punkt 2.1.
- Visualisere og kvantificere båndene på gelen som beskrevet i 2.2.
- Monter tidsforløb for produktdannelse til en enkelt eksponentiel at bestemme den første ordens hastighedskonstant (k obs.) som givet i ligning 3..
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Steady-state kinetiske analyse blev udført ved anvendelse af 200 nM DNA substrat og fire forskellige tilsyneladende koncentrationer af OGG1 (15, 30, 45, og 60 nM), som bestemt ved en Bradford proteinassay 2. Tidsforløbene af produktdannelse blev tilpasset til en lineær ligning til at bestemme y-aksen, som var 2,2, 11, 15, og 26 nM, i forhold til hvert protein fusion (figur 2B). Y-skæringspunkter blev yderligere plottet i forhold til hinanden faktiske proteinkoncentration (figur 2C). Fraktionen af aktivt enzym blev bestemt til at være 38% fra hældningen af linjen i figur 2C. At bestemme steady-state hastighed, v ss bestemmes ud fra de lineære passer i figur 2B blev afbildet i forhold til y-skæringspunkter (figur 2D). Hældningen af linien i figur 2D var 0,0028 sek-1, hvilket svarer til dissociationshastighed konstantfor produktet AP-site og indridset AP-site dannet af DNA glycosylase / lyase-aktiviteter.
En præ-steady-state tidsforløb blev fulgt ved hjælp af 200 nM DNA substrat og 40 nM aktive OGG1. De tidsforløb for det produkt, dannelse kan være egnet til en ligning med stigende eksponentielle og lineære vilkår. Som vist i figur 4, k obs. og koff blev bestemt til at være 0,75 sek-1 og 0,0055 sek-1, henholdsvis 2. Amplituden for burst fase (33 nM) var lidt lavere end forventet ud fra koncentrationen af det aktive OGG1 tilsat (40 nM). Dette kan skyldes uspecifik binding af OGG1 til DNA-substrat, der reducerer de tilgængelige antal enzymmolekyler.
Under single-omsætning betingelser blev den 8-oxoG excision reaktion færdig inden 6 sek (figur 5) 2. Tidsforløbet for produktdannelse kan passe til en enkelt eksponentielligning og gav k obs på 0,74 sek-1. Især amplituden for produkt dannelse var lavere end de forventede 50 nM tilføjede DNA substrat. Dette kunne have været skyldes til dels baggrunden spaltning af DNA med NaOH-behandling (figur 2A) eller tilstedeværelsen af unannealed substrat oligonukleotider i reaktionsblandingen.
Figur 1. Oprensning af humant OGG1 fra E. coli. Det humane OGG1 gen blev klonet ind i pGEX-6P-1 og overudtrykt i BL21 (DE3)-celler. Bane 1, inducerede celler, bane 2, IPTG-inducerede celler, bane 3, opløseligt protein fraktion, bane 4, glutathion sepharose 4B efter inkubering med opløselig proteinfraktion, bane 5, gennemstrømning fraktion efter inkubation af glutathion sepharose 4B med HRV 3C protease, bane 6, strømning gennem fraktion efter fjernelse af forurenende stoffer fra Mono Q kolonne. Et fotografi af Coomassie Blue-farvede gel er vist.
Figur 2. Steady-state kinetik og aktivt sted titrering af renset OGG1 2 OGG1 (15 nM, ○, 30 Nm, □, 45 nM ◊, eller 60 Nm, ×). Blev inkuberet med 200 nM DNA substrat (5'-CTGCAGCTGATGCGCC X TACGGATCCCCGGGTAC -3 ', hvor X er 8-oxoG parret med C) ved 37 ° C i 1-30 minutter som angivet. Disse enzymkoncentrationer repræsenterer tilsyneladende proteinkoncentrationer baseret på en Bradford protein assay kvantificeret fra en BSA-standardkurve. A Denaturering polyacrylamidgeler viser adskilte substrater (S) og produkter (P). OGG1 (30 nM) og 200 nM D NA substrat blev anvendt til reaktionen. B, tidsforløb for produktdannelse. Dataene blev tilpasset til en lineær ligning til at bestemme amplituden af burst fase (y-skæringspunkt) og en tilsyneladende hastighed på produktets frigivelse (hældning). C, Plot af de opfanger bestemt ud fra de lineære passer i panel B i forhold til fastslået, at ved Bradford-assay. Hældningen af linien svarer til fraktionen af aktivt enzym. Fejlen bar angiver fejl i amplitude udledes fra lineære passer til produktet dannelse i panel B. D, Plot af skråninger bestemt ud fra de lineære passer i panel B i forhold til det aktive enzym koncentration. Fejlen bar angiver fejl i hældningen udledes lineære passer til produktet dannelse i panel B. Hældningen af linien svarer til steady-state rate (koff), 0,0028 sek-1.
