Summary
Dans cet article, vidéo, nous décrivons un test automatisé pour mesurer l'effet de la faim ou de satiété sur le comportement dépend olfactif de recherche de nourriture dans le fruit de mouche adulte Drosophila melanogaster.
Abstract
Pour beaucoup d'animaux, la faim favorise des changements dans le système olfactif d'une manière qui facilite la recherche de sources de nourriture appropriés. Dans cet article, vidéo, nous décrivons un test automatisé pour mesurer l'effet de la faim ou de satiété sur le comportement dépend olfactif de recherche de nourriture dans le fruit de mouche adulte Drosophila melanogaster. Dans une boîte étanche à la lumière éclairé par une lumière rouge qui est invisible pour les mouches des fruits, une caméra reliée à un logiciel d'acquisition de données personnalisées surveille la position des six mouches simultanément. Chaque volée est limitée à marcher dans les arènes individuelles contenant une odeur de nourriture au centre. Les arènes de tests reposent sur un sol poreux qui sert à prévenir l'accumulation d'odeurs. La latence pour localiser la source de l'odeur, une métrique qui reflète la sensibilité olfactive sous différents états physiologiques, est déterminée par analyse de logiciels. Ici, nous discutons les mécanismes essentiels de l'exécution de ce paradigme comportemental et portent sur des questions spécifiques relatives à la mouche loading, la contamination de l'odeur, de la température d'essai, la qualité des données, et l'analyse statistique.
Introduction
États de la faim promouvoir deux types de comportements d'appétit: la recherche de la nourriture et de consommation alimentaire 1. Ce test comportemental simple est utile pour l'étude des comportements associés à la recherche de nourriture chimiotactiques 2,3. En particulier, il permet de suivre la position de la mouche, la vitesse de marche et la latence à la localisation d'une cible de l'odeur des aliments. Latence de la recherche de nourriture sert métrique pour mesurer les changements dans la sensibilité du système de détection d'odeur de la mouche en aval de l'évolution de son état interne appétit. Une version manuelle de ce test a déjà été utilisé pour montrer la signalisation du récepteur GABA-B est important pour le comportement odeur de localisation en mouches adultes 3. La version actuelle automatisé du test a contribué à l'étude de la façon dont court neuropeptide F (SNPF) signalisation remodèle la carte olfactive chez la drosophile et influences appétit comportements 2.
Les tests sont effectués dans une pièce sombre de température et humidité contrôlées. Numériquecaméras vidéo fixées ci-dessus les plaques d'essai acrylique Clear Track vol rétro-éclairé par 660 nm éclairage LED. L'information depuis l'appareil photo est traitée en temps réel par un ordinateur stationné à côté de la zone de test. Nous utilisons un logiciel d'acquisition de données à enregistrer et sauvegarder les coordonnées de positions à la mouche au cours de la période d'essai.
Dans ce paradigme, l'objet est libéré dans une arène qui contient une odeur de nourriture au centre, l'objet d'odeur crée un gradient odeur de la nourriture dans l'arène qui induit la nourriture comportement de recherche dans la mouche. Une odeur protocole de recherche similaire a été appliquée vers l'étude des chemosensation en simple larves de drosophile 7. Alors que d'autres tests comportementaux tels que le-champ quatre olfactomètre 4,5 ou le t-labyrinthe 6 évaluer l'aversion ou attraction comportements d'odeur, ce paradigme est le mieux placé pour évaluer les comportements de sensibilité et de chimiotaxie olfactifs.
Plusieurs avantages clés accompagnent cette assay. Tout d'abord, il permet l'acquisition rapide de grands ensembles de données, car la collecte et l'analyse des données sont pour la plupart automatisées. Deuxièmement, cette analyse isole et mesure le comportement des mouches simples, éliminant ainsi les signaux olfactifs sociaux qui peuvent influencer leurs comportements. Troisièmement, la simplicité du protocole et de design expérimental simple faire le dosage efficace et facile à enseigner aux autres.
