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Biology

Dithranol als Matrix für Matrix Assisted Laser Desorption / Ionisation Imaging auf einem Fourier-Transformations-Ionen-Zyklotron-Resonanz-Massenspektrometer

Published: November 26, 2013 doi: 10.3791/50733
Automatic Translation
1,2, 1, 1,2
1University of Victoria-Genome BC Proteomics Centre, University of Victoria, 2Department of Biochemistry and Microbiology, University of Victoria

Summary

Dithranol (DT, 1,8-Dihydroxy-9 ,10-dihydroanthracen-9-on) wurde zuvor als ein MALDI-Matrix für die Gewebeabbildung für kleine Moleküle berichtet wurde, Protokolle für die Verwendung von DT für die MALDI-Imaging von endogenen Lipiden auf die Hier werden Oberflächen von Gewebeschnitten von Positiv-Ionen-MALDI-MS auf einem ultrahochauflösenden Quadrupol-FTICR Instrument zur Verfügung gestellt.

Abstract

Massenspektrometrie-Bildgebung (MSI) bestimmt die räumliche Lokalisierung und Verteilung der Verbindungen auf der Oberfläche eines Gewebeschnittes, vor allem unter Verwendung von MALDI (Matrix-unterstützte Laserdesorption / Ionisation)-basierten analytischen Techniken. Neue Matrizen für niedermolekulare MSI, was die Analyse von niedrigem Molekulargewicht (MW)-Verbindungen verbessern können, sind erforderlich. Diese Matrizen erhöht Analyten Signale liefern, während abnehm MALDI Hintergrundsignale. Darüber hinaus ist die Verwendung von ultrahochauflösenden Instrumente, wie Fourier-Transformations-Ionenzyklotronresonanz (FT-ICR)-Massenspektrometer, hat die Fähigkeit, Signale von Analyten Matrixsignale beheben, und dies kann teilweise viele Probleme mit dem Hintergrund der MALDI Ursprung überwinden Matrix. Die Verringerung der Intensitäten der metastabilen Matrix-Clustern durch FT-ICR MS kann auch helfen, einige der Interferenzen mit Matrixspitzen auf andere Instrumente zu überwinden. Hochauflösendesind Instrumente wie die FT-ICR-Massenspektrometer vorteilhaft, da sie Verteilungsmuster von vielen Verbindungen gleichzeitig herstellen kann, während immer noch Vertrauen in chemische Identifikationen. Dithranol (DT, 1,8-Dihydroxy-9 ,10-dihydroanthracen-9-on) wurde zuvor als ein MALDI-Matrix für die Gewebeabbildung gemeldet. In dieser Arbeit wurde ein Protokoll für die Verwendung von DT für MALDI-Imaging von endogenen Lipiden aus den Oberflächen von Säugergewebeschnitte, von Positiv-Ionen-MALDI-MS auf einem ultrahochauflösenden Hybrid-Quadrupol-FTICR Instrument bereitgestellt wurde.

Introduction

Massenspektrometrie-Bildgebung (MSI) ist ein Analyseverfahren zur Bestimmung der räumlichen Lokalisierung und Verteilung der Verbindungen auf der Oberfläche eines Gewebeschnitts 1,2. Matrix Assisted Laser Desorption / Ionisation (MALDI) MSI für die Analyse von Peptiden und Proteinen ist seit über zehn Jahren verwendet worden und es wurden große Fortschritte bei Verfahren zur Probenvorbereitung, Nachweisempfindlichkeit, räumliche Auflösung, Reproduzierbarkeit und Datenverarbeitung 3,4. Durch die Kombination von Informationen aus histologisch gefärbten Schnitten und MSI Experimente sind Pathologen in der Lage, die Verteilungen von spezifischen Verbindungen mit pathophysiologisch interessanten Features 5 korrelieren.

Die Verteilungsmuster von kleinen Molekülen, einschließlich 6,7 exogene Drogen und deren Metaboliten 8-10 wurden auch durch MALDI-MS Tissue Imaging 11 verhört worden. Lipide sind vielleicht die am weitesten untersuchten class von Verbindungen mit MALDI-Bildgebung sowohl in den 12-17 MS und MS / MS-18-Modus. Die Verwendung von MALDI MSI für kleine Molekül Bildgebung durch mehrere Faktoren begrenzt: 1) MALDI-Matrizes sind selbst kleine Moleküle (typischerweise m / z <500), die reichlich Ionensignale zu erzeugen. Diese reichlich Signale der Ionisation von niedermolekularen Analyten zu unterdrücken und stören ihre Detektion 19,20. Lösemittelfreie Matrix-Beschichtung 21, Matrix Sublimation 22 und Matrix schwemmt MALDI-MS-23, unter anderem, wurden entwickelt, um MSI kleiner Moleküle zu verbessern.

New Matrizen, die die Analyse von Low-MW-Verbindungen verbessern können, sind von großem Interesse in kleinen Molekülen MSI. Diese Matrizen erhöht Analyten Signale mit verminderter Matrix Signale zu liefern. Im positiven Ionenmodus, 2,5-Dihydroxybenzoesäure (DHB) und α-Cyano-4-Hydroxyzimtsäure (CHCA) sind die beiden häufigsten verwendeten MALDI MS Matrizen für MSI 24 22,25 erlaubt. 9-Aminoacridin für MSI protischer Analyten in der Positiv-Ionen-Modus 26 und für Nucleotide und Phospholipiden im Negativionen-Modus 26-29 verwendet. 2-Mercaptobenzothiazol ist gefunden worden, um eine effiziente Detektion von Lipiden MALDI 30 zu geben, und ist für die Abbildung des Gehirns der Maus 31 Ganglioside verwendet. Die Ultrahochauflösung von Fourier-Transformations-Ionen-Zyklotron-Resonanz (FT-ICR)-Massenspektrometer kann etwas Linderung dieses Problems durch die Lösung Signale von Analyt-Matrix-Signale 32 auf. Ein weiterer Vorteil der Verwendung von FT-ICR-MS, dass die Intensitäten der metastabilen Matrix Cluster ReduktionED-33, das ebenfalls eine Verringerung dieser Störungen 27.