Figur 3. Oversigt over Rapid Quench-Flow Instrument.
Figur 4.. Pre-steady-state kinetik for 8-oxoG excision af OGG1 2. OGG1 (40 nM aktive enzym) blev inkuberet med 200 nM DNA substrat (5'-CATGGGCGGCATGAACC X GAGGCCCATCCTCACC-3 ', hvor X er 8-oxoG parret med C) ved 37 ° C i 0-100 sek. Den stiplede linje angiver en fremskrivning af steady-state fase. Dataene blev egnet til burst ligning med en amplitude svarende til 33 ± 0,89 nM, k obs svarende til 0,75 ± 0,083sek -1, v s s svarende til 0,18 ± 0,018 nM sek -1 og k off lig med 0,0055 ± 0,020 sek-1.
Figur 5. Enkelt omsætning kinetik af 8-oxoG excision ved OGG1 2. OGG1 (250 nM aktivt enzym) blev inkuberet med 50 nM DNA substrat (5'-CTGCAGCTGATGCGCC X TACGGATCCCCGGGTAC-3 ', hvor X er 8-oxoG parret med C) ved 37 ° C 0-60 sek. Dataene blev egnet til det indre eksponentielle ligning med k obs lig med 0,74 ± 0,015 sek -1. Den stiplede linje viser den ekstrapolerede amplitude (dvs. produkt på uendelig tid).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De kinetiske fremgangsmåder beskrevet her skitsere metoder til at definere elementære kinetiske konstanter. Hvis et tidsforløb produkt dannelse er bifasisk med den første enzymatiske omsætning forekommer hurtigt, så et trin efter kemi er hastighedsbegrænsende under de efterfølgende katalytiske omsætning. I tilfælde af OGG1, kan den første omsætning, der måles ved hjælp af høje enzymkoncentrationer med enten begrænsning (S <E) eller høj (S> E) DNA-koncentrationer. I det første tilfælde er reaktionen begrænset til én enkelt omsætning «og giver et mål for den katalytiske hastighed på det aktive sted af enzymet. I sidstnævnte tilfælde er flere enzymatiske omsætninger vurderet. Burst produkt dannelse opstår under den første omsætning giver et mål for den kemiske arrangement på enzymets aktive site, mens de efterfølgende omsætninger giver et mål for det trin, der begrænser katalytisk cykling. Desuden giver amplituden af byge af produktet dannelse et mål for aktivt enzym. Det skal være kendt for at beregne produktet dissociationshastighed konstant fra steady-state hastighed (k off = v ss / E). For OGG1 begrænser produktets frigivelse DNA (dvs. produkt DNA dissociationshastighed konstant) katalytisk cykling og dets steady-state sats 7,8. Som vist i figur 4, DNA produkt dissociationshastighed (k off = 0,0055 sek-1) til OGG1 er to størrelsesordener lavere end den observerede katalytiske sats (k obs = 0,75 sek-1). Det er et fælles kinetisk træk af DNA glycosylaser at punktafgiftspligtige beskadigede DNA-baser til at binde deres produkter (DNA med et abasisk sted) stramt, så produktet udgivelse er hastighedsbegrænsende i steady-state målinger 1,8-10. Vigtigere er det, steady-state aktivitetsmålinger derved giver en enkel og ligetil måde at bestemme produktets DNA bindingsaffinitet, lavere aktivitet tyder strammere produkt BBINDENDE.
Som beskrevet i figur 2 og Repræsentative resultater, er den aktive del af enzym bestemt til at være 38%. Den aktive fraktion er lavere end den, der bestemmes ud fra den proteinkoncentration, selvom fremstillede enzym er> 95% homogent (figur 1). Dette kan skyldes den ikke-specifikke binding af enzymet til substratet og / eller fremgangsmåden af protein bestemmelse, der muligvis ikke nøjagtigt vurdere den sande proteinkoncentration (f.eks Bradford proteinassay bruger typisk bovint serumalbumin som en standard, der kan ikke være en god efterligner for enzymet af interesse). Alternativt kan proteinkoncentration bestemmes ved andre metoder eller estimeret ud fra et beregnet molære ekstinktionskoefficienterne for 280 nm som den er udviklet af Gill og von Hippel 11..
Som vist i figur 4 og 5, størrelsen af k obs. bestemmes from før steady state tidsforløb bør være i overensstemmelse med det bestemmes ud fra en single-omsætningen eksperiment. Værdien k off bør også være eksperimentelt overensstemmende mellem alternative kinetiske metoder. Hvis imidlertid disse hastighedskonstanter er forskellige (f.eks koff er forskellig mellem steady-state og præ-steady-state betingelser), kan forskellige trin måles ved hver metode og en ny model bør overvejes. Alternativt kan produktet hæmning eller substratmangel påvirke tilsyneladende steady state sats i en præ-steady-state tidsforløb, der forurener den lineære del.
