Summary
ジスラノール（DT、1,8 - ジヒドロキシ-9,10 - ジヒドロアントラセン-9 - オン）は、以前に小分子の組織イメージングのためのMALDIマトリックスとして報告されている上に、内因性脂質のMALDIイメージングのためのDTの使用のためのプロトコル超高分解能四重極-FTICR機器上の正イオンMALDI-MSによる組織切片の表面は、ここで提供される。
Abstract
質量分析イメージング（MSI）は、主にMALDI（マトリックス支援レーザー脱離/イオン化）ベースの分析技術を用いて、組織切片の表面上の化合物の空間的局在および分布パターンを決定する。低分子量（MW）の化合物の分析を向上させることができる小分子MSI用の新しい行列は、必要とされる。 MALDIバックグラウンドシグナルを減少させながら、これらのマトリックスが増大検体信号を提供すべきである。また、このようなフーリエとして超高解像度の器具の使用は、イオンサイクロトロン共鳴（FTICR）質量分析計を変換行列信号から検体信号を分解する能力を有し、これは、部分的に背景がMALDI由来に関連する多くの問題を克服することができる行列。 FTICR MSによる準安定マトリックスクラスターの強度の低下はまた、他の機器上にマトリックスピークに関連付けられた干渉のいくつかを克服するのを助けることができる。高解像度の依然として化学同定の信頼性を提供しながら、それらは、同時に多くの化合物の分布パターンを生成することができるようなFTICR質量分析計などの器具は有利である。ジスラノール（DTは、1,8 - ジヒドロキシ-9,10 - ジヒドロアントラセン-9 - オン）は、以前に組織イメージングのためのMALDIマトリックスとして報告されている。本研究では、哺乳類の組織切片の表面からの内因性脂質のMALDIイメージングのためにDTを使用するためのプロトコルは、正イオンMALDI-MSにより、超高解像度のハイブリッド四重極にFTICR機器が提供されている。
Introduction
質量分析イメージング（MSI）は、組織切片1,2の表面に化合物の空間的局在と分布パターンを決定するための分析技術である。ペプチドおよびタンパク質の分析のためのマトリックス支援レーザー脱離/イオン化（MALDI）MSIは、10年以上にわたって使用されており、試料調製、検出感度、空間分解能、再現性、およびデータ処理のための方法で3,4大きな改善があった。組織学的に染色した切片とMSIの実験からの情報を組み合わせることにより、病理医は、病態生理学的に興味深い機能5で特定の化合物の分布を相互に関連付けることができます。
外因性薬物及びそれらの代謝産物6,7 8-10を含む小分子の分布パターンはまた、MALDI-MSの組織画像11によって問い合わせされている。脂質は、おそらく最も広く研究されているCLA両方のMS 12月17日およ びMS / MS 18のモードで、MALDIイメージングを有する化合物のSS、。小分子イメージングのためのMALDI MSIの使用は、いくつかの要因によって制限されてきた：1）MALDIマトリックスは、それ自体が豊富なイオンシグナルを発生する小分子（典型的には、M / Z <500）である。これらの豊富な信号は、小分子分析物のイオン化を抑制し、その検知19,20を妨害する可能性がある。無溶剤型マトリックスコーティング21、マトリックス昇華22、およびMALDI MS 23プレコートマトリックスは、とりわけ、小分子のMSIを改善するために開発されてきた。
低MW化合物の分析を改善することができる新たなマトリックスは小分子MSIに大きな関心である。これらのマトリックスは減少し、マトリックス信号が増加した検体信号を提供すべきである。陽イオンモードでは、2,5 -ジヒドロキシ安息香酸（DHB）及びα-シアノ-4 -ヒドロキシ桂皮酸（CHCA）がMSI 24のための2つの一般的に使用されるMALDI MS行列である22,25の高感度画像化のためのこのマトリックスの使用を可能にした、より大きな結晶を形成する傾向がある。 9 -アミノアクリジンは、正イオンモード26におけるプロトン検体のMSIおよび負イオンモードで26-29のヌクレオチドおよびリン脂質のために使用されている。 2 -メルカプトベンゾチアゾール、脂質30の効率的なMALDI検出を与えることが見出されており、マウスの脳のガングリオシド31のイメージングのために使用されている。フーリエ変換の超高分解能は、イオンサイクロトロン共鳴（FTICR）質量分析計が多少行列信号32から検体信号を解決することによって、この問題を緩和することができる変換する。 FTICR-MSを使用することの別の利点は、準安定マトリックスクラスターの強度を削減していることであるまた、これらの干渉を27に減らし、ED 33、。
ジスラノール（DT、1,8 -ジヒドロキシ-9,10 -ジヒドロアントラセン-9 -オン）の使用は、組織のイメージングのためのMALDIマトリックスは、以前に報告34されているように。この現在の研究では、詳細なプロトコールは、正イオンモードでは、ウシのレンズ組織切片の表面上の内因性脂質のMSIのためのDTの使用のために提供される。