En outre, ce test peut être utilisé pour sonder davantage les circuits neuronaux sous-jacents alimentaire comportement de recherche en la combinant avec la boîte à outils génétique vaste disponible à Drosophila melanogaster 8. Expression ciblée de transgènes silence ou exciter les neurones peuvent être obtenus avec des outils tels que le système GAL4 UAS ainsi que le SAMU-TS1 shibire, UAS-tétanos-toxine, et UAS-TRPA1 (B) transgènes 9-12.
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Protocol
Une. Fly Collection et famine
- Arrière Les mouches expérimentales en température et d'humidité des conditions contrôlées (par exemple 21 ° C, 50-60% d'humidité relative) sur un cycle de lumière de 12 h / sombre.
- Récupérer mouches femelles le jour de l'éclosion et les placer, avec 4-5 hommes, dans de nouveaux flacons alimentaires (maximum de 30 par flacon). Âge vole 2-5 jours.
- Préparer les chambres pour voler la famine.
- Poussez un tissu unique (4,8 x 8,4 pouces) vers le bas d'un flacon en plastique vide. Complètement tremper le tissu avec de l'eau distillée. Utilisez un objet à pousser vers le bas sur le tissu et presser doucement l'excès d'eau.
- Retourner le flacon de jeter le surplus d'eau. Il devrait y avoir suffisamment d'eau pour garder les mouches hydratés et la chambre de la famine humide, mais pas assez pour noyer les mouches.
- Transférer les mouches du flacon de la nourriture dans une chambre de la famine et de brancher le flacon sur 18-24 h avant le début de l'expérience. Rangez leflacons dans des conditions de température et d'humidité contrôlées durant la nuit jusqu'à ce que l'expérience commence le lendemain.
2. Préparation de l'odeur des aliments
- Préparer une solution d'agarose à 1% par addition de 0,1 g de basse température de fusion d'agarose à 10 ml d'eau distillée dans un ballon en verre. Chauffer la solution d'agarose dans un micro-ondes juste jusqu'à ce qu'il commence à bouillir, mais bien avant, il déborde.
- Arrêtez le micro-ondes et agiter le flacon une fois. Répétez cette étape deux fois plus que l'agarose est complètement dissous. Conserver la solution d'agarose à l'état liquide en gardant le ballon au chaud sur une plaque fixée à 50 ° C.
- Ajouter 990 ul de la solution d'agarose à 1% et 10 pi de vinaigre de cidre dans un tube Eppendorf de 1,5 ml pour obtenir une solution à 1% de vinaigre de cidre de pomme. Vortex la solution jusqu'à ce que mitigés et le placer dans un incubateur de bain sèche réglée à 50 ° C.
3. Test chambres et Comportement installation de chambre
- Mettez le panneau de LED (660 nm).
- Rincer les tamis et les plaques d'essai avec de l'eau chaude et faites-les chauffer dans un four de séchage jusqu'à ce que toute l'humidité soit évaporée. Refroidir les tamis et les plaques jusqu'à la température ambiante d'essai avant les expériences débutants.
- Placez un plat peu profond sur le dessus de la plaque de diffusion et de le remplir avec de l'eau pour augmenter l'humidité locale et pour masquer l'eau dans la goutte d'agarose.
- Placez les tamis sur le plat d'eau.
4. Fly Chargement en cours dans les plaques d'essai
Diagrammes avec des spécifications pour les plaques de test peuvent être trouvés dans la section Fichiers supplémentaires. La plaque d'essai est faite d'acrylique clair et se compose de 6 arènes de test. Un simple curseur contient chambres de retenue qui permettent mouche chargement, le confinement temporaire, et la libération simultanée de 6 mouches dans leurs chambres respectives àle début de l'expérience. Réticules gravés au centre de chaque scène dans la plaque indiquent où odorants doivent être déposés à la pipette.
- Insérer les curseurs dans la plaque de test de l'acrylique.
