Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Dithranol som en matrise for Matrix Assisted Laser desorpsjon / Ionization Imaging på en Fourier Transform Ion syklotron Resonans Mass Spectrometer

Published: November 26, 2013 doi: 10.3791/50733
Automatic Translation
1,2, 1, 1,2
1University of Victoria-Genome BC Proteomics Centre, University of Victoria, 2Department of Biochemistry and Microbiology, University of Victoria

Summary

Dithranol (DT, 1,8-dihydroksy-9 ,10-dihydroanthracen-9-on) er tidligere blitt rapportert som en MALDI matriks for vev avbildning av små molekyler, protokoller for anvendelse av DT for MALDI avbildning av endogene lipider på overflaten av vevssnitt av positiv-ion MALDI-MS på en ultrahøy oppløsning kvadrupole-FTICR instrument er gitt her.

Abstract

Massespektrometri imaging (MSI) bestemmer hvilke romlige lokalisering-og fordelingsmønster av forbindelser på overflaten av et vev-delen, hovedsakelig ved hjelp av MALDI (matrix assistert laser desorpsjon / ionisering)-basert analyseteknikker. Nye matriser for små-molekyl MSI, som kan forbedre analysen av lav-molekylvekt (MW) forbindelser, er nødvendig. Disse matrisene skal gi økt analyse signaler samtidig redusere MALDI bakgrunnssignaler. I tillegg, ved bruk av instrumenter ultrahøy oppløsning, for eksempel Fourier transform ion syklotron resonans (FTICR) massespektrometre, har evnen til å løse analytt signaler fra matrise-signaler, og dette kan delvis overvinnes mange problemer forbundet med bakgrunnen som stammer fra MALDI matrise. Reduksjonen i intensitetene av de metastabile matrise klynger av FTICR MS kan også bidra til å overvinne noen av de forstyrrelser i forbindelse med matriks-topper på andre instrumenter. Høyoppløseliginstrumenter som de FTICR massespektrometre er en fordel som de kan produsere distribusjon mønstre av mange forbindelser samtidig samtidig som du får tillit til kjemiske identifikasjoner. Dithranol (DT, 1,8-dihydroksy-9 ,10-dihydroanthracen-9-on) er tidligere blitt rapportert som en MALDI matriks for vev avbildning. I dette arbeidet, en protokoll for anvendelse av DT for MALDI avbildning av endogene lipider fra overflaten av pattedyr vevssnitt, ved positiv-ion MALDI-MS, på en ultrahøy oppløsning hybrid kvadrupol FTICR instrument er gitt.

Introduction

Massespektrometri imaging (MSI) er en analytisk teknikk for bestemmelse av den romlige lokalisering-og fordelingsmønster av forbindelser på overflaten av et vev-delen 1,2. Matrix assistert laser desorpsjon / ionisering (MALDI) MSI for analyse av peptider og proteiner har blitt brukt i over et tiår, og det har vært store forbedringer i metoder for prøveopparbeidelse, følsomhet, romlig oppløsning, reproduserbarhet og databehandling 3,4. Ved å kombinere informasjon fra histologisk farget seksjoner og MSI eksperimenter, patologer er i stand til å relatere de fordelinger av spesifikke forbindelser med pathophysiologically interessante funksjoner fem.

Fordelingsmønsteret av små molekyler, inkludert eksogene stoffer 6,7 og deres metabolitter 8-10 har også blitt avhørt av MALDI-MS vev bildebehandling 11. Lipider er kanskje den mest utbredte studert CLAss av forbindelser med MALDI bildebehandling, både i MS 12-17 og MS / MS 18 moduser. Bruken av MALDI MSI for lite molekyl avbildning har vært begrenset av en rekke faktorer: 1) MALDI matriser er selv små molekyler (typisk m / z <500), som genererer rikelig ion signaler. Disse rike signaler kan undertrykke ionisering av små-molekyl analytter og forstyrre deres oppdagelse 19,20. Løsningsmiddel-fri matrisebelegg 21, matrisesublimering 22, og matrise forbelagt MALDI MS 23, blant andre, har blitt utviklet for å forbedre MSI av små molekyler.

Nye matriser som kan forbedre analysen av lav MW forbindelser er av stor interesse for små-molekyl MSI. Disse matrisene skal gi økt analyse signaler med nedsatt matrix signaler. I det positive ion-modus-, 2,5-dihydroksybenzosyre (DHB) og α-cyano-4-hydroxycinnamic syre (CHCA) er de to mest brukte MALDI MS matriser for MSI 24 22,25. 9-Aminoacridine har vært brukt for MSI av protiske analytter i positiv ion-modus 26 og for nukleotider og fosfolipider i en negativ-ion-modus 26-29. 2-merkaptobenzotiazol har vist seg å gi effektiv MALDI påvisning av lipider 30, og har vært brukt til avbildning av musehjerne gangliosider 31. Den ultrahøy oppløsning på Fourier transform ion syklotronen resonans (FTICR) massespektrometre kan noe avhjelpe dette problemet ved å løse analyse signaler fra matrix signaler 32. En annen fordel ved anvendelse av FTICR-MS, er at intensitetene av de metastabile matrise klyngene er reduked 33, noe som også reduserer disse interferenser 27..

Bruken av Dithranol (DT, 1,8-dihydroksy-9 ,10-dihydroanthracen-9-on) som et MALDI matriks for vev avbildning har tidligere blitt rapportert 34.. I denne aktuelle arbeidet, er en detaljert protokoll tilgjengelig for bruk av DT for MSI av endogene lipider på overflatene av bovin linse vevssnitt, i positiv ion-modus.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