Die Verwendung von Dithranol (DT, 1,8-Dihydroxy-9 ,10-dihydroanthracen-9-on) als ein MALDI-Matrix für die Gewebeabbildung zuvor berichtet worden 34. In dieser aktuellen Arbeit wird ein detailliertes Protokoll für die Verwendung von DT für das MSI von endogenen Lipiden auf den Oberflächen der Rinderlinse Gewebeabschnitte versehen ist, in dem Positiv-Ionen-Modus.

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Protocol

1. Tissue Schnitte

  1. Blitz Einfrieren der Proben Frage nach der Ernte, mit flüssigem Stickstoff, versenden sie auf Trockeneis (wenn Versandkosten anfallen), und speichern Sie sie bei -80 ° C, bis die Gewebe Schnitte. (Wenn kommerzielle Proben verwendet werden, sicherzustellen, daß die Proben in dieser Weise hergestellt.)
  2. Schneiden Organe auf eine überschaubare Größe, die MALDI-Target passen. Schneiden Sie unerwünschte Teile der Orgel. Aus diesem hier beschriebenen Studie wurden Kälberlinsen mit einer zuvor beschriebenen Verfahren 35 vor Gewebeschneide decapsulated.
  3. Entfernen ganze Organe aus dem -80 ° C Gefrierschrank und fixieren sie auf einer kryogenen Gewebeschneiden Bühne. Um einen Kälberlinse beheben, legen Sie einen oder zwei Tropfen Wasser auf das Gewebe Senkungsstufe eines Kryostaten. Schnell stellen die Linse im Wasser, bevor es erstarrt. Alternativ kann eine optimale Schnitttemperatur (OCT)-Verbindungen auch verwendet, um ein Gewebe auf den Schneid Bühne fixieren. Wenn Oktober Verbindungen verwendet werden, ein Mini-Fehlmenge von OCT angewandt werden und darauf zu achten, dass die geschnittenen Gewebeabschnitte nicht OCT-Verbindungen, die mit Ionisation und Detektion der Analyten stören können 5,36,37 kontaminiert werden.
  4. Damit die Temperatur im Inneren des Kryostaten auf -18 ° C äquilibriert Wärmer oder kälter Temperaturen können für weichere oder härtere Gewebe verwendet werden, beziehungsweise. Dann schneiden Sie das Gewebe äquatorial in 20 um dicke Scheiben schneiden. Verwenden Sie 10-15 um dicke Scheiben für die meisten Gewebe, aber wegen der fragilen Natur der Rinderlinsengewebe wurden 20 um dicke Scheiben eingesetzt. Für Rinderlinsengewebe, entsorgen Sie die erste Gewebeschnitten und nur Scheiben, die in der Nähe oder an der Äquatorialebene sind.
  5. Wenn eine Augenlinse Gewebe abgebildet wird, verwenden 1,5 ul Ameisensäure (98% Reinheit, LC-MS-Klasse), um die Oberfläche einer Indium-Zinn-Oxid (ITO) beschichteten Glasträger vorbefeuchtet.
  6. Die Gewebeschnitte auf der Oberfläche der ITO-co vorsichtig übertragenATED Glasobjektträger im Inneren des Kryostaten. Der Gewebeschnitt wird schnell auftauen und wird fest befestigt, um die Gleitfläche zu werden. Normalerweise können mehrere Gewebeabschnitte auf derselben ITO-beschichtete Objektträger auf diese Weise befestigt werden.
  7. Lyophilisieren die Folie für 15 Minuten vor der MALDI-Matrix-Anwendung.
  8. Für Matrix-Tests, lösen die einzelnen Matrizen in geeigneten Lösungsmitteln. Manuell vor Ort 1 ul jeder Matrix-Lösung auf den Gewebeschnitt. Darüber hinaus, vor Ort eine kleine Moleküle Kalibrierungsstandard auf das Gewebe für die Überprüfung der MALDI-Empfindlichkeit.
  9. Three Lehre Markierungen auf der ITO-beschichteten Glasobjektträger, indem er auf der nicht leitenden Oberfläche der ITO-beschichteten Glasobjektträger mit einem Korrekturfluid-Stift. Nehmen Sie ein optisches Bild des Gewebes Folie mit einem Flachbettscanner und speichern Sie sie in einem geeigneten Format wie TIFF oder JPG.

2. Matrixbeschichtungs

2.1. Automated Coating Matrix

  1. ApLagenmatrixlösungen, die Acetonitril oder gemischten Acetonitril / Wasser als Lösungsmittel enthalten, automatisch an den Oberflächen der Gewebeabschnitte mit einem Bruker ImagePrep oder eine ähnliche elektronische Matrix Spritzen.
  2. Abdeckung der Kanten der vorderen Oberfläche des ITO-beschichteten Glasobjektträger mit Band so, dass die Matrix nicht bedeckt die Ränder der Folie. Dies stellt sicher, dass die Lehre Markierungen auf der gegenüberliegenden Oberfläche für Gewebe Schieber Ausrichtung verwendet werden. Decken Sie die Ränder der Folie mit der Matrix, wie sie als Kontaktstellen verwendet werden, um die elektrische Leitfähigkeit der ITO-beschichtete Folie erhalten.
  3. Coat Glasrutsche, indem zwanzig Zyklen der Matrixbeschichtung (2-sec-Spray, 30-sec Inkubation und 60-sec Trockenzeit pro Zyklus).

2.2. Manuelle Matrix-Beschichtung

  1. Werden organische Lösungsmittel (z. B. Chloroform und Ethylacetat), die mit den Herstellungsmaterialien der elektronischen Matrixspritzen unvereinbar sind Erforrot, mit einem pneumatisch unterstützten Airbrush-Spritzgerät, um die Matrix anzuwenden. In die vorbereitete Matrix-Lösung auf den Lösungsmittelbehälter der Airbrush-Pistole und eine milde Strömung von Druckstickstoffgas auf der Haupt Spray.
  2. Abdeckung der Kanten der vorderen Oberfläche der ITO-beschichteten Glasobjektträger mit Band so, dass die Matrix nicht bedeckt die Ränder der Folie. Dies stellt sicher, dass die Lehre Markierungen auf der gegenüberliegenden Oberfläche für Gewebe Schieber Ausrichtung verwendet werden. Decken Sie die Ränder der Folie mit der Matrix, wie sie als Kontaktstellen verwendet werden, um die elektrische Leitfähigkeit der ITO-beschichtete Folie erhalten.
  3. Nach stabil und feinen Sprays eingehalten worden, manuell sprühen die Matrix, so dass es völlig Mäntel die Gewebeschnitt. Den minimalen Menge erforderlich, um gerade die Oberfläche zu benetzen, um während jedes Zyklus möglich Analyten Delokalisierung verhindern Matrixlösung. Im Allgemeinen verwenden ungefähr 10 Zyklen der Matrix zu beschichten, Spray ein Gewebeschnitt, die Anzahl der Zyklen istabhängig vom Gewebetyp und Matrixzusammensetzung.