- Faites glisser doucement l'aspirateur dans le flacon au-delà du tampon de coton et permettre à environ 6 vol à pied dans le aspirator.it est essentiel d'être aussi doux que possible dans leur manipulation. On peut profiter de comportement de la mouche phototactiques pour induire vol à ramper vers l'aspirateur en soulignant l'ouverture du flacon vers une source de lumière faible. Si nécessaire, on peut aussi appliquer une aspiration douce pour aspirer environ 6 mouches femelles.
- Insérer l'embout de l'aspirateur dans le premier trou de la plaque de test. Laisser une mouche de passer dans la cellule de détention et doucement avancer le curseur vers l'avant pour charger une mouche dans le trou suivant. Continuez jusqu'à ce que les mouches occupent tous les 6 cellules de détention de la plaque.
- 5 ul de solution de vinaigre d'agarose à 1% de cidre de pomme directement sur le centre de la cross-poils sur la face interne de la plaque de test.
5. Positionnement de la plaque d'essai
- Pour centrer la plaque de test, ouvrez le fichier nommé "Positionnement Tool.vi." "VI LabVIEW pour Outil de positionnement. vi peut être trouvé dans la section Fichiers supplémentaires. Exécutez le fichier en cliquant sur la flèche blanche dans le coin supérieur gauche de l'écran.
- Placer la plaque de test au-dessus du tamis de sorte que l'ouverture fait face à la scène de la chaussée tamis et la cible d'odeur est présent dans le plafond de la plaque. Aligner les réticules gravés dans l'arrière de la plaque de test avec le réticule sur l'écran du moniteur.
- Lorsque l'alignement est terminé, interrompre l'exécution en cliquant sur le point rouge situé dans le coin supérieur gauche de l'écran.
6. Enregistrer la position Fly cours de l'expérience
- Pour suivre et d'enregistrer les coordonnées de la mouche au cours de chaque essai de recherche de la nourriture, ouvrez le fichier du logiciel d'acquisition "Fly Tracking - Six Zones.vi "VIs LabVIEW pour" Suivi Fly -. Six Zones.vi "peut être trouvé dans la section Fichiers supplémentaires Exécutez le fichier en cliquant sur la flèche blanche dans le coin supérieur gauche de l'écran. .
- Attribuez un nom au fichier et cliquez sur "OK".
- Avancer les curseurs dans les chambres d'essai pour libérer les mouches dans les arènes de test. Veillez à ne pas déplacer les chambres de test comme cela conduira à un mauvais alignement avec les coordonnées de logiciels d'analyse.
- Cliquez sur "Démarrer" (l'enregistrement commence) et veiller à ce que la seule source de lumière dans la chambre d'essai est le panneau LED 660 nm.
- Lorsque le procès est terminé, retirez le tamis et la chambre de comportement. Soulevez la plaque de test du tamis et enlever les mouches en immergeant la plaque de glace. Nettoyez délicatement la plaque avec de l'eau chaude et enlever tous les débris agarose. Placer les plaques d'essai dans un four de séchage pour éliminer l'humidité.
- Aérer la zone de test en tournant sur un small ventilateur pendant environ 2 min. Arrêter le ventilateur et charger le prochain groupe de mouches dans la plaque de test suivante.
7. Analyse des données au moyen de logiciels personnalisés
"Analyse des données de suivi Fly-Six zones" peut être trouvé dans la section Fichiers supplémentaires. Lors de l'acquisition de données, les coordonnées de position de mouche individuelle des dossiers de logiciels d'acquisition pour chaque point de temps dans un fichier texte. Un appareil photo numérique unique positionné au-dessus des plaques d'essai acquiert des images à un taux de 0,5 Hz de trame. Le logiciel d'analyse "analyse des données pour la mouche de suivi-Six zones" extrait les informations de ce fichier texte à un) calculer la vitesse moyenne, b) déterminer le moment où une mouche situé succès la source de l'odeur, et c) la construction des fenêtres graphiques temps qui permettent à l'utilisateur de vue: voler l'emplacement, la distance de la mouche de la source de l'odeur dans le temps et la vitesse de vol moyenne au fil du temps. Il met également en forme les données pour l'exportation facile en spreprogramme de adsheet. Dans cette macro, nourriture recherche de latence est définie comme le point de temps à qui vole passer au moins 5 secondes dans un rayon de 5 mm du centre de l'arène.