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Protocol
1。組織セクショニング
- フラッシュフリーズ問題片を、（送料が必要な場合）を1回採取し、液体窒素を用いて、ドライアイスでそれらを出荷し、組織切片まで-80℃で保管してください。 （市販の試料が使用される場合、サンプルはこの方法で調製されることを保証する。）
- MALDIターゲットに合わせて管理可能なサイズに臓器を切った。臓器の不要な部分を切り落とす。ここで説明する本研究のために、仔ウシレンズは、組織切片の前に前述の手順35を使用してカプセル化が解除された。
- -80℃の冷凍庫から、全体の臓器を取り出して、極低温組織切断ステージに固定します。子牛レンズを修正するには、クライオスタットの組織の切断、ステージ上の水の1〜2滴を配置します。それが凝固する前にすぐに水にレンズを配置します。あるいは、最適な切削温度（OCT）化合物はまた、切削ステージに組織を固定するために使用することができる。のOCT化合物が使用される場合、ミニ、OCTの発作量が適用されるべきであると注意を切断組織切片を分析物5,36,37のイオン化及び検出を妨害する可能性のOCT化合物で汚染されないように注意しなければならない。
- クライオスタット内の温度が-18℃に平衡化させる冷たいまたは暖かい温度はそれぞれ、軟らかい又は硬い組織に使用することができる。その後、厚さ20μmのスライスに赤道組織を切断。ほとんどの組織のために10から15ミクロンの厚さのスライスを使用します。しかし、ウシ水晶体組織の脆弱な性質のために、厚さ20μmのスライスを使用した。ウシ水晶体組織の場合は、最初の組織切片を破棄し、唯一に近いか、赤道面にあるスライスを使用しています。
- 眼の水晶体組織を撮像した場合には、インジウムスズ酸化物（ITO）被覆ガラススライドの表面を濡らすためにギ酸（純度98％、LC-MSグレード）1.5μLを使用する。
- 慎重にITO - コの表面に組織切片を転送するクライオスタット内部のガラスの顕微鏡スライドをated。組織切片を迅速に解凍し、スライド表面にしっかりと貼り付けられなろう。通常、複数の組織切片は、このように同一のITOコーティングされたスライド上に搭載することができる。
- MALDIマトリックスの適用の前に15分間、スライドを凍結乾燥する。
- マトリックステストのために、適切な溶媒中での個々の行列を溶かす。手動で組織切片上に、各マトリックス溶液1μLを発見。さらに、MALDI感度を検証するための組織上に小分子校正標準を見つける。
- 修正流体ペンでITO被覆ガラススライドの非導電性の表面に書き込むことで、ITO被覆ガラススライドに3教授マークを追加。フラットベッドスキャナを使用して、組織スライドの光学像を取得し、TIFFやJPGなどの適切な形式で保存。
2。マトリックスコーティング
2.1。自動化されたマトリックスコーティング
- AP自動的ブルカーImagePrep又は類似の電子マトリクス噴霧器を用いて組織切片の表面に、溶媒としてアセトニトリルまたは混合アセトニトリル/水を含有するプライマトリックス溶液。
- マトリックスはコートスライドのエッジをしないようにテープでITO被覆ガラススライドの表面の縁部を覆う。これは、反対側の面に教示マークが組織スライドアラインメントのために使用することができることを保証する。これらはITOでコーティングされたスライドの導電性を維持するために、接触点として使用されるようなマトリクスを有するスライドのエッジをカバーしない。
- コートマトリックスコーティング（2秒の噴霧、30秒のインキュベーション、および各サイクル60秒の乾燥時間）の20サイクルを用いてガラススライド。
2.2。手動マトリックスコーティング
- 電子マトリックス噴霧器の製造材料と互換性のない有機溶媒（ 例えば 、クロロホルム、酢酸エチル）はrequiである場合赤、行列を適用するために、空気圧アシストエアブラシ噴霧器を使用しています。エアブラシ銃の溶剤タンクに準備されたマトリックス溶液を追加し、プライムスプレーに加圧された窒素ガスの穏やかな流れを適用します。
- マトリックスはコートスライドのエッジをしないようにテープでITO被覆ガラススライドの表面の縁部を覆う。これは、反対側の面に教示マークが組織スライドアラインメントのために使用することができることを保証する。これらはITOでコーティングされたスライドの導電性を維持するために、接触点として使用されるようなマトリクスを有するスライドのエッジをカバーしない。
- 安定であり、微細なスプレーは、組織切片、それを完全に被覆するようにマトリックスを手動スプレー、観察された後。かろうじて可能な分析物の非局在化を防止するために、各サイクル中に表面を濡らすために必要なマトリックス溶液の最小量を適用する。一般に、コーティングするために組織切片をマトリックススプレーの約10サイクルを使用し、サイクル数である組織型とマトリックス組成に依存。
3。 MALDI MS
- 水（最終混合物中の0.1％ギ酸を含む）：60:40イソプロパノール中1:200倍「ESチューニングミックス」標準液を希釈することにより、質量キャリブレーション溶液を調製する。