I den situation, hvor burst og steady-state faser ikke godt adskilt (dvs. k obs ~ k off) er amplituden af burst og observerede ratekonstanter kompositter af elementære hastighedskonstanter for flere trin 12.. Desuden, hvis produktet release er hurtig (dvs koff> k obs), tidsforløbet produkt dannelse er ikke bifasisk (første omsætning og efterfølgende omsætninger er begrænset af samme skridt; kemi). I dette tilfælde kan en enkelt omsætning eksperiment giver et mål for katalyse.
Hvis en enkelt omsætning fremgangsmåde er foretaget for at fastslå en iboende katalytisk hastighed, skal være tilstrækkelig enzym anvendes til at sikre, at binding er delvist hastighedsbegrænsende. Ligeledes skal substratbinding også være hurtigt, således at burstrate ikke er begrænset af substratbinding. At kontrollere, at enzymet binding er ikke hastighedsbegrænsende løbet af en enkelt-omsætning eksperiment er tidsforløbet gentages med en anden enzymkoncentration at bekræfte, at den eksponentielle tidsforløbet ikke ændres. Desuden, da amplituden af briste eller enkelt omsætning tidsforløb er direkte proportional med enzym eller substratkoncentrationer, henholdsvis skal koncentrationerne vælges so at de kan måles pålideligt. Endelig skal det bemærkes, at når burst og steady state satser ikke godt adskilt, burst amplitude undervurderer den sande aktivt enzym koncentration 12..
De kinetiske fremgangsmåder beskrevet ovenfor giver en pålidelig metode til at isolere vigtige skridt i den katalytiske cykling af DNA-glycosylaser. Med disse reference-kinetiske konstanter, påvirkning af ændrede DNA-sekvens / struktur 1,13-18 kan aktivt sted rester 19,20, metal ion 21, eller cellulære tilbehør protein på katalyse eller enzym cykling nu vurderes 22-24.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at afsløre.
Acknowledgments
Vi takker Dr. Julie K. Horton for kritisk læsning af manuskriptet og Dr. Rajendra Prasad for nyttige forslag og diskussioner. Dele af denne forskning blev oprindeligt offentliggjort i The Journal of Biological Chemistry, Sassa A et. al., "DNA-sekvens Context Virkninger på Glycosylasemedieret aktivitet for Human 8-Oxoguanine DNA-glycosylase." J Biol Chem. 287, 36.702-36.710 (2012) 2.. Dette arbejde blev støttet helt eller delvist af National Institutes of Health Research Project Grant Z01-ES050158 i Intramural Research Program, NIEHS.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent/Material | |||
| 5’-6-FAM labeled oligonucleotides containing a single 8-oxoG | Eurofins MWG Operon | 5’-P32 radiolabeled oligonucleotides can be used as well. Polyacrylamide gel purification grade is recommended. | |
| Unlabeled oligonucleotides (complementary strand) | Eurofins MWG Operon | Polyacrylamide gel purification grade is recommended. | |
| 1 ml BD Luer Lock disposable syringe | BD Medical | 309628 | Lue Lock disposable syringe from other vendors can be used as well. |
| 10 ml BD Luer Lock disposable syringe | BE Medical | 309604 | Luer Lock disposable syringe from other vendors can be used as well. |
| Equipment | |||
| Circulating water bath | Any vender | ||
| RQF-3 Rapid Quench-Flow Instrument | KinTek Corporation | Rapid Quench-Flow Instrument from other vendors can be used as well. | |
| Typhoon Phosphorimager 8600 | GE Healthcare Life Sciences | Imager from other vendors can be used as well. | |
| KaleidaGraph | Synergy Software | ||
References
- Porello, S. L., Leyes, A. E., David, S. S. Single-turnover and pre-steady-state kinetics of the reaction of the adenine glycosylase MutY with mismatch-containing DNA substrates. Biochemistry. 37, 14756-14764 (1998).
- Sassa, A., Beard, W. A., Prasad, R., Wilson, S. H. DNA sequence context effects on the glycosylase activity of human 8-oxoguanine DNA glycosylase. The Journal of Biological Chemistry. 287, 36702-36710 (2012).
- Wong, I., Lundquist, A. J., Bernards, A. S., Mosbaugh, D. W. Presteady-state analysis of a single catalytic turnover by Escherichia coli uracil-DNA glycosylase reveals a "pinch-pull-push" mechanism. The Journal of Biological Chemistry. 277, 19424-19432 (1074).
- Johnson, K. A.
- Johnson, K. A. Rapid kinetic analysis of mechanochemical adenosinetriphosphatases. Methods in Enzymology. 134, 677-705 (1986).