- Ouvrez le fichier du logiciel d'analyse «l'analyse des données pour le suivi Fly - Six zones". Sous l'onglet "Windows", cliquez sur "Créer une nouvelle table." Répétez cette étape jusqu'à six tableaux ont été créés.
- Sous l'onglet "Macros", cliquez sur "Foodfinding." Un panneau principal devrait apparaître avec les options suivantes: Ouvrir fichier de données brutes pour la disposition; Ouvrir les données brutes du fichier pour un fichier de données; Fly Lieu, Distance, vitesse, mise en page; FormatDataFile.
- Pour afficher les données brutes sans ajoutant des valeurs dans un fichier texte, cliquez sur "Ouvrir un fichier de données brutes pour la disposition." Recherchez et sélectionnez le fichier de données expérimentales dans la fenêtre du navigateur qui apparaît. Cliquez sur "Ouvrir".
- Cliquez sur "Fly Lieu" pour voir l'emplacement de chaque mouche dans chacun des six domaines (six parcelles XY représentant chaque volée »s la position dans le temps devrait apparaître sur l'écran).
- Cliquez sur "Distance" pour afficher la distance de chaque volée de la source de l'odeur (six parcelles représentant la distance de la mouche de la source de l'odeur dans le temps doivent apparaître sur l'écran). La ligne horizontale à y = 5 mm indique le seuil à partir duquel la volée est considéré comme étant situé à la source de nourriture.
- Cliquez sur "Speed" pour afficher la vitesse moyenne de chaque volée pendant le procès (six parcelles représentant la vitesse de la mouche dans le temps doivent apparaître sur l'écran).
- Cliquez sur "Mise en page" pour afficher une mise en page avec tous les emplacement à la mouche, la distance et la vitesse des graphiques en plus de la vitesse moyenne (pendant les 50 premières secondes) et la latence de trouver la source de l'odeur pour chaque volée (figure 1). Pour voir correctement la mise en page, il peut être nécessaire d'ajuster les marges. Pour ce faire, cliquez d'abord sur la fenêtre de mise en page. Sous l'onglet "Fichier", cliquez sur "Mise en page pour la disposition." Enlever les marges de0,2 pouces et cliquez sur "OK". Immédiatement à gauche de chaque parcelle de l'emplacement est un petit tableau avec les rubriques "Speed" et "latence". Les valeurs entrées sous chaque rubrique indiquent la vitesse moyenne en mm / sec et la recherche de la nourriture de latence en secondes. Entrées vides sous latence indiquent la mouche n'a pu trouver la source de l'odeur. Recherche alimentaire de latence est définie comme le point de temps au cours de laquelle les mouches ont passé au moins 5 secondes dans un rayon de 5 mm du centre de la chambre.
- Pour imprimer une mise en page, cliquez sur la zone de mise en page (les mises à jour de mise en page dans le fichier en cours). Cliquez sur «Fichier» puis cliquez sur «Mise en page».
- Pour voir l'image suivante, cliquez simplement sur "Ouvrir un fichier de données brutes pour la disposition." Cliquez sur le fichier de données brutes suivante que vous souhaitez voir et cliquez sur "OK". Cliquez sur la fenêtre de mise en page pour mettre à jour la fenêtre avec le nouveau fichier de données.
- Les réglages peuvent être sauvegardés dans un fichier de l'expérience pour une utilisation ultérieure.