- 2μlの/デュアルモードエレクトロスプレーイオン化（ESI）ESI側からFTICR質量分析計の/ MALDIイオン源内へ希釈し「ESチューニングミックス」溶液の分を導入する。
- ブロードバンドの検出および1024キロバイト/秒のデータ収集サイズで、正イオンESIモードでFTICR機器を操作してください。典型的なESIパラメータは、キャピラリエレクトロスプレー電圧は、3,900 Vであり;シールド電圧3,600 Vスプレー、ネブライザーガス（N 2）フロー、2 L /分、乾燥ガス（N 2）の流れ、温度、4 L /分、200°C;飛行時間（TOF）、0.009秒;、衝突ガス（Ar）流量、0.4 L /秒;ソースイオン蓄積時間は0.1秒で1電圧、15 Vスキマー;衝突セルのイオン蓄積時間、0.2秒。良好な時間領域自由誘導減衰（FID）信号を維持しながら、のm / z 200〜1,400質量範囲にわたって分析感度を最大にするために同調FTICR動作パラメータ。一般的に、ICR動作パラメータが相棒電圧、8 Vである。相棒オフセット電圧、8 V、10の励起増幅;励起パルス時間、0.01から0.015秒、フロントトラッププレート電圧、1.5 V、背トラッププレート電圧、1.6 Vと分析器の入口電圧-4 FTICR動作パラメータのセットが決定された後V.、ESI質量スペクトルを取得し、「ESチューニングミックス」溶液中の標準化合物の質量基準を使用して機器を較正する。
- チューニングする楽器MALDI操作のため、各1μMの濃度でマトリックス溶液中で混合テルフェナジンとレセルピン標準溶液を数1μlを溶かしてTISSUの1に直接これらのソリューションを見つけるITOコーティングされたスライド上に搭載された電子部（ すなわち、試験組織切片）。組織スライドアダプタにITO被覆スライドを置きます（ つまり特別なMALDI標的）とデュアルESI / MALDIイオン源へのMALDI側からアダプタをロードします。各質量走査のためのMALDI信号の蓄積などのためのレーザパワーとレーザショット数に適したMALDI動作パラメータを最適化する典型的なMALDI動作パラメータは次のとおりです。レーザーショット、50、および300 VのMALDIプレート電圧
- 、チューニング校正、およびMALDI-MSI実験のために測定器を最適化した後、画像処理ソフトウェア内での記録された光学像を撮像すべき組織切片の物理的な位置に合わせます。三点三角測量法を使用して、この位置合わせのために、以前にITOコーティングされたスライド面とは反対側に配置された三つの "補正流体」マーク（ステップ1.9）を使用する。
- 同時ESIおよびMALを行うDI動作各質量スペクトルは、ポスト取込み内部質量較正のための「ESチューニングミックス」溶液の基準質量ピークを含むようにする。これは、MALDI MSの中の最も正確な質量測定になります。 ESIの較正信号は依然として内部質量較正のために十分に高いながらMALDI信号がスペクトルを支配するまで、これを行うには、最初のキャピラリー電圧を減少させることによってESI信号を減衰させる。
- 次に、レーザ照射のための自動化されたラスタ方式を設定します。撮像される組織領域を定義し、適切なレーザーラスタステップサイズを設定する。小さいラスタステップサイズは、より高い解像度の組織画像を提供することに留意されたいが、かなり長い質量スペクトルの取得時間とより多くのデータ·ストレージ·スペースを必要とする。画像のピクセル数を設定するには、レーザーラスターステップサイズおよび組織のサイズに依存している。 1cm 2の組織サイズを有する代表的なウシのレンズについては、組織像は、典型的には約構成されている。
4。データ解析
- 最初の比較のために内部キャリブレーションを使用して、MALDI質量スペクトルを校正し、MS / MSのピークを選択する。デ同位体およびカスタマイズされたVBAスクリプト38を使用して、前述したようにモノアイソトピックピークを選択します。
- エクスポートモノアイソトピックピークリストとMETLIN 39および/ またはライブラリエントリを持つマスマッチングのためHMDB 40メタボロームのデータベースへの入力で測定m / z値を生じた。 ±1ppmでの許容質量誤差で、データベース検索の際に（M + H）+、（M + Na）の+、および（M + K）+イオンを考えてみましょう。
- IMAGを使用して、全組織切片全体で検出された脂質のエンティティのすべてのためのMALDIの画像を生成するピーク頂点で1 ppmの質量フィルタ幅と電子解析ソフトウェア。
- 画像は、データベースエントリに一致するすべてのm / z値のために生成されたら、後で調査することができるユニークな分布パターンを探すために、並びに、他のすべてのピークについての画像を生成する。
5。イメージされ脂質の身元の確認
- MALDI-MS/MSにより、FTICR機器（リン脂質など 184.073）を用いて検出することができる特徴的なフラグメントイオンを有する高存在脂質のアイデンティティを確認してください。直接組織に衝突誘起解離（CID）を使用してMALDI-MS/MSを実行します。