3. MALDI-MS

  1. Bereiten Sie eine Massenkalibrierungslösung durch Verdünnen der "ES-Tuning Mix" Standardlösung mit einem Faktor von 1:200 in 60:40 Isopropanol: Wasser (mit 0,1% Ameisensäure in der fertigen Mischung).
  2. Einführen 2 ul / min des verdünnten "ES Tuning Mix"-Lösung in die Dual-Mode-Elektrospray-Ionisation (ESI) / MALDI-Ionenquelle auf der FTICR-Massenspektrometer vom ESI Seite.
  3. Bedienung des FTICR Instrument im Positiv-Ionen-ESI-Modus, mit Breitband-Erkennung und eine Datenerfassungsgröße von 1,024 kb / sec. Typische Parameter sind ESI Elektrospray-Kapillare Spannung 3.900 V; sprühen Schild Spannung 3.600 V; Vernebler Gas (N 2) Fluss, 2 L / min; Trockengas (N 2) Durchfluss und Temperatur, 4 L / min und 200 ° C; Skimmer-1-Spannung, 15 V; Flugzeit (TOF), 0,009 sec; Kollisionsgas (Ar) fließen, 0,4 l / s, Quelle Ionenakkumulation Zeit 0,1 sec;und Kollisionszelle Ionenakkumulationszeit 0,2 sek. Stimmen Sie die FTICR Betriebsparameter, um die analytische Sensitivität über den Massenbereich von m / z 200 auf 1.400 steigern und gleichzeitig gute Zeit-Domain kostenlos-Induktionszerfall (FID)-Signale. Typischerweise sind die ICR Betriebsparameter Kumpel Spannung, 8 V; Sidekick-Offset-Spannung, 8 V; Anregung Verstärkung von 10; Anregungspulszeit, 0,01 bis 0,015 sec; Frontplatte Falle Spannung, 1,5 V; zurück Falle Plattenspannung, 1,6 V und Analysator Eingangsspannung, -4 V. Nach einer Reihe von FTICR Betriebsparameter bestimmt worden ist, erwerben die ESI-Massenspektren und kalibrieren Sie das Gerät unter Verwendung der Bezugsmassen der Standardverbindungen in der "ES-Tuning Mix"-Lösung.
  4. Stimmen des Instruments für die MALDI-Betrieb löst mehrere 1 ul Aliquots eines gemischten Terfenadin und Reserpin-Standardlösung in der Matrix-Lösung bei einer Konzentration von 1 &mgr; M von jedem, und erkennen diese Lösungen direkt auf eine der tissue Abschnitte (dh ein Test Gewebeschnitt), die auf einer ITO-beschichteten Objektträger montiert worden ist. Legen Sie die ITO-beschichtete Folie in ein Gewebe Schiebeadapter (dh eine spezielle MALDI-Target) und laden Sie den Adapter aus der MALDI-Seite in die Dual-ESI / MALDI-Ionenquelle. Optimierung der geeigneten MALDI Betriebsparameter der Laserleistung und der Anzahl der Laserschüsse für MALDI-Signal Akkumulation für jeden Massenscan usw. MALDI Typische Betriebsparameter sind: Laserschüsse, 50 und eine MALDI-Platte Spannung von 300 V.
  5. Nach dem Tuning, Kalibrierung und Optimierung der Instrument für die MALDI-MSI-Experimente, richten Sie den physischen Standort von einem Gewebeschnitt mit seinen aufgezeichneten optischen Bild innerhalb der Imaging-Software abgebildet werden. Mit den drei "Korrektur-Fluid" Marken, die vorher auf der gegenüberliegenden Seite der ITO-beschichteten Gleitfläche (Schritt 1.9) gesetzt worden war, für diese Ausrichtung unter Verwendung eines Dreipunkt-Triangulationsverfahren.
  6. Führen Sie eine gleichzeitige ESI und MALDI Betrieb, so dass jede Massenspektrum enthält die Referenzmasse Gipfel der "ES Tuning Mix"-Lösung für Post-Akquisition-interne Massenkalibrierung. Dies wird in der genauesten Massenmessung während der MALDI-MS führen. Um dies zu tun, zuerst der ESI-Signal abzuschwächen durch die Verringerung der Kapillare Spannung, bis die MALDI-Signale dominieren die Spektren während die ESI Eichsignale sind immer noch hoch genug für interne Massenkalibrierung.
  7. Danach können Sie einen automatisierten Rasterverfahren für Laserbestrahlung. Die Gewebebereiche definieren, die abgebildet werden, und legen Sie die entsprechende Laserrasterschrittweite. Beachten Sie, dass kleinere Rasterschrittweiten bieten eine höhere Auflösung Gewebebilder, erfordern aber eine deutlich längere Massenspektrenerfassung Zeit und mehr Datenspeicherplatz. Die Anzahl der Bildpunkte ist abhängig von der Laserrasterschrittgröße einzurichten und das Gewebe Größe. Für ein typisches Rinderlinse, die eine 1 cm 2-Gewebegröße hat, wird ein Gewebebild typischerweise von ca. zusammensetzt.