8. Exporter des données dele logiciel d'analyse de données sur un tableur
- Pour exporter données de vitesse et de latence pour chaque fichier, cliquez sur «Ouvrir les données brutes du fichier pour le fichier de données." Sélectionnez un fichier de données expérimentales et cliquez sur «Ouvrir». Une nouvelle fenêtre de navigateur apparaît.
- Dans la nouvelle fenêtre de navigateur, cliquez sur "Nouveau" puis cliquez sur "Document texte". Nommez le nouveau document texte. Sélectionnez le fichier texte nouvellement nommé et cliquez sur «Ouvrir». Cette stocke les données du fichier de données brutes dans le fichier texte.
- Pour exporter des données depuis un autre fichier, cliquez sur "Ouvrir un fichier de données brutes pour le fichier de données." Cliquez sur un autre fichier et cliquez sur «Ouvrir». Sélectionnez le fichier de texte de l'étape 8.2). Continuez ce processus pour les fichiers de données restants que vous souhaitez exporter.
- Une fois tous les fichiers de données souhaités ont été ajoutés au fichier de texte, cliquez sur "Format de fichier de données." Sélectionnez le document texte utilisé pour stocker les données des étapes précédentes et cliquez sur «Ouvrir» (une nouvelle window ouvrira automatiquement).
- Créez un nouveau document de texte dans la fenêtre, attribuer un nom au fichier, et cliquez sur "Enregistrer". Cela crée un fichier texte qui contient le nom du fichier, la vitesse moyenne et temps de latence pour chaque mouche et peuvent être importés dans un tableur.
- Parcelles cumulatifs sont construits à partir de données sur le nombre total de mouches atteignant la cible de l'odeur des aliments en fonction du temps (figure 3).
- Ensembles de données expérimentales sont analysées pour la signification statistique en utilisant un test z pour les proportions.
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Representative Results
Le logiciel d'analyse de données et la mise en page, un exemple de ce qui peut être vu sur la figure 1, sont utilisés pour évaluer les performances de chaque volée lors de son essai de 10 min, selon un ensemble de critères d'analyse. Les critères suivants sont utilisés pour déterminer si les données de chaque volée seront utilisées pour l'analyse de données et sont conçus pour éliminer les mouches qui sont incapables d'accomplir la tâche de recherche de nourriture en raison d'une blessure, d'une maladie, le stress, ou le manque de motivation.
Les mouches qui sont inactifs pendant plus de 300 secondes sont considérés comme «inactifs» et sont rejetées à partir de l'ensemble de données, sauf si a) elles ont déjà réussi à localiser la source de nourriture ou b) présentent une vitesse moyenne> 10 mm / s pendant au moins 100 secondes après la période inactive (figures 2a, 2b, 2c).
Vol santé présentent un comportement de recherche robuste immédiatement lors de la libération de leurs chambres de maintien. Ainsi, pour ne sélectionner que les mouches quiprésentent des vitesses santé durant les premiers stades de la recherche d'odeur active, que les mouches qui se déplacent dans une certaine gamme de vitesses pour la 50 premières secondes de l'essai sont acceptés pour l'analyse des données. Ce critère est basé sur nos observations que a) que les mouches près de la source de l'odeur, leurs vitesses diminuent et b) quelques mouches atteignent la cible de l'odeur dans les 50 premières secondes du test. Les critères de vitesse sont déterminées par l'évaluation des vitesses moyennes d'au moins 100 mouches de commande, à une température donnée expérimentale. Les limites / vitesse inférieure et supérieure sont fixés par la vitesse moyenne + / - écart-type, respectivement. Par exemple, à 21 ° C, que les mouches qui se déplacent entre 03.05 à 10.05 mm / s dans les 50 premières secondes de l'essai sont utilisés pour l'analyse des données. Les exceptions à cette règle sont prévues pour les mouches qui ont réussi à localiser la source de l'odeur dans les 50 premières secondes et ne sont donc plus lente que la limite de vitesse inférieure.
Les mouches qui ne se déplacent pas à travers les quatre quadrants de la scène et la tête droitepour la source de nourriture après le début du procès sont rejetés (figure 2d).