- 直接MALDI-MS/MSにより確認することができないそれらの脂質種に対しては、q-TOF質量分析計34に接続されたUPLCシステムを使用する。
- 手動で対象となる種がローカライズされた地域からの組織〜10 mgのアリコートを分析。 2に、これらの組織のアリコートを配置mlの遠心管。
- 2つの5のステンレス鋼金属ボールミキサーミルを用いて、水250μlの各組織アリコートを均質化する。
- クロロホルム - メタノール溶液（1:3、v / v）を、ボルテックスチューブを1ml加える。次に、10分間、12,000×gで微量遠心を用いてチューブを遠心する。
- 上清を収集し、回転速度真空濃縮器でそれらを乾燥させます。
- 水：30:70イソプロパノール100μlに残基を溶解する。勾配溶出を用いた分離のためのUPLCカラムに10μlのアリコートを注入する。
- 以前に34公開されているオンラインの脂質LC-MS/MS用のクロマトグラフィー条件を使用してください。
- 生成抽出イオン電流（XIC）は理論上の質量中心に±50ppmのウィンドウで、理論的なm / z値を使用して、クロマトグラム。
- これらの脂質の本物の化合物が利用可能である場合、対応のものと本物の化合物の保持時間と一致する組織サンプルからXICピークをsponding。化合物が同じである場合、保持時間およびMS / MSスペクトルが一致する必要があります。
- 本格的な化合物が使用できない場合は、このようなMETLINやHMDBなどメタボロームデータベースから標準のMS / MSスペクトルと一致するように検出された脂質の断片化パターンを使用しています。脂質の可能な構造を決定するために新たに質量スペクトルの解釈を使用してください。
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Representative Results
ITO被覆ガラススライド上に切片化し、解凍が搭載された組織サンプルは、目に見える引き裂きせず、無傷であるべきである。多くの組織は、ITO被覆ガラススライド上に直接マウント組織融解は許容される。直接融解の装着が（図1a）が使用されるとき、ウシレンズなどのいくつかの特定の組織、組織の広範な引き裂きがしばしば見られる。エタノールまたはギ酸でITOガラススライド（ 図1b）のプレコートは、組織取付時に組織切片の完全性を維持するのに役立つ。
マトリックスの選択は、溶媒の選択は両方とも、MALDIスペクトルの質に影響を与える重要な要因である。適当なMALDI MSスペクトルは組織切片から取得されると、質量スペクトルは、質量検出範囲（ 図2a）内の脂質シグナルに通常密である。それらは極性を有するようにマトリックス、溶媒を選択すべきであるONT-サイズ：14.399999618530273px;行の高さ：28px; ">目的の分析と同様に、MALDIプロセスは、マトリックス結晶中の検体の固相溶液を必要とするため、一般的には最高の検体信号強度は、使用から来る。所望の検体と同様の溶解度を有するMALDIマトリックスの41,42。 図2aは、（0.01％TFA、70％ACN）効率的なマトリックス溶媒を用いて製造スペクトルの一例を示し、 図2bは、マトリックスの不十分な選択を示し、ジスラノールのための溶媒（0.01％TFAを含む70％メタノール）。
デュアルモードエレクトロスプレーイオン化（ESI）/ MALDIイオン源の利点の1つは同時にアブレーションプロセスを妨害することなくMALDIスペクトルを取得しながら、ESIの較正信号の加算を可能にすることである。これらのESIキャリ信号が<0.5 ppmの38の質量誤差で高い質量精度を提供するために、内部質量校正を可能にします。として標準「ESチューニングミックス」の溶液のESI信号が組織からの検体のMALDIシグナルよりも強い一桁とすることができ、ESI由来の較正信号が減衰されている必要があります。キャリ信号が表示され、スペクトルの校正のために十分な強度のものであるべきであるが、スペクトルを支配してはならない。
MALDI-MSI実験からの質量スペクトルのセットが取得されると、検出されたイオンの各々の画像は、組織切片の表面からのレーザ照射スポットを表す各画素で生成することができる。 MALDI MSI実験からの組織切片を横切る異なるイオン強度を有する個々の画素の全てを組み合わせることは、組織1内の標的分析物のイオン化を反映している。これは、次に、組織切片（ 図3b）の異なる部分中の分析物の相対濃度に関する情報を提供することができる。ケアは処理に注意する必要があります多くの要因からのデータが見られ、どのようにデータを解釈しているか影響を与えることができます。ほとんどの実験では、データは、各スペクトル内の総イオン電流（TIC）に正規化される。この正規化することなく、優れた分析物-マトリックス共結晶化（ すなわち 、いわゆる「ホットスポット」）のある地域は、分析のための強力なシグナルが発生する可能性があり、これは、実際の相対濃度とよく相関しない可能性のある情報を提供することで、データをゆがめるだろう分析対象物（ 図3C-3D）。