En. Tissue Seksjonering

  1. Flash-fryse emisjons prøver, en gang høstet, ved hjelp av flytende nitrogen, sende dem på tørris (hvis frakt er nødvendig), og lagre dem på -80 ° C til vev seksjonering. (Hvis kommersielle prøvene, må du kontrollere at prøvene er forberedt på denne måten.)
  2. Skjær organer til en håndterlig størrelse for å passe på MALDI målet. Trim av eventuelle uønskede deler av orgelet. For denne studien er beskrevet her, ble storfe kalv linser Decapsulated ved hjelp av en tidligere beskrevet prosedyre 35 før vev seksjonering.
  3. Fjern hele organer fra -80 ° C fryser og fikse dem på en kryogenisk vevsskjæring scenen. For å fikse en storfekalv objektiv, plasserer en eller to dråper vann på vev-skjærende stadium av en kryostat. Raskt plassere linsen i vannet før det stivner. Alternativt kan en optimal skjæretemperatur (OCT) forbindelser også benyttes for å fastsette en vev på skjæretrinn. Hvis oktober forbindelser brukes, en minimal mengden av oktober skal brukes og omsorg bør tas for å sikre at de kuttet vevsdelene ikke vil bli forurenset og OCT forbindelser som kan forstyrre med ionisering og påvisning av analyttene 5,36,37.
  4. La temperaturen inne i kryostaten til likevekt ved 18 ° C. Kaldere eller varmere temperaturer kan benyttes for mykere eller hardere vev, henholdsvis. Deretter kuttet vevet equatorially inn 20 mikrometer tykke skiver. Bruk 10-15 mikrometer tykke skiver for de fleste vev, men på grunn av den skjøre natur av bovin linse vev, ble 20 mikrometer tykke skiver benyttes. For storfe linseklut, forkaste de første vevssnitt og bare bruke skiver som er nær eller på ekvatorplanet.
  5. Dersom en okulær linse vevet avbildes, bruke 1,5 mL av maursyre (98% i renhet, LC-MS grade) på forhånd å fukte overflaten av en indium tinnoksyd (ITO)-belagte glass-slide.
  6. Nøye overføre vevssnitt til overflaten av ITO-corerte glass mikroskopisk lysbilde inne i kryostat. Vevet delen vil raskt tine og vil bli tett festet til glideflate. Vanligvis kan flere vevssnitt bli montert på en samme ITO-belagte lysbilde på denne måten.
  7. Lyofiliser lysbildet i 15 minutter før MALDI matrise søknad.
  8. For matrise testing, oppløse de enkelte matriser i egnede oppløsningsmidler. Manuelt øye 1 mL av hver matriseoppløsning på vev-delen. I tillegg øye på en liten-molekyl kalibrering standard på vev for verifisering av MALDI følsomhet.
  9. Legg tre undervisningskarakter til ITO belagt glass lysbilde ved å skrive på den ikke-ledende overflaten av ITO belagt glass lysbilde med en korreksjon-væske penn. Ta et optisk bilde av vevet lysbildet bruker en planskanner og lagre det i et passende format som tiff eller jpg.

2. Matrix Coating

2.1. Automatisert Matrix Coating

  1. Aplags matriseløsninger, som inneholder aceto-nitril eller blandet acetonitril / vann som løsningsmidler, automatisk til overflatene av vevssnitt ved hjelp av et Bruker ImagePrep eller en lignende elektronisk matrise sprøyter.
  2. Dekker kantene av den fremre overflaten av det ITO-belagte glass-slide med båndet, slik at matrisen ikke belegge kantene av lysbildet. Dette sikrer at undervisnings merkene på den motsatte flaten kan brukes for vev glidejustering. Ikke dekke kantene av glide med matrisen som de brukes som kontaktpunkter for å opprettholde den elektriske ledningsevne av ITO-belagte lysbilde.
  3. Coat glass-slide ved hjelp av tyve sykluser av matriks-belegg (2-sek-spray, 30-sek inkubasjon, og 60-sekunders tørketid for hver syklus).

2.2. Manuell Matrix Coating

  1. Hvis organiske løsemidler (f. eks kloroform og etylacetat) som er uforenlig med produksjons materialer av det elektroniske matrise sprøyta er krav som stillesrød, bruker en pneumatisk-assistert airbrush sprøyta å bruke matrisen. Tilsett klare matrise-oppløsningen til det løsningsmiddel reservoar for spraymaling pistolen og anvende en svak strøm av trykksatt nitrogengass for å prime spray.
  2. Dekker kantene av den fremre overflaten av ITO-belagte glassplater med båndet, slik at matrisen ikke belegge kantene av lysbildet. Dette sikrer at undervisnings merkene på den motsatte flaten kan brukes for vev glidejustering. Ikke dekke kantene av glide med matrisen som de brukes som kontaktpunkter for å opprettholde den elektriske ledningsevne av ITO-belagte lysbilde.
  3. Etter stabile og fine spray har blitt observert, manuelt spray matrisen slik at det helt strøk vevet delen. Påfør minimum av matrix løsning som kreves for å knapt fukte overflaten i løpet av hver syklus for å hindre mulig analytten delocalization. Vanligvis brukes ca 10 sykluser av matrise spray å belegge en vev seksjon; antall sykluser eravhengig av type vev-og matrise-blandingen.

Tre. MALDI MS

  1. Tilbered en massekalibreringsløsningen ved å fortynne "ES innstilling Mix" standardløsning med en faktor på 1:200 i 60:40 isopropanol: vann (inneholdende 0,1% maursyre i den endelige blanding).
  2. Innføre 2 mL / min av den fortynnede "ES innstilling Mix"-løsning til dual-mode electrospray ionisering (ESI) / MALDI ionekilden på FTICR massespektrometer, fra ESI side.
  3. Betjene FTICR instrument i positiv-ion ESI-modus, med bredbånd deteksjon og en datainnsamling størrelse på 1024 kb / sek. Typiske ESI parametere er kapillær electro spenning, 3900 V; spray skjold spenning, 3600 V; forstøveren gass (N 2) strømning, 2 l / min, tørr gass (N 2) strømning og temperatur, 4 l / min, og 200 ° C; skimmer en spenning, 15 V, time of Flight (TOF), 0,009 sek; kollisjon gass (Ar) flyt, 0,4 L / s; kilde ion akkumulering tid, 0,1 sek;og kollisjon celle ion akkumulering tid, 0,2 sek. Tune i FTICR operasjonsparametrene for å maksimere den analytiske sensitiviteten over masseområdet fra m / z 200 til 1400, og samtidig opprettholde god tid-domene frie induksjons decay (FID-signaler). Vanligvis ICR driftsparametere er sidekick spenning, 8 V; sidekick offset spenning, 8 V; eksitasjon forsterkning av 10; eksitasjonspuls tid, 0,01 til 0,015 sek; foran felle plate spenning, 1,5 V; tilbake felle plate spenning, 1,6 V og analysator inngangsspenning, -4 V. Etter å ha et sett av FTICR operasjonsparametrene er blitt bestemt, erverve ESI-massespektra, og kalibrere instrumentet ved hjelp av referanse massene av de vanlige forbindelser i "ES innstilling Mix" løsning.
  4. For å finjustere apparatet for MALDI operasjon, oppløses flere 1 mL alikvoter av en blandet terfenadin og reserpin standardløsning i matrisen oppløsning ved en konsentrasjon på 1 pM hver, og flekk disse løsningene direkte på ett av tissue seksjoner (dvs. en testseksjon vev) som er blitt montert på en ITO-belagte lysbilde. Plasser ITO-belagt lysbilde i en vev lysbilde adapter (dvs. en spesiell MALDI mål) og laste adapteren fra MALDI side inn den doble ESI / MALDI ion kilde. Optimalisere de riktige MALDI rammevilkår for lasereffekten og antall laser skudd for MALDI signal akkumulering for hver masse scan, etc. Typiske MALDI driftsparametere er: laser skudd, 50, og en MALDI plate spenning på 300 V.
  5. Etter tuning, kalibrering, og optimalisere instrument for MALDI-MSI eksperimenter, justere den fysiske plasseringen av en vev delen for å bli fotografert med sin innspilt optisk bilde i bildebehandlingsprogrammer. Bruk tre "korreksjons-fluid" merker, som tidligere var blitt satt på den motsatte side av ITO-belagte glideflate (trinn 1.9), for justering ved hjelp av en trepunkts-metoden triangulering.
  6. Utfør en simultan ESI og MALDI drift slik at hver massespekteret inneholder referansemasse toppene i "ES Tuning Mix" løsning for post-oppkjøpet intern massekalibrering. Dette vil resultere i den mest nøyaktige massemåling under MALDI MS. For å gjøre dette, først dempe ESI signal ved å redusere kapillær spenning inntil MALDI signaler dominerer spektra mens ESI Calibrant signalene er fortsatt høyt nok for intern massekalibrering.
  7. Deretter sette opp en automatisert raste metode for laser bestråling. Definer vevsregioner å bli fotografert og sett passende laser raster trinnstørrelse. Merk at mindre raster trinn størrelser gir høyere oppløsning vev bilder, men krever en betydelig lengre massespektralanalyse oppkjøpet tid og mer data lagringsplass. Antallet bildepunkter er avhengig av laser raster trinnstørrelse for å sette opp og vevet størrelse. For en typisk bovin linse som har en 1 cm 2 tissue størrelse, er en vev bilde typisk består av ca.