Les mouches qui tissent rapprocher et s'éloigner de la source d'alimentation à l'intérieur d'un rayon de 10 mm pour un minimum de 50 secondes sont considérées comme ayant réussi à trouver la source de nourriture. La distance représentant de la parcelle de la mouche de la source de l'odeur dans le temps peut être utilisé pour évaluer ce cas rare. C'est le seul exemple d'une recherche réussie qui n'est pas automatiquement détecté par l'analyse des données macro actuelle et doit être détecté manuellement (figure 2e)
Arenas avec des objets visibles dans la mouche position de trace sont rejetées. Artefacts peuvent être créés par n'importe quel événement où le logiciel d'acquisition de données détecte un objet autre que la mouche. Ils apparaissent souvent, comme des lignes droites et longues qui s'étendent à travers l'arène ou rayonnent de son centre (figure 2f).
Dans la figure 3, les mouches adultes affamés 18-24 h présentent un o supérieursensibilité lfactory aux odeurs liées à l'alimentation que leurs homologues nourris 1. Une représentation graphique du pourcentage cumulé de mouches que localiser avec succès une source de l'odeur de la nourriture montre 30% de toutes les mouches affamées réussir dans une fenêtre de 10 min, en revanche, seulement 7% de toutes les mouches nourries faire (figure 3). Cette réponse comportementale olfactive accrue a déjà été montré à exiger antennes intact 1. Le non-respect d'une différence claire entre les nourris et affamés vol de contrôle dans ce test peut être résolu en examinant l'élevage de l'environnement et des conditions de test.
Une stratégie utile pour les conditions d'essai de dépannage consiste à examiner si les mouches sont attirées par les indices supplémentaires autres que la cible de l'odeur en mesurant mouche attirance pour le véhicule d'odeur, agarose. Mouches affamées doivent présenter un nombre significativement plus attraction au vinaigre que le véhicule seul agarose (figure 4b). Figure 4aRésultats des expositions d'une recherche expérience alimentaire qui a été effectuée à 32 ° C avec une humidité ambiante de 35% en utilisant des mouches de type sauvage. Dans cet ensemble de données, pas de différence significative entre la mouche du vinaigre et de l'attraction de la commande d'agarose a été détectée. Cela est probablement dû à une augmentation de l'attraction de l'eau se trouvant dans la gouttelette d'agarose à des températures d'essai plus élevées. En augmentant les tests d'humidité de 50-60%, nous avons pu corriger ce changement de comportement et de rétablir la différence significative entre attraction au vinaigre et le véhicule agarose (figure 4b, * désigne p <0,05).
Figure 1. Une mise en page de données du logiciel d'analyse typique illustre la position volez au fil du temps, la distance volez de source de l'odeur dans le temps, et la vitesse voler au fil du temps. Le tableau 2 de la colonne dans la partie supérieure gauchecoin de chaque arène affiche la vitesse moyenne (mm / s) pendant les 50 premières secondes (colonne 1) et le temps de latence de la recherche de nourriture dans sec (colonne 2). En outre, le nom du fichier texte ouvert est ajouté au coin inférieur gauche (illustré comme «OZ120807_ORCODTKRi_1% _S4"). Cliquez ici pour agrandir la figure .
Figure 2. Des exemples de différents types de traces dans les critères d'analyse. A.) Fly qui a été inactif pendant 300 + s est rejetée. B). Fly resté inactif après avoir localisé avec succès la nourriture est acceptée. C.) Fly qui a été inactif pendant 300 + sec mais montre une forte activité pendant au moins 100 secondes après la période d'inactivité est acceptée. D.) Volez e à la tête droite pour la source de nourriture après la libération est rejetée. E.) Flies que l'armure se rapprocher et s'éloigner de la source de la nourriture dans un rayon de 10 mm pour un minimum de 50 secondes sont considérées comme ayant réussi à trouver la source de nourriture et sont acceptés. F .) Arenas avec des objets visibles dans la mise en page sont rejetées. Cliquez ici pour agrandir la figure .