組織標本も飛躍的に生成された画像を変更することができます。サンプルは（ つまり、あまりにも多くの溶媒が適用された）「あまりにもウェット」の場合は、検体は、組織上非局在化し、空間的な情報の多くは、（ 図3f）が失われます。データ収集の方法はまた、得られた最終画像において重要である。未処理の組織切片上のMALDI実験は、本質的に「ダーティ＆＃そのまま34;、機器の感度は、時間の経過とともに低下することがあります。短い実験のために、この減少は明らかではないかもしれませんが、それはもはや実験や特に汚れたサンプルのために問題になる可能性があります。データは、試料を横切って直線的に取得された場合、機器の感度が低下した後に組織切片の特定領域を分析するように、これは位置的バイアスをもたらすことができる。そのため、すべてのデータの取得のためのランダムなスポットの使用をおすすめします。この方法は時間がかかりますが、データはこの偏りを削除するか、最小限に抑えることができます。
CHCAおよびDHBに比べ前報34に示すように、CHCAと胸高直径で検出した脂質は、まだ検出することができ、一方、DTは、追加の脂質種の検出を可能にした。
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図1。組織取付切削。蟻酸事前湿潤の（a）、およびギ酸プレウェッティングでない2つの仔ウシレンズ組織切片（厚さ20μm）の比較例の光像を、（b）は 、ITO被覆ガラススライド上にマウントした。
図2。 。質量スペクトルのMALDI MSスペクトルは、組織切片から直接取得します。a）理想的な0.01％のTFAを含む脂質信号に人口密度の高いマススペクトル（70％ACN）と、b）のお粗末な選択でコーティングされた組織切片から生成された質量スペクトル溶剤（0.01％TFAを含む70％メタノール）。 大きな画像を見るにはここをクリックしてください 。
図3。 MALDIのMSI画像代表MALDIのMSI画像：A）は、ウシ水晶体組織部と同じ組織切片のb）は、MSIの画像、背景のイオンを示すC）MSIの画像、同じイオンEのD）非正規化イオンマップ）。ウシ水晶体組織部と、F）はoverwettingに部分的に非局在化した分析対象物を示すイオンマップ。
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Discussion
成功MALDI MSIのための最も重要な考慮事項は次のとおりである：1）組織調製、2）行列の選択、3）は、行列のアプリケーション、4）データの解釈と分析。試料とマトリックスを適切に調製する場合、MSデータの取得が自動化される。この種の実験からのデータ分析は、非常に労働集約的である。
適切な組織標本が成功し、MALDI MSIの実験のために非常に重要です。組織の供給源と取り扱いは、最終的な分析に大きな影響を与えることができます。サンプルは直ちに液体窒素中で凍結し、-80℃で保存し、いくつかの代謝物は-80℃であっても不安定であることができるように、それらは長期間記憶されるべきではないでフラッシュされなければならない
多くの哺乳動物の組織のために、10月15日厚組織切片をMALDI MSIのために推奨されています。これらの実験では、仔ウシレンズは厚さ20μmの組織Sに赤道切断した前述の手順35を用いたレンズカプセル解除を次のリス広場。それは、組織の切断中および組織中の両方の取り付け、レンズ組織切片の完全性を維持することは困難で見つかったため、より厚い仔ウシレンズ組織切片を用いた。レンズは、その赤道面に沿って球状に対称的な組織に近かったので、唯一のスライス、または赤道面を集めた、である。
原因（脂質）またはギ酸（タンパク質およびペプチド35）組織の切断の間、組織の完全性を維持し、取り付け、エタノール等の溶媒を用いてプレウェッティングが困難に用いることができる。それはまた、タンパク質およびペプチドイメージングのために、サンプルは頻繁に取り付けるために使用される脂質およびOCTを含む小分子を除去し、有機溶媒で洗浄することに留意すべきであるが、洗浄工程は、溶解しない溶媒を用いて行うべきである目的の分析、およびSMAのために避けるべきであるLL分子分析。
マトリックスの選択はまた、すべてのMALDI実験のために重要であるが、上の組織マトリックスの性能は、精製された規格の行列の性能とは異なる場合があります。例えば、最小のレーザーパワーで、DTは組織のない行列スポットから豊富なDT関連のバックグラウンド信号を生成し、これらの信号は、DTオリゴマーとそれに対応するナトリウムやカリウム付加物として割り当てられたが、組織上、これらの信号の多くはなかった任意の特定のサンプル上の異なるマトリックスの試験は所与のMSI MALDI分析のための適切なマトリックスを選択する際に重要であり得ることを示す、観察されない。 DTはほとんど、マトリックスによって生成された報告された高いバックグラウンドを脂質分析のために使用されていない、MALDI-FTICR MSによる脂質の上の組織プロファイリングのためDHBとCHCAと比較した場合しかし、DT、良好な結果が得られた。