4. Datenanalyse

  1. Kalibrieren Sie den MALDI-Massenspektren mit interner Kalibrierung für den ersten Vergleich und Spitzen für MS / MS zu wählen. De-Isotop und wählen Sie die monoisotopischen Spitzen, wie zuvor beschrieben, mit Hilfe einer angepassten VBA-Skript 38.
  2. Exportieren Sie die resultierende monoisotopischen Peaklisten und Eingabe die gemessenen m / z-Werte in die METLIN 39 und / oder 40 HMDB Metabolom-Datenbanken für Massenabgleich mit den Bibliothekseinträgen. Betrachten Sie die (M + H) +, (M + Na) + und (M + K) +-Ionen während der Datenbank-Suche, mit einem zulässigen Massenfehler von ± 1 ppm.
  3. Generieren MALDI Bilder für alle der über die gesamte Gewebeschnitt mit imag erkannt Lipid UnternehmenE-Analyse-Software, mit einem Massenfilter Breite von 1 ppm an der Peakspitze.
  4. Sobald Bilder wurden für alle m / z-Werte, die Datenbank-Einträge entsprechen generiert wurde, erzeugen Bilder für alle anderen Spitzen als auch für einzigartige Verteilungsmuster, die später untersucht werden können suchen.

5. Bestätigung der Identitäten der abgebildeten Lipide

  1. Bestätigen Sie die Identität der Hoch Fülle Lipide, die charakteristische Fragment-Ionen, die mit Hilfe der FT-ICR Gerät (zB 184,073 für Phospholipide) festgestellt werden können, durch MALDI-MS/MS haben. Führen MALDI-MS/MS mit stoßinduzierte Dissoziation (CID) direkt auf das Gewebe.
  2. Für die Lipidarten, die nicht direkt von MALDI-MS/MS bestätigt werden können, verwenden Sie eine UPLC System zu einem q-TOF-Massenspektrometer 34 gekoppelt.
    1. Manuell sezieren Aliquots enthaltend ~ 10 mg Gewebe aus dem Bereich, in dem die Spezies von Interesse lokalisiert wurde. Legen Sie diese Gewebe Aliquots in 2ml-Zentrifugenröhrchen.
    2. Homogenisieren jedes Gewebe Aliquot in 250 ul Wasser, mit einer Schwingmühle mit zwei 5-mm-Edelstahlmetallkugeln.
    3. 1 ml Chloroform-Methanol-Lösung (1:3, v / v), und die Wirbelrohre. Als nächstes zentrifugieren Verwendung einer Mikrozentrifuge bei 12.000 × g für 10 min.
    4. Sammeln Sie die Überstände und trocknen Sie sie in einer Drehzahl-Vakuum-Konzentrator.
    5. Lösen Sie die Rückstände in 100 ul 30:70 Isopropanol: Wasser. Speisen Sie einen 10-ul-Aliquot auf die UPLC-Säule für die Trennung mittels Gradientenelution.
    6. Verwenden Sie die chromatographischen Bedingungen für Online-Lipid LC-MS/MS, die bisher 34 erschienen sind.
    7. Generieren Sie extrahierten Ionenstrom (XIC) Chromatogramme mit den theoretischen m / z-Werte, mit einem Fenster von ± 50 ppm um den theoretischen Massen.
    8. Wenn authentischen Verbindungen für die Lipide sind, entsprechen den Retentionszeiten der authentischen Verbindungen mit denen der entsprechendenchenden XIC Spitzen aus den Gewebeproben. Wenn die Verbindungen die gleichen sind, sollten die Retentionszeiten und die MS / MS-Spektren überein.
  3. Wenn eine authentische Verbindung nicht verfügbar ist, verwenden Sie den Fragmentierungsmuster der detektierten Lipid einen Standard MS / MS-Spektrum aus einer Metabolom Datenbank wie METLIN oder HMDB entsprechen. Verwenden de novo spektrale Massen Interpretation, um eine mögliche Struktur für die Lipid bestimmen.

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Representative Results

Gewebeproben, die geschnitten werden und Tauwetter montiert auf die ITO-beschichtete Glasobjektträger sollte intakt sein, ohne sichtbare Reißen. Für viele Gewebe, ist die direkte Montage auf Tauwetter Gewebe einer ITO-beschichteten Objektträger akzeptabel. Für einige spezifische Gewebe, wie Rinder Linse, umfangreiche Reißen des Gewebes oft gesehen, wenn eine direkte Tauwetter Montage verwendet wird (Abbildung 1a). Vorbeschichtung der ITO-Glasobjektträger mit Ethanol oder Ameisensäure (Fig. 1b) kann die Integrität der Gewebeabschnitte während der Gewebebefestigungs aufrechtzuerhalten.

Sowohl die Wahl der Matrix und die Auswahl der Lösungsmittel sind wichtige Faktoren, die die Qualität der MALDI-Spektren. Wenn eine geeignete MALDI-MS-Spektrum aus dem Gewebeschnitt erworben hat, ist das Massenspektrum der Regel dicht mit Lipidsignale innerhalb der Masse Erfassungsbereich (Abbildung 2a). Eine Matrix und ein Lösungsmittel gewählt werden sollte, so dass sie Polaritäten aufweisenont-size: 14.399999618530273px; line-height:. 28px; "> ähnlich den Analyten von Interesse, weil die MALDI-Prozess erfordert ein Festphasen-Lösung des Analyten in der Matrix-Kristalle Allgemeinen die besten Analyten Signalintensitäten kommen aus der Nutzung MALDI-Matrizes Löslichkeiten ähnlich der des gewünschten Analyten 41,42. 2a zeigt ein Beispiel eines Spektrums mit einem effizienten Lösungsmatrix (70% ACN mit 0,01% TFA) erzeugt wird, und Fig. 2b zeigt eine schlechte Wahl der Matrix und Lösungsmittel (70% MeOH mit 0,01% TFA) für Dithranol.

Einer der Vorteile eines Dual-Mode-Elektrospray-Ionisation (ESI) / MALDI-Ionenquelle ist, dass es die Zugabe von ESI Kalibrierungssignale gleichzeitig Erfassen MALDI Spektren ohne mit dem Abtragungsprozess. Diese ESI Eichsignale ermöglichen internen Massenkalibrierung zu hohe Massengenauigkeit mit Massenfehler von <0,5 ppm 38 stellen. Da dieESI Signal der Norm "ES Tuning Mix"-Lösung kann eine Größenordnung stärker als die MALDI-Signale der Analyten aus dem Gewebe sein, müssen die ESI-abgeleiteten Eichsignale abgeschwächt werden. Kalibrierungssignale sichtbar und von ausreichender Intensität zur Eichung der Spektren sein, sollte aber nicht die Spektren dominieren.