Figure 3. Représentation graphique montrant un pourcentage cumulé de mouches nourries et affamés que trouver la source de l'odeur dans le temps en utilisant la latence de la recherche de nourriture. (n = 88-96 mouches; * désigne p <0,05, ** représente p <0,01).
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Figure 4. conditions de test Dépannage A) représentation graphique montrant le pourcentage cumulé de mouches que trouver 1% de vinaigre ou d'un véhicule d'agarose au fil du temps. Aucune différence significative n'a été détectée dans la mouche attraction soit odeur cible lorsque les conditions de test étaient à 32 ° C et 35% d'humidité (n = 62-94 mouches). B) représentation graphique montrant le pourcentage cumulé de mouches qui trouvent 1% de vinaigre ou d'un véhicule d'agarose au fil du temps. Conditions d'essai étaient à 32 ° C et 50-60% d'humidité. Dans ces conditions, les mouches sont beaucoup plus attirés par 1% de vinaigre que le véhicule agarose (n = 55-71 mouches; * désigne p <0,05).
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Discussion
Dans ce protocole, nous décrivons une procédure pas-à-pas pour l'essai du comportement de recherche de nourriture. En plus des odeurs liées à l'alimentation, il peut également être adapté pour l'étude de la capacité de la mouche de la placer d'autres objets d'odeurs. Par exemple, il peut être appliqué vers l'étude du comportement de localisation de compagnon dans les mouches mâles 3 Il ya plusieurs considérations supplémentaires pour ce protocole que nous allons mentionner ici concernant cette procédure.:
Tout d'abord, la température d'élevage détermine combien de temps les mouches expérimentales doivent être âgés avant le test. Il est recommandé une gamme d'âges être examiné pour déterminer l'âge le plus approprié pour l'expérience. Par exemple, dans notre expérience, lorsqu'ils sont élevés à 21 ° C, les différences entre les réponses nourris et affamés mouche sont plus robuste après avoir été âgés de 4-5 jours.
Deuxièmement, les voyants s'allument une plaque de diffuseur en verre qui sert à créer constante, même sous un éclairement echambres acryliques e. Suffisamment même, un éclairage constant, et lumineux est essentiel pour le suivi automatisé de mouvement à la mouche. Éclairage inégal ou vacillante sources de lumière peuvent conduire à des erreurs dans le suivi automatisé de la mouche que soit le résultat de l'incapacité intermittente pour détecter la position de la mouche ou le logiciel de confondre les objets légers comme la mouche. Nous avons trouvé à la fois un rétroéclairage LED disponibles dans le commerce ou un travail sur mesure de la matrice LED aussi bien pour répondre aux besoins d'éclairage pour ce test.
Troisièmement, si le logiciel détecte par erreur de petits changements dans l'éclairage ou des objets d'agarose comme supplémentaires, les paramètres de détection d'objet dans le logiciel d'acquisition "Fly suivi-Six zones" peut être ajusté pour le seuil ainsi que la taille de l'objet. Réglage des paramètres de détection assure que seul un objet est détecté dans chaque arène. Pour voir le nombre d'objets étant suivis dans chaque arène, cliquez sur l'onglet "seuil" de la "mouche de suivi-Six Zones "logiciel d'acquisition. Si plus d'un objet est suivi, on peut ajuster la taille Min, Max Taille, Min seuil, ou seuil maximum jusqu'à ce que l'artefact détecté disparaît.
Quatrièmement, volent les stocks utilisés dans ces expériences devraient être isogenized. Performances comportementales de ce paradigme sont très sensibles aux différences de contextes génétiques. Les femelles fécondées sont utilisés pour réduire la variabilité comportementale potentiel associé à l'état de l'accouplement ou de sexe. Il n'ya aucune raison de croire que ce test ne serait pas aussi efficace dans l'étude du comportement des mâles ou des femelles vierges.