したがって、この行列は、この装置を用いて、MALDI組織画像化のための潜在的に有用なマトリックスかもしれない 効率的な行列の共結晶化および分析物は、高感度のMALDI-MS分析のための前提条件である。従って、マトリックス中の分析物の固相への溶解度は、MALDIプロセス41,42において重要である。所望の検体と同様の溶解度を有するMALDIマトリックスは、最も強い検体信号強度を生成することが報告されている。 DTは、弱有機酸、ならびに古典的なブレンステッド-ローリー酸-塩基中和理論43および溶解性理論に基づいて、非常に疎水性有機化合物であるので、正に帯電し、低極性のイオン化に有利に働くことが期待される化合物。実際に、我々は、DTをマトリックスとして用いた場合、極性脂質は、正イオンモードで検出された化合物を支配することを見出した。 マトリックス溶液を調製するために使用される溶媒は、MALDI-MSによる直接組織分析において重要な役割を果たす。 pHがあることが示唆されている重要なマトリックスの有効性の要因、およびTFAをCHCAとDHBで使用される一般的な添加剤である。しかし、DTで、酸または塩基変性剤の添加は、得られたデータにほとんど影響を及ぼさなかった。なぜならDTと極性溶媒中での限られた溶解性の疎水性、親油性有機溶剤をお勧めします。脂質を分析する場合、クロロホルム - メタノールの混合物（2:1、V：V）の脂質抽出のための典型的な有機溶媒は、1％ギ酸で、使用された。これは、DTと脂質の良い共結晶を提供すると仮定。前の液体抽出表面分析質量分析（LESA-MS）実験44で示されるように、溶媒の親油性の性質はまた、タンパク質および塩などの他の化合物の可溶化を防止することができる。これは、より少ない汚染物質とマトリックスと脂質の良い結晶化につながる。分析のために選択された溶媒系は、マトリックスの溶解度およびデジを最大にしなければならない赤の検体（脂質）、不要な汚染物質（塩およびタンパク質/ペプチド）の溶解度を最小限に抑えます。 組織の表面上にマトリクスのコーティングは可能な限り均一であるべきである。画像の空間分解能を最大にするために、結晶サイズが45できるだけ小さくすべきである。電子マトリックス噴霧器を用いて、マトリックスは、小さな結晶サイズを有する均一かつ再現可能に被覆することができる。これが私たちの研究室で好ましい方法である。それはスポットサイズ、均一性、および再現性を低下させるようにそれは非常に手動適用に好適である。しかし、小分子のMSIに有効である溶媒の多くが自動化された行列噴霧器の製造に使用される材料と互換性がありません。まだ我々の研究室で実施されていないが、昇華基づくマトリックス·アプリケーションは、脂質分析の22のために推奨されている。この方法は、改善された（ すなわち、還元）、スポットサイズ、均一性、およびリプロダクティブを提供IBILITY、選択した行列は、このメソッドへの愛想のとき、これはおそらく、選択した方法でなければなりません。 （クロロホルムを含む）を自動化されたマトリックス噴霧器と互換性の溶媒を含有するマトリックスのコーティングのために、マトリックスコーティングの代替方法は、エアーブラシガンを使用することである。これらのマトリックス溶液のために、我々は空気圧で補助さエアブラシ噴霧器を使用していました。エアーブラシ銃の使用が理想的な方法ではないが、それは他の方法と不適合である溶媒およびマトリックスのために使用することができる唯一の方法であってもよい、および-で訓練と経験が非常に均一なマトリックスコーティングを生成することができる。手動マトリックス溶液を適用する場合、液体の唯一の最小量は、ほとんどの組織の表面を濡らすために、各サイクルの間に適用する必要があります。あまりにも多くの液体は、潜在的に有機溶剤による検体を非局在化できた。マニュアル、アプリケーションと経験を持つ再現性の問題は、この方法でスライドをコーティングであり、私成功に不可欠だ。原因エアブラシ銃行列アプリケーションのマニュアル性質のため、注意が均一なコーティングがなされているように注意する必要があります。不均一なコーティングはマトリックスコーティングではなく、分析物の局在を表している、歪んだデータにつながる可能性があります。 MALDI MSI実験を行う際に、検出された分析物の最初の同定は、通常、高解像度の機器が38を使用する場合に通常は利用可能です測定された正確な質量のメタボロームデータベース検索に基づいています。エイペックス-Qeが12テスラハイブリッド四重極-FTICR質量分析計でデュアルESI / MALDIイオンソース/ MALDI脱着に影響を与えることなく、それぞれのMALDI質量スペクトルを内部質量較正ピークとして使用するためのESI-生成された信号の付加を可能にするイオン化プロセス。内部質量校正の使用は、MALDI-FTICRでの高い質量測定精度のために重要である。外部キャリブレーションは、完全に考慮に入れることはできませんICRセル46-48内の空間電荷効果。 FTICRのチューニングとキャリブレーションが成功のために不可欠である。