Sobald der Satz von Massenspektren von einer MALDI-Experiment MSI erworben worden ist, kann das Bild für jedes der detektierten Ionen erzeugt werden, wobei jedes Pixel einen Laserbestrahlungspunkt von der Oberfläche eines Gewebeschnitts. Kombinieren aller der einzelnen Pixel mit unterschiedlichen Ionenstärken über die Gewebeschnitt aus einem MALDI MSI Experiment spiegelt die Ionisation von Analyten im Gewebe 1. Dies kann wiederum Informationen über den relativen Konzentrationen der Analyten in verschiedenen Abschnitten der Gewebeschnitt (Fig. 3b). Sorgfalt muss bei der Verarbeitung der entnommen werdenDaten, da viele Faktoren beeinflussen können, was gesehen wird und wie die Daten interpretiert. In den meisten Experimenten wird die Daten an den Gesamtionenstrom (TIC) in jedem Spektrum normalisiert. Ohne diese Normalisierung könnte Bereiche besser Analyt-Matrix Co-Kristallisation (dh so genannte "hot spots") stärkere Signale für die Analyten bewirken, und dies würde die Daten durch Informationen, die nicht gut mit den tatsächlichen relativen Konzentrationen korrelieren kann Skew die Analyten (Abb. 3c-3d).

Gewebepräparation können auch drastisch die das erzeugt wird, das Bild zu ändern. Wenn die Probe "zu nass" (dh zu viel Lösungsmittel aufgebracht wurde), dann die Analyten wird auf das Gewebe delokalisieren und viel von der räumlichen Informationen (3f) verloren. Das Verfahren der Datenerfassung ist auch in dem endgültigen Bild erhalten wichtig. Als MALDI-Experimente auf unbehandelten Gewebeschnitte sind von Natur aus "Dirty & #34, kann die Empfindlichkeit des Instruments über die Zeit abnehmen. Für kurze Experimente dieser Rückgang nicht offensichtlich sein, jedoch kann es ein Problem für mehr Experimente oder besonders schmutzige Proben sein. Wenn Daten linear über die Probe erfasst kann dies zu einer Standort Vorspannung führen spezifische Regionen der Gewebeschnitt wird analysiert, nachdem die Empfindlichkeit des Instruments verringert wurde. Daher ist die Verwendung zufälligen Flecken für alle Datenerfassungen wird empfohlen. Obwohl diese Methode nimmt mehr Zeit, hilft es, in den Daten zu entfernen oder zu minimieren, dieses Vorurteil.

Wie in unserer früheren Arbeit 34, im Vergleich zu CHCA und DHB gezeigt, DT aktiviert die Erkennung von weiteren Lipidspezies, wobei die Lipide mit CHCA und DBH noch nachgewiesen werden konnte nachgewiesen.

Figur 1 >
Fig. 1 ist. Tissue Montage und Schneiden. Vergleichende optische Bilder von zwei Kälberlinse Gewebeschnitte (20-um dick), ohne Ameisensäure Vorbenetzung (a) und mit Ameisensäure Vorbenetzung (b), montiert auf die ITO-beschichteten Glasobjektträger.

Figur 2
2. . Massenspektren MALDI-MS-Spektren erworben direkt aus einem Gewebeschnitt: a) ein idealer dicht besiedelten Massenspektrum mit Lipidsignale (70% ACN mit 0,01% TFA), b) eine von einem Gewebeschnitt mit einer schlechten Wahl beschichtet erzeugte Massenspektrum Lösungsmittel (70% MeOH mit 0,01% TFA). Klicken Sie hier, um eine größere Abbildung anzuzeigen .

Zelt "fo: keep-together.within-page =" always "> Fig. 3
3. MALDI MSI images Repräsentative MALDI MSI Bilder: a) eine Rinderlinse Gewebeschnitt, b) eine MSI-Bild des gleichen Gewebeschnitt, c) eine MSI-Bild zeigt einen Hintergrund Ionen, d) eine nonnormalized Ionen-Karte von der gleichen Ionen-e). ein Rinderlinse Gewebeschnitt und f) ein Ionen Karte, die eine teilweise delokalisierten Analyten aufgrund Überfeuchtung.

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Discussion

Die wichtigsten Überlegungen für eine erfolgreiche MALDI MSI sind: 1) Gewebepräparation, 2)-Matrix Wahl, 3)-Matrix-Anwendung, und 4) die Interpretation der Daten und Analysen. Wenn die Probe und die Matrix in geeigneter Weise hergestellt wurde, wird die MS-Datenerfassung automatisiert. Die Analyse der Daten aus dieser Art von Test ist sehr arbeitsintensiv.

Entsprechende Gewebeaufbereitung ist entscheidend für eine erfolgreiche MALDI MSI Experimenten. Die Quelle des Gewebes und die Handhabung kann einen großen Einfluss auf die endgültige Analyse. Die Proben werden sofort in flüssigem Stickstoff eingefroren und bei -80 ° C gelagert, und sie sollten nicht über einen längeren Zeitraum gelagert werden, da einige Metaboliten können instabil sein, auch bei -80 ° C.

Für viele Säugetiergeweben, haben 10 bis 15 um dicken Gewebeschnitten für die MALDI-MSI empfohlen worden. In diesen Experimenten wurden Kälber äquatorial Linsen in 20 um dicke Gewebe s geschnittenlices folgenden decapsulation Objektiv mit einer zuvor beschriebenen Verfahren 35. Die dickeren Kälberlinse Gewebeschnitte wurden verwendet, weil es schwierig gefunden wurde, um die Integrität einer Linse Gewebeschnitt sowohl bei der Gewebeschneiden und bei der Gewebemontage halten. Die Linse eine Kugelsymmetrie Gewebe entlang seiner Äquatorialebene, so daß nur die Scheiben nahe oder an waren die Äquatorialebene gesammelt.

Aufgrund der Schwierigkeiten bei der Aufrechterhaltung der Gewebeintegrität während der Gewebeschneiden und Montage Vorbenetzungsflüssigkeit Verwendung eines Lösungsmittels wie Ethanol (für Proteine ​​und Peptide 35) oder Ameisensäure (für Lipide) können verwendet werden. Es sollte auch darauf hingewiesen, dass für die Protein-und Peptid-Bildgebung, die Proben sind oft mit einem organischen Lösungsmittel gewaschen, um kleine Moleküle wie Lipide und Oktober für die Montage verwendet werden, zu entfernen, jedoch sollte ein Waschschritt nur mit Lösungsmitteln, die nicht lösen, die getan werden Analyten von Interesse und sollte vermieden werden small Molekülanalyse.