4. Data Analysis

  1. Kalibrere MALDI massespektra bruker intern kalibrering for den innledende sammenligning og å velge topper for MS / MS. De-isotop, og velge monoisotopic topper som tidligere beskrevet, ved bruk av en tilpasset VBA script 38..
  2. Eksportere den resulterende monoisotopic peak lister og innspill de målte m / z-verdier inn i METLIN 39 og / eller de HMDB 40 metabolome databaser for massetilpasning med bibliotekoppføringene. Betrakt (M + H) +, (M + Na) +, og (M + K) + ioner under databasesøk, med en tillatte massefeil på ± 1 ppm.
  3. Generere MALDI bilder for alle de lipid enheter oppdages over hele vevsnitt.F.eks hjelp image-analyse-programvare, til en massefilter bredde på 1 ppm på toppen apex.
  4. Når bildene er blitt generert for alle m / z verdier som samsvarer database oppføringer, generere bilder for alle andre topper i tillegg til å se etter unike distribusjonsmønstre som kan bli undersøkt senere.

5. Bekreftelse av identiteten til de avbildes Lipids

  1. Bekreft identiteten til de høye overflod lipider, som har karakteristiske fragment ioner som kan oppdages ved hjelp av FTICR instrument (f.eks 184,073 for fosfolipider), etter MALDI-MS/MS. Utfør MALDI-MS/MS bruker kollisjon-indusert dissosiasjon (CID) direkte på vev.
  2. For de lipid arter som ikke direkte kan bekreftes av MALDI-MS/MS, bruk en UPLC system koblet til en q-TOF massespektrometer 34.
    1. Manuelt dissekere alikvoter inneholder ~ 10 mg vev fra området der arten av interesse ble lokalisert. Plasser disse vev alikvotene inn 2ml sentrifugerør.
    2. Homogen hvert vev alikvot på 250 ul vann, ved hjelp av en mikser mølle med to 5 mm rustfrie metallkuler.
    3. Tilsett 1 ml kloroform-metanol-oppløsning (1:3, v / v), og vortex rørene. Deretter sentrifuger rørene ved hjelp av en mikrosentrifuge ved 12 000 xg i 10 min.
    4. Samle supernatantene og tørkes i en rotasjonshastighets vakuum konsentratoren.
    5. Løs opp rester i 100 mL av 30:70 isopropanol: vann. Injiser en 10 pl alikvot på UPLC kolonne for separasjon ved hjelp av gradient-eluering.
    6. Bruk kromatografiske betingelsene for on-line lipid LC-MS/MS, som har blitt publisert tidligere 34.
    7. Generer ekstrahert ion strøm (XIC) Kromatogrammer ved bruk av de teoretiske m / z-verdier, med et vindu på ± 50 ppm rundt de teoretiske massene.
    8. Hvis autentiske forbindelser for disse lipider er tilgjengelige, stemmer overens med retensjonstider av de autentiske forbindelser med de av tilsvarende XIC topper fra vevsprøver. Dersom forbindelsene er de samme, bør oppholdstidene og MS / MS-spektra stemmer overens.
  3. Hvis en autentisk forbindelsen er tilgjengelig, bruker fragmentering mønster av den oppdaget lipid å matche en standard MS / MS spekteret fra en metabolome database som METLIN eller HMDB. Bruk de novo massespektralanalyse tolkning for å fastslå en mulig struktur for lipidet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Vevsprøver som er seksjonert og tine montert på ITO belagt glassplater skal være intakt, uten synlig rive. For mange vev, er direkte vev tine montering på en ITO belagt glass slide akseptabelt. For noen spesielle vev som bovin linse, er omfattende opprivning av vev ofte sees ved direkte tine montering benyttes (fig. 1a). Pre-belagt på ITO glass-slide med etanol eller maursyre (Figur 1b) bidrar til å opprettholde integriteten til vevet seksjoner under vev montering.

Både valg av matrise og valget av løsningsmiddelet er viktige faktorer som påvirker kvaliteten av MALDI-spektra. Når et passende MALDI MS-spektrum er ervervet fra vevet delen, er massespektrum vanligvis tett med lipid signaler i massen deteksjonsområde (figur 2a). En matrise, og et løsningsmiddel bør velges slik at de har polariteteront-størrelse: 14.399999618530273px; line-høyde:. 28px "> lik analyttene av interesse, fordi den MALDI-prosessen krever en fast fase-oppløsning av analytten i matrisekrystaller generelt den beste analytt signalintensitetene kommer fra bruken av MALDI matrikser med løselighet sammenlignes med de ønskede analytter 41,42. Figur 2a viser et eksempel på et spektrum som produseres med en effektiv matriks oppløsningsmiddel (70% ACN med 0,01% TFA), og figur 2b viser et dårlig valg av matrise og løsningsmiddel (70% MeOH med 0,01% TFA) for Dithranol.