楽器のこのタイプのそれは分析装置（ICRセル）にコリジョンセルから移動するイオンにかかる時間である「飛行時間」（TOF）と呼ばれるパラメータが、最も重要なものの一つであり、ユーザ定義FTICR装置の検出感度に影響を与える設定。所定の質量範囲（ すなわち、のm / z 200-1,400）内に、低級TOFは、下のm / zのイオンの検出に有利で 、より高いTOFは、より高いのm / zのイオンの検出に有利で ある。従って、検出質量範囲内の双方低および高のm / zのイオンの高感度検出のために、9ミリ秒のTOF値が望ましい。 実用的な実験のために、トレードオフが妥当なデータ取得·サイズ、質量分解能、およびMS用撮像データを取得するに費やされる時間の間に行われなければならない。 FTICR MS実験のために、取得されたデータファイルのサイズおよび質量resoluti上の自由誘導減衰（FID）信号のデータ収集のサイズに依存している。より高いデータ収集·サイズは、より高い質量分解能およびより大きなデータファイルのサイズをもたらすであろう。しかし、より高いデータ収集サイズも遅いMS走査速度を引き起こす。トレードオフとして、1024キロバイト/秒のデータ収集サイズはFTICR上で使用することをお勧めします。下のデータ収集のサイズと対応する低質量分解能は、いくつかのアイソバリックなイオン種の分離を可能にしない。 それは目的の分析物のMS画像の良好なピクセル解像度を提供するのに十分小さくなるようにレーザラスタ化ステップサイズもまた選択されなければならないが、非常に小さなラスタステップサイズは、管理不能なデータファイルはMS撮像データファイルを検討することができMALDI質量スペクトルの数千から構成されている。ウシレンズ、 約直径1.2 -1.5センチの比較的大きなサイズを考えると、我々は、250μmのラスタステップサイズを用いる。 1024キロバイト/秒のデータACQUを使用してisitionサイズと250μmのラスタステップサイズは、サンプル·データセットは、約60 GBでした。これが原因で徐々に信号の減衰に位置ベースのバイアスを防止するように、データ収集中に、ランダムスポット分析は、使用されるべきであるが、ランダム点データを取得するためにかなり長い時間を必要とする。 私たちのFTICR MS機器で取得したMALDI MSIデータセットが精密質量データが含まれるため、抽出されたm / zは、METLINおよび/またはHMDBなどのメタボロームデータベースに対して検索することができます。 ±1ppmのウィンドウを使用して、代謝物には多くのイオン信号の初期割り当ては、高い信頼性である。多くの種は、同じ化学式を有しているので、IDの確認が頻繁に代替手段を使用して行われなければならない。従って、MS / MS実験は、以前に公開されたデータとMS / MSスペクトルの比較は、確信して同定のために行われるべきである。 MALDI-MS/MSスペクトルは時々FTICR機器で直接取得しますが、マサチューセッツ州であることができるnyの脂質分子は、それらの存在量及び/又はイオン化効率は、有用なMS / MSデータを得るために不十分であり、前のLC-MS/MSの濃縮および精製が必要とされる。これらの分析では、観察された脂質のほとんどが極性リン脂質ようで、パソコン、PES、SMS、のPS、PGは、PAは、セラミドホスフェート（CerPs）として割り当てられた。同定された他の脂質分子は、ステロール脂質、アシルカルニチン、およびグリセリドが含まれています。溶媒およびマトリックスの特性に基づいて、これが予想される。パソコンのMS / MSスペクトルは、極性のPC頭部基、ホスホコリだけでなく、分子の明確な識別を与えることができ、追加の構造的に重要な情報に起因しているのm / z 184.073、で顕著なピークが含まれています。さらに、この方法を用いて、多数のステロール脂質が検出されたが、ほとんどが明確であってもMS / MSデータと、一意のIDに割り当てることができない。強力なカリウム付加物は、一般的にスペクトルを一世を風靡ますが、プロトン化およびsodiated個の付加物も検出することができる。 MALDI MSのプロセスのみが、各ピクセル内のローカルイオン化効率に基づいた相対的な存在度情報を提供することが可能であるため、安定同位体標識した内部標準49なしに、MALDI MSIデータを解釈する際に、注意が必要です。さらに、定位結果の信頼性のために、検出された分布パターンの確認は、別の方法を使用して行う必要があります。確認のために解剖した組織サンプルでのLC-MS/MSを実行することはお勧めします。 低質量範囲の化学式で測定した正確な質量に基づいて、指定されたm / zのために生成することができ、1ppmの質量誤差の範囲内と許可C、H、O、Nおよび無制限の数、および2 Sの最大そして2 Pは、多くの場合、単一の元素組成が可能です。これのm / zはまた、潜在的な候補化合物を得てもよく、HMDBとMETLINデータベースに対して検索することができる。残念ながら、FTICR MSに低質量カットオフはCAです。それが困難直接MS / MSを実行するために行うことができる130ダ、。このように、別のシステムを使用して確認がしばしば必要とされる。 