Die Wahl der Matrix ist auch für alle Experimente MALDI, jedoch können auf Gewebematrix Leistung nicht die gleiche Leistung wie Matrix mit einer gereinigten Standard. Beispielsweise bei minimalen Laserleistung erzeugt DT reichlich DT bezogene Hintergrundsignale aus den Gewebefreie Matrix Flecken und diese Signale wurden als die DT-Oligomere und ihre entsprechenden Natrium-und Kalium-Addukte zugeordnet, jedoch auf Gewebe viele dieser Signale waren nicht beobachtet, was, dass das Testen von verschiedenen Matrizen von der spezifischen Probe der Wahl kann wichtig bei der Auswahl der richtigen Matrix für ein bestimmtes MSI MALDI Analyse sein. DT wird selten für die Lipid-Analyse aufgrund der berichteten hohen Hintergrund von der Matrix erzeugt, jedoch wurde bei der mit DHB und CHCA Vergleich zur Vor-Gewebe Profilierung von Lipiden durch MALDI-FTICR-MS, hergestellt DT günstige Ergebnisse. So könnte diese Matrix eine potenziell nützliche Matrix für MALDI Tissue Imaging mit diesem Instrument sein

Effiziente Co-Kristallisation der Matrix und der Analyt eine Voraussetzung für eine hohe Empfindlichkeit MALDI-MS-Analyse. Somit ist die Festphasen-Löslichkeit eines Analyten in der Matrix in der MALDI-Prozesses 41,42 wichtig. MALDI-Matrizes mit ähnlichen denjenigen der gewünschten Analyten Löslichkeiten wurde berichtet, dass die stärksten Analyten Signalintensitäten zu erzeugen. Da DT ist eine schwache organische Säure, wie auch ein sehr hydrophobe organische Verbindung, bezogen auf klassische Brönsted-Lowry-Säure-Base-Neutralisationstheorie 43 und der Theorie der Löslichkeit wird es erwartet, dass die Ionisierung von positiv geladenen und weniger polaren bevorzugen Verbindungen. In der Tat haben wir festgestellt, daß polare Lipide dominiert die detektierten Verbindungen im Positiv-Ionen-Modus, wenn DT wurde als Matrix verwendet.

Die zur Herstellung einer Matrix-Lösung verwendeten Lösungsmittel spielen auch eine wichtige Rolle bei der direkten Gewebeanalyse durch MALDI-MS. Der pH-Wert wurde als ein verwickeltwichtiger Faktor bei der Wirksamkeit einer Matrix und TFA ist ein gängiges Additiv mit CHCA und DHB verwendet. Jedoch mit DT, die Zugabe einer Säure oder Base Modifizierer hatte wenig Auswirkung auf die resultierenden Daten. Aufgrund der Hydrophobie der DT und seiner begrenzten Löslichkeit in polaren Lösungsmitteln ist ein lipophile organische Lösungsmittel empfohlen. Bei der Analyse von Lipiden, einer Mischung aus Chloroform-Methanol (2:1, v: v) mit 1% Ameisensäure, die ein typisches organisches Lösungsmittel zur Lipidextraktion ist, wurde verwendet. Wir postulierten, dass diese eine bessere Co-Kristallisation von Lipiden mit DT. Die lipophile Natur des Lösungsmittels kann auch verhindern, dass die Solubilisierung von anderen Verbindungen, wie Proteine ​​und Salze, wie in früheren flüssigen Extraktionsoberflächenanalyse Massenspektrometrie (LESA-MS) Versuche 44 gezeigt. Dies würde zu einer besseren Kristallisation der Matrix und Lipide mit weniger Verunreinigungen führen. Das Lösungsmittelsystem, die für die Analyse ausgewählt wird, sollte die Löslichkeit der Matrix und die desi maximierenrot Analyten (Lipide) unter Minimierung der Löslichkeit der unerwünschten Verunreinigungen (Salze und Proteine ​​/ Peptide).

Die Beschichtung der Matrix auf der Oberfläche des Gewebes sollte so einheitlich wie möglich sein. Die räumliche Auflösung des Bildes zu maximieren, sollte die Kristallgröße so klein wie möglich sein, 45. Verwendung eines elektronischen Matrixspritzen kann die Matrix einheitlich und reproduzierbar mit einer kleinen Kristallgröße beschichtet werden. Dies ist das bevorzugte Verfahren in unserem Labor. Es wird viel manuelle Anwendung bevorzugt, da es Punktgröße, Homogenität und Reproduzierbarkeit reduziert. Viele der Lösungsmittel, die für MSI kleiner Moleküle sind, jedoch nicht mit den bei der Herstellung der automatischen Sprüher Matrix verwendeten Materialien kompatibel. Obwohl noch nicht in unserem Labor durchgeführt hat Sublimation basierten Matrix-Anwendung für Lipidanalyse 22 empfohlen. Diese Methode bietet eine verbesserte (dh verringert) Punktgröße, Homogenität und Reprobilität und das sollte wohl die Methode der Wahl sein, wenn der gewählte Matrix ist liebenswürdig zu dieser Methode.

Zur Beschichtung von Matrizen haltige Lösungsmittel mit dem automatisierten Matrix Spritzen (einschließlich Chloroform) inkompatibel ist, ist eine alternative Methode der Matrix-Beschichtung, eine Luftbürste Pistole. Für diese Matrix-Lösungen, haben wir eine pneumatisch unterstützte Airbrush-Spritzgerät. Obwohl die Verwendung des Luftpinsels gun kein ideales Verfahren, kann es die einzige Methode, die für Lösemittel und Matrizen, die mit den anderen Verfahren nicht kompatibel sind, verwendet werden kann, und-Schulung und Erfahrung kann es sehr einheitliche Matrixbeschichtung zu erzeugen. Beim manuellen Aufbringen der Matrixlösung, muss nur die minimale Menge der Flüssigkeit während jedes Zyklus angewendet werden, um kaum benetzen die Oberfläche des Gewebes. Zu viel Flüssigkeit könnte delokalisieren Analyten durch die organischen Lösemitteln. Es gibt Probleme mit der Reproduzierbarkeit manuelle Anwendung und Erfahrung in der Beschichtung der Folie mit dieser Methode, die ichist entscheidend für den Erfolg. Aufgrund der manuellen Natur des Luftpinsels gun Matrix Anwendung muß darauf geachtet werden, dass eine gleichmäßige Beschichtung hergestellt werden, eine inhomogene Beschichtung schiefe Daten führen, die repräsentativ für die Matrixschicht und nicht der Analyt Lokalisierung ist.