En av fordelene med en dual-mode electrospray ionisering (ESI) / MALDI ionekilde er at den tillater tilsetning av ESI kalibreringssignaler samtidig skaffe MALDI spektra uten å forstyrre avsmeltingsprosessen. Disse ESI Calibrant signaler tillate intern massekalibrering for å gi høy masse nøyaktighet med masse feil på <0,5 ppm 38. EttersomESI-signal av faste "ES innstilling Mix" løsning kan være en størrelsesorden kraftigere enn MALDI signaler av analyttene fra vevet, må ESI-avledet kalibreringssignaler dempes. Calibrant signalene skal være synlig og av tilstrekkelig intensitet for kalibrering av spektrene, men bør ikke dominere spektra.

Når settet av massespektra fra en MALDI-MSI eksperimentet er ervervet, kan bildet for hver av de detekterte ioner bli generert, hvor hvert bildepunkt tilsvarer en laser-bestråling sted fra overflaten av et vev-delen. Ved å kombinere alle de enkelte bildepunkter med forskjellige ion-intensiteter tvers over vev-delen fra en MALDI MSI eksperiment skyldes ioniseringen av målet analytter i vevet 1.. Dette kan i sin tur gi informasjon om de relative konsentrasjoner av analytter i forskjellige deler av vev-delen (figur 3b). Hensyn må tas i behandlingen avdata siden mange faktorer kan påvirke hva som blir sett og hvordan dataene tolkes. I de fleste forsøk, blir dataene normalisert til den totale ione strøm (TIC) innen hvert spektrum. Uten denne normalisering, kan områder med bedre analytt-matrise co-krystallisering (dvs. såkalte "hot spots") føre til sterkere signaler for analyttene og dette ville forskyve data ved å gi opplysninger som ikke korrelerer godt med de faktiske relative konsentrasjoner av analyttene (Tall 3c-3d).

Tissue preparat kan også dramatisk endre bildet som genereres. Hvis prøven er "for våt" (dvs. for mye løsningsmiddel ble anvendt), og deretter analyttene vil delocalize på vevet, og mye av den romlige informasjon vil gå tapt (fig. 3f). Metoden for datainnsamling er også viktig i det endelige bildet erholdt. Som MALDI eksperimenter på ubehandlede vevssnitt er iboende "dirty & #34, kan følsomheten av apparatet reduseres over tid. For korte eksperimenter denne reduksjon er ikke synlig, men det kan være et problem for lengre eksperimenter eller spesielt skitne prøver. Hvis data ervervet lineært over prøven dette kan føre til en stedsmessig skjevhet som spesifikke regioner av tissue-delen skal analyseres etter følsomheten av apparatet er redusert. Derfor bruker tilfeldige plasser for alle data oppkjøp anbefales. Selv om denne metoden tar mer tid, hjelper det å fjerne eller minimere denne skjevhet i dataene.

Som vist i våre tidligere papir 34, når sammenlignet med CHCA og DHB, DT muliggjorde påvisning av ytterligere lipid arter, mens lipidene påvist med CHCA og DBH kunne fortsatt påvises.

Figur 1 >
Figur 1. Tissue montering og skjæring. Sammenlign optiske bilder av to bovine kalvelinse vevssnitt (20 mikrometer tykt), uten maursyre prewetting (a), og med maursyre prewetting (b), er montert på ITO-belagt glass-slides.

Fig. 2
Figur 2. . Mass Spectra MALDI MS spektra anskaffet direkte fra en vev-delen: a) en ideell tett befolkede massespektrum med lipid-signaler (70% ACN med 0,01% TFA), b) et massespektrum som genereres fra en vev-delen er belagt med et dårlig valg av løsemiddel (70% MeOH med 0,01% TFA). Klikk her for å se større figur .

telt "fo: keep-together.within-page =" always "> Figur 3
Figur 3. MALDI MSI bilder Representative MALDI MSI bilder: a) en bovin linse vev seksjon, b) en MSI bilde av det samme vev-delen, c) en MSI bilde som viser en bakgrunn ion, d) et nonnormalized ion kart over det samme ion e). en bovin linse vev-delen, og f) et ion kart som viser et delvis delocalized analytt grunn av overfukting.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

De viktigste betraktninger for vellykket MALDI MSI er: 1) vevspreparat, 2) matrisen valg, 3) matrise applikasjon, og 4) data tolkning og analyse. Når prøven og matrisen er hensiktsmessig fremstilt, blir MS datainnsamling automatisert. Dataanalysen fra denne type eksperiment er ganske arbeidskrevende.

Passende vev forberedelse er avgjørende for vellykkede MALDI MSI eksperimenter. Kilden for vev og håndteringen kan ha en stor innvirkning på den endelige analysen. Prøvene må være umiddelbart flash frosset i flytende nitrogen og lagret ved -80 ° C, og de bør ikke lagres i en lengre tidsperiode, slik som noen metabolitter kan være ustabile selv ved -80 ° C.

For mange pattedyr vev, har 10-15 mikrometer tykke vevet skiver blitt anbefalt for MALDI MSI. I disse eksperimentene, ble det bovine kalvelinser snitt equatorially til 20 mikrometer tykt vev slices følgende linse decapsulation ved hjelp av en tidligere beskrevet prosedyre 35. De tykkere bovine kalvelinse vevssnitt ble brukt fordi det er funnet vanskelig å opprettholde integriteten til en linse vev seksjon både under vev skjæring og under vev montering. Objektivet er en sfærisk symmetrisk vev langs ekvator flyet, så bare skiver, som var nær, eller i, ble den ekvatorplanet samles.

På grunn av vanskeligheten med å opprettholde vevet integritet under vev skjæring og montering, prewetting ved hjelp av et oppløsningsmiddel så som etanol (for proteiner og peptider 35) og maursyre (for lipider) kan brukes. Det bør også bemerkes at, for protein-og peptid-avbildning, blir prøvene ofte vasket med et organisk løsningsmiddel for å fjerne små molekyler inkludert lipider og oktober brukt for montering, men bør et vasketrinn bare utføres med oppløsningsmidler som ikke løser opp analytter av interesse, og bør unngås for SMAll molekyl analyse.