Cinquièmement, le tamis doit être suspendue légèrement au-dessus de la plaque de diffusion de lumière pour empêcher la saturation de l'odeur de l'odeur de gradient (la suspension est d'environ 2 cm avec notre modèle acheté dans le commerce). Nous utilisons tamis disponibles dans le commerce pour créer un plancher poreux sous les plaques d'essai.
Enfin, afin de produire des données fiablesensembles, la cohérence est nécessaire dans des conditions d'élevage et d'essais expérimentaux. Tout manquement à voir des différences significatives entre les réponses nourris et affamés en vol de contrôle peut être résolu par la vérification pour s'assurer que 1) les mouches sont élevés dans des conditions de température et d'humidité stables, 2) que les mouches sont nourris avec des aliments frais et ne sont pas élevés dans des conditions de surpeuplement, 3) nouvellement éclos exposition au CO 2 vol est minimisé, 4) les mouches expérience de la même longueur de la famine, 5) que les mouches sont testés dans des conditions de température et d'humidité stables, et 6) l'environnement de test et les chambres ne sont pas contaminés par les odeurs des essais précédents ou des expériences. En plus des paramètres mentionnés ci-dessus, isogenization des stocks de mouches est important que différents fonds génétiques peuvent influencer la performance de mouche dans cet essai. En outre, si le vinaigre est utilisé comme source de l'odeur, il faut prendre soin de s'assurer qu'il ne perde pas son activité en le mettant hermétiquement fermé et conservé à 4 ° C.
6 ou quatre-champ olfactomètre 4,5.
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Disclosures
Les auteurs déclarent aucun intérêt financier concurrent.
Acknowledgments
Ce travail a été financé par des subventions de recherche à JWW de l'Institut National de la Santé (R01DK092640) et la National Science Foundation (0920668).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Apple Cider Vinegar | Spectrum | commercially available | |
| Agarose, Type VII | Sigma-Aldrich | A0701 | low gelling temperature agarose |
| Acrylic Testing Plate | custom | Plate contains 6 arenas. Each arena is 60 mm in diameter 6 mm in height. See testing plate diagrams for specific measurements. | |
| LabVIEW V.8.5 | National Instruments | 776670-09 | platform for programs: PositioningTool.vi, FlyTracking--Six Zones.vi NOTE: "elapsed time.vi", "time into file.vi", and "two object detect.vi" are included subroutines that must be available in order for the main data acquisition program "FlyTracking--Six zones.vi" to run. |
| LabVIEW Vision 8.5 | |||
| LabVIEW Vision Acquisition Software 8.5 | |||
| LabVIEW Vision Builder AI 3.5 | |||
| Igor Pro V.6 | Wavemetric, Inc. | platform for macro: Data Analysis for Fly Tracking--Six Zones | |
| Basler scA1390-17fm | National Instruments | 779980-01 | Digital Camera NOTE: driver for camera available at Baslerweb.com |
| 8 mm lens | National Instruments | 780024-01 | Lens for Basler Digital Camera |
| Ground Glass Diffuser Plate | Edmund Optics | custom | Diffuses light, 25 cm x 30 cm |
| US Std. No. 100 | Fischer Scientific | 04-881X | Sieve with nominal opening of 150 μm |
| Lighting Option 1 | |||
| LED backlight 660 nm (20 cm x 20 cm) | Spectra West | BL47192 | a simpler but more expensive lighting option. |
| Power Supply for LED Backlight | Spectra West | ||
| Lighting Option 2 | |||
| 660 nm LEDs | Superbrightleds | RL5R1330 | Wavelength 660 nm (approximately 7 x 7 LED array for a 14.7 inch x 9.75 inch panel) |
| Linear DC Power Supply | GW Instek | GPS-1830D | Power supply for LED Panel |
| Solderless Breadboard | Digikey | 922354-ND | Breadboard for LEDs |
References
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