Bei der Durchführung von MALDI MSI Experimenten wird erste Identifizierung der detektierten Analyten in der Regel auf Metabolom-Datenbanksuche der gemessenen genauen Massen, die in der Regel sind nur verfügbar, wenn ein hochauflösendes Gerät dient 38 basiert. Die Dual-ESI / MALDI-Ionenquelle auf der Apex-Qe 12-Tesla-Hybrid-Quadrupol-FTICR-Massenspektrometer ermöglicht die Zugabe von ESI-erzeugten Signale für die Verwendung als interne Massenkalibrierungsspitzen jedem MALDI-Massenspektrum, ohne die MALDI Desorption / Ionisation. Die Verwendung interner Massenkalibrierung ist entscheidend für hohe Massenmessgenauigkeit in MALDI-FT-ICR. Externe Kalibrierung kann nicht in vollem Umfang berücksichtigt dieRaumladungseffekte in der ICR-Zelle 46-48. Die Abstimmung und Kalibrierung des FTICR ist entscheidend für den Erfolg. Auf diese Art von Instrument ein Parameter als "Time of Flight" (TOF), der die Zeit, die für eine Ionen aus der Kollisionszelle in den Analysator (ICR-Zelle) zu reisen ist eine der wichtigsten benutzerdefinierten Einstellungen, die die Nachweisempfindlichkeit eines FT-ICR Gerät beeinflussen. Innerhalb eines bestimmten Massenbereich (dh m / z 200-1,400), eine untere TOF begünstigt Erkennung der unteren m / z-Ionen und eine höhere TOF begünstigt Nachweis von höheren m / z-Ionen. So hochempfindlichen Nachweis von niedrigen und hohen m / z-Ionen innerhalb des Erfassungsmassenbereich, ist ein TOF-Wert von 9 ms wünschenswert.

Für eine praktische Experiment, muss ein Kompromiss zwischen angemessenen Datenerfassung Größe, Masse-Auflösung, und der Zeit, auf den Erwerb von bildgebenden MS-Daten ausgegeben werden. Für eine FTICR-MS-Experiment, die Größe der erfassten Daten-Datei und die Masse resolutiweiter sind abhängig von der Datenerfassungs Größe des freien Induktionszerfalls (FID-Signal). Eine höhere Datenerfassungsgröße mit einem höheren Massenauflösung und einer größeren Datendateigröße führen. Allerdings ist eine höhere Datenerfassungsgröße verursacht auch eine langsamere MS Scan-Rate. Als Kompromiß ist es empfehlenswert, dass ein Datenerfassungsgröße von 1,024 kb / sec auf der FTICR verwendet werden. Eine niedrigere Datenerfassung Größe und eine entsprechende untere Massenauflösung nicht die Trennung von einigen isobar Ionenarten zu ermöglichen.

Die Laser-Rasterschrittweite muss auch so gewählt werden, dass sie klein genug, um eine gute Pixel Auflösung für MS Bilder der Analyten von Interesse zu schaffen, jedoch kann ein sehr kleiner Schritt Rastergröße machen die Daten unüberschaubar Dateien die Prüfung eines bildgebenden MS-Datendatei wird von Tausenden von MALDI-Massenspektren zusammen. Angesichts der relativ großen Größe von Rinderlinsen, CA. 1.2 -1.5 cm Durchmesser, verwendeten wir eine Rasterschrittweite von 250 &mgr; m. Mit einem 1.024 kb / s Daten acquisition Größe und eine 250 um Rasterschrittweite, war unser Beispieldatensatz etwa 60 Gb. Während der Datenerfassung, sollte eine stichprobenartige Analyse verwendet werden, da dies verhindert, Standort-basierte Verzerrung durch allmähliche Signaldämpfung, aber zufällig vor Ort erfordert deutlich mehr Zeit, um die Daten zu erwerben.

Da die MALDI MSI Datensätze auf unserer FT-ICR MS-Gerät erworben, genaue Massendaten, können die extrahierten m / z gegen Metabolom-Datenbanken wie METLIN und / oder HMDB gesucht werden. Mit einem ± 1 ppm Fenster die ersten Aufträge von vielen Ionensignale Metaboliten sind von hoher Zuversicht. Da jedoch viele Arten haben die gleiche chemische Formel, die Bestätigung der ID muss oft mit alternativen Mitteln erfolgen. Somit MS / MS-Experimenten, und der Vergleich der MS / MS-Spektren mit den zuvor veröffentlichten Daten sollte eine Identifizierung sicher durchgeführt werden. MALDI-MS/MS Spektren kann manchmal direkt auf den FT-ICR Gerät erworben werden, aber für die many Lipidmoleküle, ihre Häufigkeiten und / oder Ionisierungseffizienz nicht ausreichend für den Erhalt nützlich MS / MS-Daten und Anreicherung und Reinigung vor der LC-MS/MS erforderlich sind. In diesen Analysen waren die meisten der beobachteten polaren Lipide Phospholipide, und wurden als PCs, PE, SMS, PSs, PGs, PAs und Ceramid-Phosphate (CERPs) zugeordnet, anderen identifizierten Lipidmoleküle beinhalten Sterin Lipide, Acylcarnitine und Glyceride. Basierend auf den Eigenschaften des Lösungsmittels und der Matrix ist dies zu erwarten. Die MS / MS-Spektren von PCs enthalten einen prominenten Peak bei m / z 184,073, die mit dem PC polaren Kopfgruppe, phosphocholine, sowie weitere strukturell wichtige Informationen, die eine eindeutige Identifizierung der Moleküle geben können, zugewiesen wurde. Zusätzlich unter Verwendung dieses Verfahrens werden viele Sterol Lipide erkannt, aber die meisten nicht eindeutig zu einzigartigen Identitäten zugewiesen werden, auch mit MS / MS-Daten. Starke Kalium-Addukte im allgemeinen überwiegen die Spektren, aber protoniert und sodiated Addukte können ebenfalls detektiert werden.