Valget av matriks er også avgjørende for alle MALDI eksperimenter, men kan om-vevet matrise ytelsen ikke være den samme som matriks ytelse med en renset standard. For eksempel, i det minste laserkraft, DT generert rikelig DT-relaterte bakgrunnssignaler fra vevet fritt matrise flekker og disse signalene ble tildelt som DT oligomerer og deres tilsvarende natrium-og kalium-adduktene, men på vev, er mange av disse signalene var ikke observert, noe som indikerer at testing av forskjellige matriser av den spesifikke prøvemateriale kan være viktig ved valg av den riktige matrise for en gitt MALDI MSI analyse. DT blir sjelden brukt for lipid-analyse på grunn av den rapporterte høy bakgrunn generert av matrisen, men sammenlignet med DHB og CHCA for on-vevet profilering av lipider ved MALDI-MS FTICR, DT produserte gode resultater. Derfor er denne matrisen kan være et potensielt nyttig matrise for MALDI vev avbildning ved hjelp av dette instrumentet

Effektiv co-krystalliseringen av grunnmassen, og analytten er en forutsetning for høy følsomhet MALDI-MS-analyse. Således fast fase oppløselighet av en analytt i grunnmassen er viktig i MALDI prosessen 41,42. MALDI matriser med løselighet som ligner på de ønskede analytter har blitt rapportert til å produsere den sterkeste analytt signalintensitet. Fordi DT er en svak organisk syre, så vel som en svært hydrofob organisk forbindelse, basert på klassisk Bronsted-Lowry-syre-base-nøytralisering teori 43 og teorien for oppløselighet, er det forventet å favorisere ionisering av positivt ladet og mindre polar forbindelser. Faktisk har vi funnet at polare lipider dominert de detekterte forbindelsene i positiv ion-modus når DT ble anvendt som matriks.

Oppløsningsmidlene som brukes for å fremstille en matriks-løsning spiller også en viktig rolle i direkte vev analyse av MALDI-MS. PH-verdien har blitt innblandet som enviktig faktor i effektiviteten av en matrise, og TFA er et vanlig tilsetningsmiddel som brukes med CHCA og DHB. Men med DT, tilsetning av en syre eller base-modifiserende hadde liten virkning på den resulterende data. På grunn av hydrofobisiteten til DT og dets begrensede oppløselighet i polare oppløsningsmidler, er et lipofilt organisk oppløsningsmiddel anbefalt. Ved analyse av lipider, en blanding av kloroform-metanol (2:1, v: v) med 1% maursyre, noe som er en typisk organisk oppløsningsmiddel for lipid ekstraksjon, ble benyttet. Vi postulerte at dette gir bedre co-krystallisering av lipider med DT. Den lipofile natur av løsningsmidlet kan også hindre oppløseliggjøring av andre forbindelser slik som proteiner og salter, som vist i foregående væske ekstraksjon overflate analyse massespektrometri (LESA-MS) 44 eksperimenter. Dette ville føre til bedre krystallisering av matrisen og lipider med færre forurensninger. Det løsningsmiddelsystem som er valgt for analyse bør øke løseligheten av grunnmassen og desirøde analytter (lipider) samtidig minimere løseligheten av uønskede forurensninger (salter og proteiner / peptider).

Belegget av matrisen på overflaten av vevet bør være så ensartet som mulig. For å maksimere den romlige oppløsningen i bildet, bør det krystallstørrelsen være så liten som mulig 45. Ved hjelp av en elektronisk matrise sprayer, kan grunnmassen belegges jevnt og reproduserbart med en liten krystallstørrelse. Dette er den foretrukne fremgangsmåten i vårt laboratorium. Det er langt å foret til manuell påføring som det reduserer punktstørrelse, homogenitet og reproduserbarhet. Imidlertid er mange av de oppløsningsmidler som er nyttige for MSI av små molekyler er ikke kompatible med de materialer som brukes ved fremstilling av automatisert matrisen sprøyter. Selv om det ennå ikke er implementert i vårt laboratorium, har sublime basert matrise søknad blitt anbefalt for lipid analyse 22. Denne fremgangsmåten gir forbedret (dvs. redusert) punktstørrelse, homogenitet og reprodukbilitet og dette bør vel være metoden for valg når matrisen valgt er elskverdig til denne metoden.

For belegg av matriser inneholdende oppløsningsmidler som er uforenlige med den automatiserte matrisen sprøyter (inkludert kloroform), er en alternativ metode for matriks-belegg for å bruke en luftbørste pistol. For disse matriseløsninger, brukte vi en pneumatisk assistert airbrush sprøyta. Selv om bruken av luftbørste pistolen er ikke en ideell fremgangsmåte, kan det være den eneste metode som kan brukes for løsningsmidler og matriser som er uforenlige med de andre fremgangsmåter, og-med opplæring og erfaring, den kan generere meget ensartet matriks-belegg. Ved påføring av matriseoppløsning manuelt, må påføres kun det minimum av væske i løpet av hver syklus til knapt fukte overflaten av vevet. For mye væske kan potensielt delocalize analytter som skyldes de organiske oppløsningsmidler. Det er reproduserbarhet problemer med manuell søknad og erfaring i belegg lysbildet med denne metoden ier avgjørende for å lykkes. På grunn av den manuelle naturen av luftbørste gun matrise applikasjon, må man sørge for å sikre at et jevnt belegg er gjort, en inhomogen belegg kan føre til skjev data som er representative for matrisebelegget og ikke analytten lokalisering.

Når du driver MALDI MSI eksperimenter, er tidlig identifisering av de oppdagede analytter vanligvis basert på metabolome database søking av de målte nøyaktige masser som vanligvis er bare tilgjengelig når en høyoppløselig instrumentet brukes 38. Den doble ESI / MALDI ionekilden på Apex-Qe 12 Tesla hybrid kvadrupol-massespektrometer FTICR tillater tilsetning av ESI-genererte signaler for bruk som den interne masse Calibrant topper til hver MALDI massespektrum, uten å påvirke den MALDI desorpsjon / ionisering prosessen. Bruken av intern masse kalibrering er avgjørende for høymesse nøyaktighet i MALDI-FTICR. Ekstern kalibrering kan ikke fullt ut tar hensyn tilplass lade effekter i ICR celle 46-48. Tuning og kalibrering av FTICR er avgjørende for suksess. På denne type instrument en parameter kalt "Time of Flight" (TOF), som er den tid det tar for et ion for å reise fra kollisjonscelle til analysatoren (ICR celle) er en av de viktigste brukerdefinerte innstillinger som påvirker følsomhet av en FTICR instrument. Innenfor en gitt masseområde (dvs. m / z 200-1,400), favoriserer en lavere TOF påvisning av de nedre m / z ioner og en høyere TOF favoriserer deteksjon av høyere m / z ioner. Således, for høy følsomhet påvisning av både lave og høye m / z ioner i registreringsmasseområde, er det ønskelig en TOF-verdi på 9 ms.