Q-TOFのLC-MS/MS実験は、一般的に手作業で目的の組織の特定の領域から解剖された組織サンプルで実施されています。記載の脂質抽出法を用いて、XICSは、標的化合物について生成することができ、MS / MSは、確認のために取得することができる。自信を持って、化学の割り当てが存在することができる前に、本 格的な標準と比較、または新規の構造解明のどちらかが必要です。 ジスラノールは、ウシ胎仔レンズ内脂質分布のパターンを探索するために使用され、また、ラットの肝臓、心臓、および腎臓組織34上でテストされている。 MALDI MSIは、ヒトの疾患状態の診断のために使用することができ、既に病的な分析50のために使用されている。より堅牢かつ迅速トンの発展に伴いMALDI MSI、特定の化合物の空間的な局在化のためのechnologiesは病理医のための有用な情報かもしれません。分析物が日常的にMALDI MSIベースの方法を使用して画像化することができると、それは、診断目的のために使用することができる。実際には、組織のイメージングは既に次の51実証されているように、正確に腫瘍のマージンを決定するために使用することができ、手術室に位置する計測器と、病院の設定で行うことができる。
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Disclosures
我々は、開示することは何もありません。
Acknowledgments
著者らは、プラットフォームの資金調達、およびサポートのためにゲノムカナダ、ゲノムブリティッシュ·コロンビア州を承認したいと思います。また、原稿と編集支援の重要なレビューのために博士はキャロルE.パーカーに感謝します。 CHLもサポートしてくれてありがとうブリティッシュコロンビア州プロテオミクス·ネットワーク。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Rat Liver | Pel-Freez Biologicals | 56023-2 | |
| Bovine Calf Lens | Pel-Freez Biologicals | 57114-2 | Sample should be decapsulated29 before use |
| Dithranol (DT) | Sigma-Aldrich | 10608 | MALDI Matrix |
| α-Cyano-4-hydroxy-cinnamic Acid (CHCA) | Sigma-Aldrich | 70990 | MALDI Matrix |
| 2,5-Dihydroxybenzoic Acid (DHB) | Sigma-Aldrich | 85707 | MALDI Matrix |
| Reserpine | Sigma-Aldrich | 83580 | |
| Terfenadine | Sigma-Aldrich | T9652 | |
| Formic Acid | Sigma-Aldrich | 14265 | |
| Ammonium Formate | Sigma-Aldrich | 14266 | |
| Ammonium Hydroxide | Sigma-Aldrich | 320145 | |
| Trifluoroacetic Acid (TFA) | Sigma-Aldrich | 302031 | |
| Water | Sigma-Aldrich | 39253 | |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 34860 | |
| Acetonitrile | Sigma-Aldrich | 34967 | |
| Ethyl Acetate | Sigma-Aldrich | 34972 | |
| Isopropanol | Sigma-Aldrich | 34965 | |
| Chloroform | Sigma-Aldrich | 366927 | |
| Acetone | Sigma-Aldrich | 34850 | |
| Ethanol | Commercial Alcohols | 95% | |
| ES Tuning Mix | Agilent Technologies | G2431A | |
| ITO Coated Glass Slides | Hudson Surface Technology | PSI1207000 | Ensure that samples are placed on the electrically conductive side |
| Wite-Out Shake-N-Squeeze Correction Pen | Bic | WOSQP11 | |
| Airbrush Sprayer | Iwata | Eclipse HP-CS | |
| ImagePrep | Bruker | 249500-LS | |
| MALDI adapter | Bruker | 235380 |
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