Weil die MALDI-MS-Verfahren nur in der Lage, die relative Häufigkeit Information basierend auf der lokalen Ionisationseffizienz in jedem Pixel zu erzeugen, muß Sorgfalt bei der Interpretation MALDI MSI Daten ohne stabilen Isotopen markierten internen Standards 49 entnommen werden. Außerdem für das Vertrauen in die Lokalisierungsergebnisse, die Bestätigung aller Verteilungsmuster erkannt, müssen mit Hilfe alternativer Methoden durchgeführt werden. Darstellende LC-MS/MS auf seziert Gewebeproben zur Bestätigung empfohlen.

Basierend auf den gemessenen genaue Massen in den niedrigen Massenbereich chemischen Formeln kann für ein bestimmtes m / z erzeugt werden, innerhalb einer 1 ppm Massenfehler und ermöglicht eine unbegrenzte Anzahl von C, H, O und N, und maximal 2 S 2 P und oft nur eine einzige elementare Zusammensetzung ist möglich. Das m / z auch gegen die HMDB und METLIN Datenbanken, die potenziellen Kandidaten Verbindungen ergeben können durchsucht werden. Leiderauf der FT-ICR MS die Low-Cut-off-Masse ist ca. 130 Da, die es schwierig machen, direkt ausführen MS / MS kann. So wird eine Bestätigung mit einem anderen System oft erforderlich.

Q-TOF LC-MS/MS Experimente werden üblicherweise an Gewebeproben, die von Hand aus bestimmten Bereichen der Gewebe von Interesse wurden seziert wurden durchgeführt. Mit dem beschriebenen Lipidextraktionsverfahren kann XICS für die Zielverbindungen erzeugt und MS / MS zur Bestätigung erfasst werden. Entweder Vergleich zu einem echten Standard-oder De-novo-Strukturaufklärung erforderlich ist, bevor es kann eine selbstbewusste chemische Zuordnung sein.

Dithranol verwendet wurde, um Lipidverteilungsmuster in Rinderkalbslinse zu erkunden und auch auf Ratten-Leber-, Herz-und Nierengewebe 34 getestet. MALDI MSI kann für die Diagnose von menschlichen Krankheitszuständen verwendet werden, und es wird bereits für pathologische Analyse 50 verwendet. Mit der Entwicklung robuster und schneller technologies für die MALDI-MSI, die räumliche Lokalisierung von spezifischen Verbindungen können nützliche Informationen für einen Pathologen sein. Sobald ein Analyt kann routinemäßig mit Hilfe eines MALDI MSI-basierte Verfahren abgebildet werden, können sie für diagnostische Zwecke verwendet werden. In der Tat könnte Gewebebildgebung in einem Krankenhaus durchgeführt werden, mit einem Instrument befindet sich neben dem Operationssaal, wo, wie bereits gezeigt, 51 ist, könnte sie verwendet werden, um die Ränder von Tumoren genau zu bestimmen.

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Disclosures

Wir haben nichts zu offenbaren.

Acknowledgments

Die Autoren möchten Genome Kanada und Genome British Columbia Plattform für Finanzierung und Unterstützung danken. Wir danken auch Dr. Carol E. Parker für kritische Durchsicht des Manuskripts und Bearbeitung Unterstützung. CHL auch dank der British Columbia Proteomics Netzwerk für die Unterstützung.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Rat Liver Pel-Freez Biologicals 56023-2
Bovine Calf Lens Pel-Freez Biologicals 57114-2 Sample should be decapsulated29 before use
Dithranol (DT) Sigma-Aldrich 10608 MALDI Matrix
α-Cyano-4-hydroxy-cinnamic Acid (CHCA) Sigma-Aldrich 70990 MALDI Matrix
2,5-Dihydroxybenzoic Acid (DHB) Sigma-Aldrich 85707 MALDI Matrix
Reserpine Sigma-Aldrich 83580
Terfenadine Sigma-Aldrich T9652
Formic Acid Sigma-Aldrich 14265
Ammonium Formate Sigma-Aldrich 14266
Ammonium Hydroxide Sigma-Aldrich 320145
Trifluoroacetic Acid (TFA) Sigma-Aldrich 302031
Water Sigma-Aldrich 39253
Methanol Sigma-Aldrich 34860
Acetonitrile Sigma-Aldrich 34967
Ethyl Acetate Sigma-Aldrich 34972
Isopropanol Sigma-Aldrich 34965
Chloroform Sigma-Aldrich 366927
Acetone Sigma-Aldrich 34850
Ethanol Commercial Alcohols 95%
ES Tuning Mix Agilent Technologies G2431A
ITO Coated Glass Slides Hudson Surface Technology PSI1207000 Ensure that samples are placed on the electrically conductive side
Wite-Out Shake-N-Squeeze Correction Pen Bic WOSQP11
Airbrush Sprayer Iwata Eclipse HP-CS
ImagePrep Bruker 249500-LS
MALDI adapter Bruker 235380

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Grundlegendes Protokoll Auge molekulare Bildgebung Chemie-Technik analytische Massenspektrometrie Matrix Assisted Laser Desorption / Ionisation (MALDI) Tandem-Massenspektrometrie- Lipid- Gewebe-Imaging- Rinder-Objektiv Dithranol Matrix FT-ICR (Fourier Transform Ion Zyklotron-Resonanz)
Dithranol als Matrix für Matrix Assisted Laser Desorption / Ionisation Imaging auf einem Fourier-Transformations-Ionen-Zyklotron-Resonanz-Massenspektrometer
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Le, C. H., Han, J., Borchers, C. H.… More

Le, C. H., Han, J., Borchers, C. H. Dithranol as a Matrix for Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization Imaging on a Fourier Transform Ion Cyclotron Resonance Mass Spectrometer. J. Vis. Exp. (81), e50733, doi:10.3791/50733 (2013).

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