For et praktisk eksperiment, må det foretas en avveining mellom rimelig datainnsamling størrelse, masse oppløsning, og tiden brukt på å anskaffe MS imaging data. For en FTICR MS eksperiment, størrelsen på den ervervede datafil og massen resolutiden er avhengig av datainnsamlingen størrelsen av den frie induksjons decay (FID) signal. En høyere datainnsamling størrelse vil resultere i en høyere masseoppløsning og en større data filstørrelse. Men en høyere datainnsamling størrelse også fører til en tregere MS skannehastighet. Som en trade-off, anbefales det at en datainnsamling størrelse på 1024 kb / sek brukes på FTICR. En lavere datainnsamling størrelse og en tilsvarende lavere masseoppløsningen ikke tillater separasjon av noen isobariske ion arter.

Laseren raster trinnstørrelse må også velges slik at den er liten nok til å gi en god pikseloppløsning for MS-bilder av analytter av interesse, men kan en svært liten raster trinnstørrelse gjøre datafiler uhåndterlig vurderer en MS avbildning datafil består av tusener av MALDI-massespektra. Gitt den relativt store størrelsen på bovine linser, ca. 1,2 -1,5 cm i diameter, har vi benyttet et raster-trinn størrelse på 250 mikrometer. Ved hjelp av en 1024 kb / sek data acquisition størrelse og en 250 mikrometer raster trinn størrelse, vår eksempeldatasettet var ca 60 Gb. I løpet av datainnsamlingen, bør et tilfeldig sted analyse brukes, da dette hindrer at stedsbasert skjevhet som følge av gradvis signaldempning, men tilfeldig sted krever vesentlig lengre tid å skaffe dataene.

Fordi MALDI MSI datasett ervervet på vår FTICR MS instrument inkluderer nøyaktige masse data, kan den utpakkede m / z søkes mot metabolome databaser som METLIN og / eller HMDB. Ved hjelp av en ± 1 ppm vindu de første oppdrag av mange ion signaler til metabolitter er av høy tillit. Imidlertid, fordi mange arter har den samme kjemiske formel, bekreftelse av ID må ofte skje ved hjelp av alternative metoder. Dermed MS / MS eksperimenter, og sammenligning av MS / MS spektra med tidligere publiserte data bør utføres for en trygg identifikasjon. MALDI-MS/MS spektra kan noen ganger være anskaffet direkte på FTICR instrument, men for maNY lipidmolekyler, deres Forekomsten og / eller ionisering effektivitet er utilstrekkelig for å få nyttige MS / MS-data, og berikelse og rensing før LC-MS/MS er påkrevd. I disse analysene, de fleste av de observerte lipider var polare fosfolipider, og ble tildelt som PCer, PES, SMS, PSS, PGS, PAS, og ceramid fosfater (CerPs), andre lipidmolekyler identifisert inkluderer sterol lipider, acyl Carnitines og glyserider. Basert på egenskapene til oppløsningsmidlet, og matriks, dette er å forvente. MS / MS-spektra av PC inneholde en fremtredende topp ved m / z 184,073, som er blitt knyttet til den polare hodegruppe-PC, fosfocholin, samt ytterligere strukturelt viktig informasjon, noe som kan gi entydig identifisering av molekyler. I tillegg, ved bruk av denne metoden, er mange sterol lipider detektert, men de kan ikke entydig tilordnet en unik identitet, selv med MS / MS-data. Sterke kalium addukter generelt dominerer spektrene, men proton og sodiated-addukter kan også påvises.

Fordi MALDI MS prosessen er bare i stand til å gi relative overflod informasjon basert på den lokale ionisering effektivitet innenfor hver pixel, må det utvises forsiktighet ved tolking av MALDI MSI data uten stabile isotoper merket interne standarder 49. Videre, for tilliten til lokalisering resultatene, bekreftelse av eventuelle distribusjons mønstre oppdages må gjøres ved hjelp av alternative metoder. Utøvende LC-MS/MS på dissekert vevsprøver for bekreftelse anbefales.

Basert på de målte nøyaktige masser i det lave masseområde kjemiske formler kan genereres for en gitt m / z; innen en 1 ppm massefeil, og slik at et ubegrenset antall C, H, O og N, og maksimum 2 S og 2. P ofte bare en eneste elementsammensetningen er mulig. Dette m / z kan også søkes mot HMDB og METLIN databaser, noe som kan gi potensielle kandidat forbindelser. Dessverre,på FTICR MS lav masse cut-off er ca. 130. Da, som kan gjøre det vanskelig å direkte utføre MS / MS. Således er en bekreftelse ved å bruke et annet system, ofte nødvendig.

Q-TOF LC-MS/MS eksperimenter blir ofte utført på vevsprøver som er manuelt dissekert fra bestemte områder av vev av interesse. Ved hjelp av den beskrevne lipidekstraksjonen metoden, kan XICs genereres for målforbindelsene og MS / MS kan bli kjøpt opp for bekreftelse. Enten forhold til en autentisk standard eller de novo strukturoppklaring er nødvendig før det kan bli en trygg kjemisk oppdrag.

Dithranol har blitt brukt til å utforske lipid utbredelsesmønster i storfe kalv linse og også testet på rotte lever, hjerte og nyre vev 34. MALDI MSI kan benyttes for diagnostisering av humane sykdomstilstander og det er allerede i bruk for patologisk analyse 50. Med utviklingen av mer robust og hurtig technologies for MALDI MSI, den romlige lokalisering av bestemte forbindelser kan være nyttig informasjon for en patolog. Når en analytt kan rutinemessig avbildes ved hjelp av en MALDI MSI-baserte metode, kan den brukes for diagnostiske formål. Faktisk kunne vev bildebehandling utføres i et sykehus, med et instrument som ligger ved siden av operasjonsstuen, hvor, som allerede har blitt vist 51, kan det brukes til å nøyaktig fastslå marginene av svulster.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Vi har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Forfatterne ønsker å takke Genome Canada og Genome British Columbia for finansiering plattform, og støtte. Vi vil også takke Dr. Carol E. Parker for kritisk gjennomgang av manuskriptet og redigering assistanse. CHL også takket British Columbia Proteomikk Nettverk for støtte.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Rat Liver Pel-Freez Biologicals 56023-2
Bovine Calf Lens Pel-Freez Biologicals 57114-2 Sample should be decapsulated29 before use
Dithranol (DT) Sigma-Aldrich 10608 MALDI Matrix
α-Cyano-4-hydroxy-cinnamic Acid (CHCA) Sigma-Aldrich 70990 MALDI Matrix
2,5-Dihydroxybenzoic Acid (DHB) Sigma-Aldrich 85707 MALDI Matrix
Reserpine Sigma-Aldrich 83580
Terfenadine Sigma-Aldrich T9652
Formic Acid Sigma-Aldrich 14265
Ammonium Formate Sigma-Aldrich 14266
Ammonium Hydroxide Sigma-Aldrich 320145
Trifluoroacetic Acid (TFA) Sigma-Aldrich 302031
Water Sigma-Aldrich 39253
Methanol Sigma-Aldrich 34860
Acetonitrile Sigma-Aldrich 34967
Ethyl Acetate Sigma-Aldrich 34972
Isopropanol Sigma-Aldrich 34965
Chloroform Sigma-Aldrich 366927
Acetone Sigma-Aldrich 34850
Ethanol Commercial Alcohols 95%
ES Tuning Mix Agilent Technologies G2431A
ITO Coated Glass Slides Hudson Surface Technology PSI1207000 Ensure that samples are placed on the electrically conductive side
Wite-Out Shake-N-Squeeze Correction Pen Bic WOSQP11
Airbrush Sprayer Iwata Eclipse HP-CS
ImagePrep Bruker 249500-LS
MALDI adapter Bruker 235380