- Kovtun, I. V., et al. OGG1 initiates age-dependent CAG trinucleotide expansion in somatic cells. Nature. 447, 447-452 (2007).
- Hill, J. W., Hazra, T. K., Izumi, T., Mitra, S. Stimulation of human 8-oxoguanine-DNA glycosylase by AP-endonuclease: potential coordination of the initial steps in base excision repair. Nucleic Acids Research. 29, 430-438 (2001).
- Zharkov, D. O., Rosenquist, T. A., Gerchman, S. E., Grollman, A. P. Substrate specificity and reaction mechanism of murine 8-oxoguanine-DNA glycosylase. The Journal of Biological Chemistry. 275, 28607-28617 (2000).
- Waters, T. R., Swann, P. F. Kinetics of the action of thymine DNA glycosylase. The Journal of Biological Chemistry. 273, 20007-20014 (1998).
- Nilsen, H., et al. Excision of deaminated cytosine from the vertebrate genome: role of the SMUG1 uracil-DNA glycosylase. The EMBO Journal. 20, 4278-4286 (2001).
- Gill, S. C., von Hippel, P. H. Calculation of protein extinction coefficients from amino acid sequence data. Analytical Biochemistry. 182, 319-326 (1989).
- Van de Berg,, Beard, B. J., A, W., Wilson, S. H. DNA structure and aspartate 276 influence nucleotide binding to human DNA polymerase beta. Implication for the identity of the rate-limiting conformational change. The Journal of Biological Chemistry. 276, 3408-3416 (2001).
- Krishnamurthy, N., Haraguchi, K., Greenberg, M. M., David, S. S. Efficient removal of formamidopyrimidines by 8-oxoguanine glycosylases. Biochemistry. 47, 1043-1050 (2008).
- Leipold, M. D., Muller, J. G., Burrows, C. J., David, S. S. Removal of hydantoin products of 8-oxoguanine oxidation by the Escherichia coli DNA repair enzyme, FPG. Biochemistry. 39, 14984-14992 (2000).
- Zhao, X., Krishnamurthy, N., Burrows, C. J., David, S. S. Mutation versus repair: NEIL1 removal of hydantoin lesions in single-stranded, bulge, bubble, and duplex DNA contexts. Biochemistry. 49, 1658-1666 (2010).
- Leipold, M. D., Workman, H., Muller, J. G., Burrows, C. J., David, S. S. Recognition and removal of oxidized guanines in duplex DNA by the base excision repair enzymes hOGG1, yOGG1, and yOGG2. Biochemistry. 42, 11373-11381 (2003).
- Robey-Bond, S. M., Barrantes-Reynolds, R., Bond, J. P., Wallace, S. S., Bandaru, V. Clostridium acetobutylicum 8-oxoguanine DNA glycosylase (Ogg) differs from eukaryotic Oggs with respect to opposite base discrimination. Biochemistry. 47, 7626-7636 (2008).
- Jarem, D. A., Wilson, N. R., Delaney, S. Structure-dependent DNA damage and repair in a trinucleotide repeat sequence. Biochemistry. 48, 6655-6663 (2009).
- Livingston, A. L., Kundu, S., Henderson Pozzi, M., Anderson, W. D., David, S. S. Insight into the roles of tyrosine 82 and glycine 253 in the Escherichia coli adenine glycosylase MutY. Biochemistry. 44, 14179-14190 (2005).
- Kundu, S., Brinkmeyer, M. K., Livingston, A. L., David, S. S. Adenine removal activity and bacterial complementation with the human MutY homologue (MUTYH) and Y165C, G382D, P391L and Q324R variants associated with colorectal cancer. DNA Repair. 8, 1400-1410 (2009).
- Zharkov, D. O., Rosenquist, T. A. Inactivation of mammalian 8-oxoguanine-DNA glycosylase by cadmium(II): implications for cadmium genotoxicity. DNA Repair. 1, 661-670 (2002).
- Jarem, D. A., Wilson, N. R., Schermerhorn, K. M., Delaney, S. Incidence and persistence of 8-oxo-7,8-dihydroguanine within a hairpin intermediate exacerbates a toxic oxidation cycle associated with trinucleotide repeat expansion. DNA Repair. 10, 887-896 (2011).
- Mokkapati, S. K., Wiederhold, L., Hazra, T. K., Mitra, S. Stimulation of DNA glycosylase activity of OGG1 by NEIL1: functional collaboration between two human DNA glycosylases. Biochemistry. 43, 11596-11604 (2004).
- Sidorenko, V. S., Nevinsky, G. A., Zharkov, D. O. Mechanism of interaction between human 8-oxoguanine-DNA glycosylase and AP endonuclease. DNA Repair. 6, 317-328 (2007).