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Chaurand, P., Stoeckli, M., Caprioli, R. M. Direct Profiling of Proteins in Biological Tissue Sections by MALDI Mass Spectrometry. Anal. Chem. 71, 5263-5270 (1999).
  2. Caprioli, R. M., Farmer, T. B., Gile, J. Molecular Imaging of Biological Samples. Localization of Peptides and Proteins Using MALDI-TOF MS. Anal. Chem. 69, 4751-4760 (1997).
  3. Amstalden van Hove, E. R., Smith, D. F., Heeren, R. M. A. A concise review of mass spectrometry imaging. J. Chromatogr. A. 1217, 3946-3954 (2010).
  4. Norris, J. L., Caprioli, R. M. Analysis of Tissue Specimens by Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Imaging Mass Spectrometry in Biological and Clinical Research. Chem. Rev. Feb 11, (2013).
  5. Walch, A., Rauser, S., Deininger, S. -O., Höfler, H. MALDI imaging mass spectrometry for direct tissue analysis: a new frontier for molecular histology. Histochem. Cell Biol. 130, 421-434 (2008).
  6. Hsieh, Y., et al. Matrix-assisted laser desorption/ionization imaging mass spectrometry for direct measurement of clozapine in rat brain tissue. Rapid Commun. Mass Spectrom. 20, 965-972 (2006).
  7. Trim, P. J., et al. Matrix-assisted laser desorption/ionization-ion mobility separation-mass spectrometry imaging of vinblastine in whole body tissue sections. Anal. Chem. 80, 8628-8634 (2008).
  8. Khatib-Shahidi, S., Andersson, M., Herman, J. L., Gillespie, T. A., Caprioli, R. M. Direct molecular analysis of whole-body animal tissue sections by imaging MALDI mass spectrometry. Anal. Chem. 78, 6448-6456 (2006).
  9. Atkinson, S. J., Loadman, P. M., Sutton, C., Patterson, L. H., Clench, M. R. Examination of the distribution of the bioreductive drug AQ4N and its active metabolite AQ4 in solid tumours by imaging matrix-assisted laser desorption/ionisation mass spectrometry. Rapid Commun. Mass Spectrom. 21, 1271-1276 (2007).
  10. Drexler, D. M., et al. Utility of imaging mass spectrometry (IMS) by matrix-assisted laser desorption ionization (MALDI) on an ion trap mass spectrometer in the analysis of drugs and metabolites in biological tissues. J. Pharmacol. Toxicol. Methods. 55, 279-288 (2007).
  11. Prideaux, B., Stoeckli, M. Mass spectrometry imaging for drug distribution studies. J. Proteomics. 75, 4999-5013 (2012).
  12. Sugiura, Y., Setou, M. Imaging Mass Spectrometry for Visualization of Drug and Endogenous Metabolite Distribution: Toward In Situ Pharmacometabolomes. J. Neuroimmune Pharmacol. 5, 31-43 (2009).
  13. Garrett, T. J., Yost, R. A. Analysis of intact tissue by intermediate-pressure MALDI on a linear ion trap mass spectrometer. Anal. Chem. 78, 2465-2469 (2006).
  14. Woods, A. S., Jackson, S. N. Brain tissue lipidomics: direct probing using matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry. AAPS J. 8, 391-395 (2006).
  15. Cha, S., Yeung, E. S. Colloidal graphite-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry and MSn of small molecules. 1. Imaging of cerebrosides directly from rat brain tissue. Anal. Chem. 79, 2373-2385 (2007).
  16. Burnum, K. E., et al. Spatial and temporal alterations of phospholipids determined by mass spectrometry during mouse embryo implantation. J. Lipid Res. 50, 2290-2298 (2009).
  17. Veloso, A., et al. Anatomical distribution of lipids in human brain cortex by imaging mass spectrometry. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 22, 329-338 (2011).
  18. Tanaka, H., et al. Distribution of phospholipid molecular species in autogenous access grafts for hemodialysis analyzed using imaging mass spectrometry. Anal. Bioanalyt. Chem. 400, 1873-1880 (2011).
  19. Lou, X., van Dongen, J. L., Vekemans, J. A., Meijer, E. W. Matrix suppression and analyte suppression effects of quaternary ammonium salts in matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry: an investigation of suppression mechanism. Rapid Comm. Mass Spectrom. 23, 3077-3082 (2009).
  20. Knochenmuss, R., Karbach, V., Wiesli, U., Breuker, K., Zenobi, R. The matrix suppression effect in matrix-assisted laser desorption/ionization: application to negative ions and further characteristics. Rapid Commun. Mass Spectrom. 12, 529-534 (1998).
  21. Puolitaival, S. M., Burnum, K. E., Cornett, D. S., Caprioli, R. M. Solvent-free matrix dry-coating for MALDI imaging of phospholipids. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 19, 882-886 (2008).
  22. Hankin, J. A., Barkley, R. M., Murphy, R. C. Sublimation as a Method of Matrix Application for Mass Spectrometric Imaging. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 19, 1646-1652 (2007).
  23. Grove, K. J., Frappier, S. L., Caprioli, R. M. Matrix pre-coated MALDI MS targets for small molecule imaging in tissues. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 22, 192-195 (2011).
  24. Fuchs, B., Süss, R., Schiller, J. An update of MALDI-TOF mass spectrometry in lipid research. Prog. Lipid Res. 49, 450-475 (2010).
  25. Murphy, R. C., Hankin, J. A., Barkley, R. M., Zemski Berry, K. A. MALDI imaging of lipids after matrix sublimation/deposition. Biochim. Biophys. Acta. 1811, 970-975 (2011).
  26. Vermillion-Salsbury, R. L., Hercules, D. M. 9-Aminoacridine as a matrix for negative mode matrix-assisted laser desorption/ionization. Rapid Commun. Mass Spectrom. 16, 1575-1581 (2002).
  27. Hu, C., et al. Analytical strategies in lipidomics and applications in disease biomarker discovery. J. Chromatogr. B Analyt. Technol. Biomed. Life Sci. 877, 2836-2846 (2009).
  28. Miura, D., et al. Ultrahighly sensitive in situ metabolomic imaging for visualizing spatiotemporal metabolic behaviors. Anal. Chem. 82, 9789-9796 (2010).
  29. Cerruti, C. D., Benabdellah, F., Laprevote, O., Touboul, D., Brunelle, A. MALDI Imaging and Structural Analysis of Rat Brain Lipid Negative Ions with 9-Aminoacridine Matrix. Anal. Chem. 84, 2164-2171 (2012).
  30. Astigarraga, E., et al. Profiling and Imaging of Lipids on Brain and Liver Tissue by Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Mass Spectrometry Using 2-Mercaptobenzothiazole as a Matrix. Anal. Chem. 80, 9105-9114 (2008).
  31. Whitehead, S. N., et al. Imaging mass spectrometry detection of gangliosides species in the mouse brain following transient focal cerebral ischemia and long-term recovery. PloS one. 6, e20808 (2011).
  32. Cornett, D. S., Frappier, S. L., Caprioli, R. M. MALDI-FTICR imaging mass spectrometry of drugs and metabolites in tissue. Anal. Chem. 80, 5648-5653 (2008).
  33. Deininger, S. O., et al. Normalization in MALDI-TOF imaging datasets of proteins: practical considerations. Anal. Bioanalyt. Chem. 401, 167-181 (2011).
  34. Le, C. H., Han, J., Borchers, C. H. Dithranol as a MALDI matrix for tissue imaging of lipids by Fourier transform ion cyclotron resonance mass spectrometry. Anal. Chem. 84, 8391-8398 (2012).
  35. Han, J., Schey, K. L. MALDI Tissue Imaging of Ocular Lens α-Crystallin. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 47, 2990-2996 (2006).
  36. Schwartz, S. A., Reyzer, M. L., Caprioli, R. M. Direct tissue analysis using matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry: practical aspects of sample preparation. J. Mass Spectrom. 38, 699-708 (2003).
  37. Chen, Y., et al. Imaging MALDI mass spectrometry of sphingolipids using an oscillating capillary nebulizer matrix application system. Meth. Mol. Biology. 656, 131-146 (2010).
  38. Han, J., et al. Towards high throughput metabolomics using ultrahigh field Fourier transform ion cyclotron resonance mass spectrometry. Metabolomics. 4, 128-140 (2008).
  39. Smith, C. A., et al. METLIN: a metabolite mass spectral database. Ther. Drug Monit. 27, 747-751 (2005).
  40. Wishart, D. S., et al. HMDB: a knowledgebase for the human metabolome. Nucleic Acids Res. 37, D603-D610 (2009).
  41. Hoteling, A. J., Erb, W. J., Tyson, R. J., Owens, K. G. Exploring the importance of the relative solubility of matrix and analyte in MALDI sample preparation using HPLC. Anal. Chem. 76, 5157-5164 (2004).
  42. Hoteling, A. J., Mourey, T. H., Owens, K. G. Importance of solubility in the sample preparation of poly(ethylene terephthalate. for MALDI TOFMS. Anal. Chem. 77, 750-756 (2005).
  43. Shroff, R., Rulísek, L., Doubsky, J., Svatos, A. Acid-base-driven matrix-assisted mass spectrometry for targeted metabolomics. Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 106, 10092-10096 (2009).
  44. Eikel, D., et al. Liquid extraction surface analysis mass spectrometry (LESA-MS) as a novel profiling tool for drug distribution and metabolism analysis: the terfenadine example. Rapid Comm. Mass Spectrom. 25, 3587-3596 (2011).
  45. Sadeghi, M., Vertes, A. Crystallite size dependence of volatilization in matrix-assisted laser desorption ionization. Appl. Surf. Sci. 127 - 129, 226-234 (1998).
  46. O'Connor, P. B., Costello, C. E. Internal Calibration on Adjacent Samples (InCAS) with Fourier Transform Mass Spectrometry. Anal. Chem. 72, 5881-5885 (2000).
  47. Jing, L., Amster, I. J. An improved calibration method for the matrix-assisted laser desorption/ionization-Fourier transform ion cyclotron resononance analysis of 15N-metabolically- labeled proteome digests using a mass difference approach. Eur. J. Mass Spectrom. 18, 269-277 (2012).
  48. Zhang, L. -K., Rempel, D., Pramanik, B. N., Gross, M. L. Accurate mass measurements by Fourier transform mass spectrometry. Mass Spectrom. Rev. 24, 286-309 (2005).
  49. Clemis, E. J., et al. Quantitation of spatially-localized proteins in tissue samples using MALDI-MRM imaging. Anal. Chem. 84, 3514-3522 (2012).
  50. Schwamborn, K., Caprioli, R. M. Molecular imaging by mass spectrometry--looking beyond classical histology. Nat. Rev. Cancer. 10, 639-646 (2010).
  51. Oppenheimer, S. R., Mi, D., Sanders, M. E., Caprioli, R. M. Molecular analysis of tumor margins by MALDI mass spectrometry in renal carcinoma. J. Proteome Res. 9, 2182-2190 (2010).

Tags

Grunnleggende Protocol øye molekylær avbildning kjemi teknikk analytisk massespektrometri matrise assistert laser desorpsjon / ionisering (MALDI) tandem massespektrometri lipid vev bildebehandling bovin linse Dithranol matrise FTICR (Fourier Transform Ion syklotron Resonans)
Dithranol som en matrise for Matrix Assisted Laser desorpsjon / Ionization Imaging på en Fourier Transform Ion syklotron Resonans Mass Spectrometer
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Le, C. H., Han, J., Borchers, C. H.… More

Le, C. H., Han, J., Borchers, C. H. Dithranol as a Matrix for Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization Imaging on a Fourier Transform Ion Cyclotron Resonance Mass Spectrometer. J. Vis. Exp. (81), e50733, doi:10.3791/50733 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter