Summary
In deze video artikel beschrijven we een geautomatiseerde test om het effect van honger of verzadiging op olfactorische afhankelijke voedsel zoekgedrag meten de volwassen fruitvlieg Drosophila melanogaster.
Abstract
Voor veel dieren, honger bevordert veranderingen in de olfactorische systeem op een manier die de zoektocht naar geschikte voedselbronnen vergemakkelijkt. In deze video artikel beschrijven we een geautomatiseerde test om het effect van honger of verzadiging op olfactorische afhankelijke voedsel zoekgedrag meten de volwassen fruitvlieg Drosophila melanogaster. In een lichtdichte doos verlicht door rood licht dat onzichtbaar is voor fruitvliegjes, een camera gekoppeld aan aangepaste data-acquisitie software bewaakt de positie van zes vliegen tegelijk. Elke vlieg beperkt zich tot lopen in individuele arena's met een levensmiddel geur in het centrum. Het testen arena's rusten op een poreuze vloer die functies geur stapeling te voorkomen. Latentie om de geur bron, een metric die olfactorische gevoeligheid onder verschillende fysiologische staten weerspiegelt vinden, wordt bepaald door software-analyse. Hier bespreken we de kritische mechanica van het runnen van deze gedrags-paradigma en betreft specifieke aspecten met betrekking tot vliegen loading, geurcontaminatie, test temperatuur, kwaliteit van de gegevens en statistische analyse.
Introduction
Staten van de honger bevorderen twee soorten appetitieve gedrag: voedsel zoeken en voedselconsumptie 1. Deze eenvoudige gedrags assay is bruikbaar voor de studie van chemotactische gedrag geassocieerd met het voederen 2,3. In het bijzonder, het tracks vliegen positie, loopsnelheid en latentie tot het lokaliseren van een levensmiddel geur doelwit. Latentie van voedsel bevinding dient als maatstaf voor het meten van veranderingen in de gevoeligheid van geur detectie systeem van de vlieg stroomafwaarts van veranderingen in de interne appetitief staat. Een handmatige versie van deze test is eerder gebruikt om aan te tonen GABA-B receptor signalering is belangrijk voor geur lokalisatie gedrag bij volwassen vliegen 3. De huidige geautomatiseerde versie van de test was instrumenteel in de studie van hoe kort neuropeptide-F (SNPF) signalering hervormt het olfactorische kaart in Drosophila en invloeden appetitive gedrag 2.
Het testen wordt uitgevoerd in een donkere, temperatuur en vochtigheid ruimte. Digitaalvideocamera's boven de helder acrylaat testen platen set bijhouden vliegen verlicht door 660-nm LED-verlichting. Informatie van de camera wordt verwerkt in real-time door een computer gestationeerd naast het testgebied. We maken gebruik van data-acquisitie software om de coördinaten van vliegen posities opnemen en opslaan tijdens de testperiode.
In dit paradigma, wordt het onderwerp losgelaten in een arena die een levensmiddel geur in het midden bevat, de geur object creëert een voedsel geur gradiënt in de arena dat voedsel zoekgedrag induceert in de vlieg. Een soortgelijke geur zoekprotocol is toegepast in de richting van de studie van chemosensation in enkele Drosophila larven 7. Terwijl andere gedrags-testen zoals de vier-veld olfactometer 4,5 of t-doolhof 6 evalueren geur aversie of attractie gedrag, wordt dit paradigma best geschikt voor olfactorische gevoeligheid en chemotaxis gedrag te evalueren.
Een aantal belangrijke voordelen te begeleiden deze ASSAy. Ten eerste, het maakt het mogelijk snelle verwerving van grote datasets, omdat het verzamelen en analyseren van gegevens meestal worden geautomatiseerd. Ten tweede, deze test isoleert en meet het gedrag van enkele vliegen, zodat het niet langer sociale olfactorische signalen die hun gedrag kunnen beïnvloeden. Ten derde, de eenvoud van het protocol en eenvoudige experimentele design maken de test efficiënt en gemakkelijk om anderen te onderwijzen.
Daarnaast kan deze test worden gebruikt voor het verder onderzoeken neurale circuits onderliggende voedsel zoekgedrag door het te combineren met de uitgebreide genetische toolkit beschikbaar Drosophila melanogaster 8. Gerichte expressie van transgenen die stilte of prikkelen neuronen kan worden bereikt met instrumenten zoals het GAL4-UAS-systeem evenals de UAS-shibire ts1, UAS-tetanus-toxine, en UAS-TRPA1 (B) transgenen 9-12.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Fly Collection en uithongering
- Achterzijde van de experimentele vliegen onder gecontroleerde temperatuur en vochtigheidsgraad (bv. 21 ° C, 50-60% relatieve vochtigheid) op een 12-uur licht / donker-cyclus.
- Verzamel vrouw vliegt op de dag van eclosion en leg ze, samen met 4-5 mannetjes, in nieuwe voeding flesjes (maximaal 30 per flacon). Leeftijd vliegt 2-5 dagen.
- Bereid de kamers voor vlieg verhongering.
- Duw een weefsel (4,8 x 8,4 inch) tot aan de bodem van een lege plastic flacon. Volledig genieten van het weefsel met gedestilleerd water. Gebruik een voorwerp naar beneden te duwen op het weefsel en knijp er zachtjes het overtollige water.
- Keer de injectieflacon om het extra water weggooien. Er moet voldoende water om de vliegen gehydrateerd en honger kamer vochtig houden, maar niet genoeg om de vliegen verdrinken.
- Breng de vliegen uit het voedsel flacon op in een honger kamer en sluit de flacon ongeveer 18-24 uur voordat het experiment begint. Bewaar devaatjes onder gecontroleerde temperatuur en vochtigheid 's nachts tot het experiment begint de volgende dag.
2. Voorbereiding van de Voedsel Geur
- Bereid een 1% agarose-oplossing door 0,1 g agarose lage smelttemperatuur tot 10 ml gedestilleerd water in een glazen kolf. Verwarm de agarose oplossing in een magnetron enkel tot het begint te koken, maar ruim voor het overkookt.
- Stop de magnetron en zwenk de kolf een keer. Herhaal deze stap nog twee keer tot de agarose volledig is opgelost. Bewaar de agarose oplossing in een vloeibare toestand door het houden van de kolf warm op een kookplaat ingesteld op 50 ° C.
- Voeg 990 ul van de 1% agarose-oplossing en 10 ul van appelazijn om een 1,5 ml Eppendorf buis naar een 1% appelazijn oplossing. Vortex de oplossing totdat gemengd en doe dit in een droge bad incubator ingesteld op 50 ° C.
3. Testen Kamer en Gedrag Kamer Setup
- Schakel de LED-paneel (660 nm).
- Spoel de zeven en testplaten met warm water en verwarm ze in een droogoven tot alle vocht verdampt. Koel de zeven en platen naar beneden om het testen op kamertemperatuur voordat u begint met experimenten.
- Plaats een ondiepe schaal op de top van de diffuser bord en vul het met water om de plaatselijke luchtvochtigheid te verhogen en om het water te maskeren in de agarose druppel.
- Plaats de zeven over het water gerecht.
4. Vlieg Laden in de testkamer Plates
Diagrammen met specificaties voor het testen van borden zijn te vinden in de sectie Aanvullende Files. Het testen plaat is gemaakt van helder acryl en bestaat uit 6 testen arena's. Een eenvoudige slider bevat met kamers die vliegen laden, tijdelijke insluiting, en gelijktijdige release van 6 vliegen mogelijk te maken in hun respectievelijke kamers bijde start van het experiment. Dradenkruis geëtst in het centrum van elke arena in de plaat aan waar geurstoffen worden gepipetteerd.
- Plaats de schuifregelaars in de acryl testplaat.
- Schuif de afzuiger in de flacon langs de prop katoen en laat ongeveer 6 vliegen te lopen in de aspirator.it is van cruciaal belang zo zacht mogelijk te zijn in het omgaan met hen. Men kan gebruik maken van phototactic vlieg gedrag om vliegen ertoe te kruipen richting de afzuiger door te wijzen de flacon opening naar een schemerig licht bron. Eventueel kan men ook zachtjes afzuigen ongeveer 6 vrouwtjes zuigen.
- Steek de punt van de aspirator in het eerste gat van de testplaat. Laat een vlieg te passeren in de cel en voorzichtig vooruit de schuif naar voren om een vlieg te laden in de volgende hole. Ga door tot vliegen bezetten alle 6 die cellen van de plaat.
- Pipetteer 5 ul van 1% appelazijn agarose oplossing direct op het midden van de cross dradenkruis op het binnenvlak van de testplaat.
5. Plaatsing van de testplaat
- Om het testen plaat te centreren, opent u het bestand met de naam "Positioneren Tool.vi." "LabVIEW VI voor Positioning Tool. vi is te vinden in de sectie Aanvullende Files. Voer het bestand door te klikken op de witte pijl in de linkerbovenhoek van het scherm.
- Plaats de testplaat bovenop de zeef zodat de arena opening naar de zeef verdieping en de geur doel op het plafond van de plaat. Lijn de crosshairs geëtst in de achterkant van de testplaat met het kruis haren op het beeldscherm.
- Wanneer uitlijning is voltooid, afbreken executie door te klikken op de rode stip in de buurt van de linkerbovenhoek van de monitor.
6. Noteer de Fly Positie tijdens het experiment
- Op te sporen en noteer de coördinaten van de vlieg tijdens elk voedsel zoeken proef, opent de acquisitie software bestand "Fly Tracking -. Zes Zones.vi "LabVIEW VI's voor" Fly Tracking - Zes Zones.vi "is te vinden in de sectie Aanvullende Files Voer het bestand door te klikken op de witte pijl in de linkerbovenhoek van de monitor. .
- Wijs het bestand een naam en klik op "OK."
- Vooraf de schuifknoppen in de testkamers de vliegen vrij in de test arena's. Wees voorzichtig dat u de testkamers te verplaatsen, omdat dit zal leiden tot onjuiste uitlijning met analyse software coördinaten.
- Klik op "Start" (opname begint) en ervoor te zorgen dat de enige bron van licht in de testkamer is de 660 nm LED-paneel.
- Wanneer het proces is voltooid, verwijdert de zeef en het gedrag kamer. Til het testen plaat uit de zeef en verwijder de vliegen door onderdompeling de plaat in ijs. Reinig de plaat met warm water en verwijder eventuele agarose puin. Plaats de test platen in een droogoven vocht te verwijderen.
- Ventileer de testafdeling door te draaien op een small ventilator voor ongeveer 2 minuten. Schakel de ventilator uit en plaatst u de volgende groep van vliegen naar de volgende testen plaat.
7. Data analyse met behulp van Custom Software
"Data-analyse voor Fly Tracking-zes zones" zijn te vinden in de sectie Aanvullende Files. Tijdens de data-acquisitie, de acquisitie software registreert individuele fly positie coördinaten voor elk tijdstip in een tekstbestand. Een digitale camera boven het testen platen verkrijgt beelden met een snelheid van 0,5 Hz. De analyse software programma "Data-analyse voor Fly Tracking-zes zones" haalt informatie uit dat tekstbestand naar a) het berekenen van de gemiddelde snelheid, b) bepalen het tijdstip waarop een vlieg succes ligt de geurbron, en c) bouwen grafische vensters dat de gebruiker om het beeld te staan: vliegen locatie, afstand van de vlieg van de geurbron in de tijd en de gemiddelde fly snelheid in de tijd. Het formatteert de gegevens ook voor eenvoudige export in een SPREadsheet programma. In deze macro wordt het voedsel zoektijdvertraging gedefinieerd als het tijdstip waarop vliegt besteden ten minste 5 seconden binnen een straal van 5 mm van het midden van de arena.
- Open de analyse software bestand "Data-analyse voor Fly Tracking - Zes Zones". Onder het tabblad "Windows", klik op "Create New Table." Herhaal deze stap tot zes tafels zijn gemaakt.
- Onder het tabblad "Macro's", klik op "Foodfinding." Een Main Panel moeten verschijnen met de volgende opties: Open Ruwe gegevensbestand voor lay-out; Open Ruwe gegevensbestand voor Data File; Fly Location; Afstand, snelheid, Lay-out; FormatDataFile.
- Om ruwe data te bekijken zonder het toevoegen van waarden in een tekstbestand, klik op "Open Raw Data File voor lay-out." Zoek en selecteer de experimentele data bestand in de browser venster dat verschijnt. Klik op 'Openen'.
- Klik op "Fly Location" naar locatie elke vlieg bekijken in elk van de zes arena's (zes XY plots beeltenis elke fly 's positie in de tijd moet worden weergegeven op het scherm).
- Klik op "Distance" om de afstand elke vlieg uitzicht vanaf de geurbron (zes percelen beeltenis afstand van de vlieg van de geurbron loop van de tijd moet worden weergegeven op het scherm). De horizontale lijn y = 5 mm geeft de drempel waarbij de vlieg wordt geacht bij de voedselbron.
- Klik op "Speed" om elke vlieg gemiddelde snelheid zien tijdens het proces (zes percelen beeltenis van de snelheid van de vlieg in de tijd moet worden weergegeven op het scherm).
- Klik op "Layout" naar een indeling weer met de vlieg locatie, afstand en snelheid grafieken naast de gemiddelde snelheid (gedurende de eerste 50 sec) en de latentie van het vinden van de geurbron per vlieg (figuur 1). Voor de indeling volledig te bekijken, kan het nodig zijn de marges aan. Om dit te doen, klikt u eerst op de layout-venster. Onder het tabblad "Bestand", klik op "Pagina-instelling voor lay-out." Reset de marges0,2 inch en klik op "OK." Direct links van elke locatie perceel is een kleine tafel met de rubrieken "Speed" en "Wachttijd." De onder elke rubriek ingevoerde waarden geven de gemiddelde snelheid in mm / sec en voedsel zoektijdvertraging in seconden. Lege vermeldingen onder Wachttijd geven de vlieg niet de geurbron lokaliseren. Voedsel zoektijdvertraging wordt gedefinieerd als het tijdstip waarop de vliegen brachten minstens 5 seconden binnen een straal van 5 mm van het midden van de kamer.
- Om een lay-out afdrukken, klikt u op de lay-out gebied (updates lay-out naar het huidige bestand). Klik op "Bestand" en klik vervolgens op "Afdrukweergave."
- Naar het volgende bestand te bekijken, klikt u op "Open Raw Data File voor lay-out." Klik op de volgende ruwe data bestand dat u wilt bekijken en klik op "OK." Klik op de Lay-out-venster om het venster te updaten met de nieuwe data-bestand.
- De instellingen kunnen worden opgeslagen in een experiment bestand voor later gebruik.
8. Gegevens exporteren uitde data analyse software om een spreadsheetprogramma
- Om de snelheid en latency gegevens te exporteren voor elk bestand, klik op "Open Ruwe gegevensbestand voor Data File." Selecteer een experimentele data-bestand en klik op 'Openen'. Een nieuw browservenster verschijnt.
- In het nieuwe browservenster, klik met de rechtermuisknop op "Nieuw" en klik vervolgens op "Text Document." Noem de nieuwe tekstdocument. Selecteer de nieuwe naam tekstbestand en klik op 'Openen'. Deze slaat de gegevens van de ruwe data bestand in het tekstbestand.
- Om gegevens te exporteren uit een ander bestand, klikt u op "Open Raw Data File voor Data File." Klik op een ander bestand en klik op 'Openen'. Selecteer de tekst bestand uit stap 8.2). Herhaal dit proces voor de resterende data bestanden die u wilt exporteren.
- Zodra alle gewenste bestanden zijn toegevoegd aan het tekstbestand, klik op "Format Data File." Selecteer de tekst document gebruikt om gegevens van de vorige stappen te slaan en klik op "Open" (een nieuwe Window wordt automatisch geopend).
- Maak een nieuwe tekst document in het venster, wijs het bestand een naam en klik op 'Opslaan'. Dit creëert een tekstbestand dat de bestandsnaam, de gemiddelde snelheid en latency bevat voor elke vliegen en in een spreadsheet programma kan worden geïmporteerd.
- Cumulatieve plots zijn opgebouwd uit gegevens over het totale aantal vliegen bereiken het voedsel geur doelwit als een functie van de tijd (Figuur 3).
- Experimentele gegevens worden geanalyseerd op statistische significantie met een z-test voor proporties.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De data analyse software en inrichting, waarvan een voorbeeld is te zien in figuur 1, worden gebruikt om de prestaties elk vlieg tijdens de 10 min proef toetsen aan een reeks criteria analyse. De volgende criteria worden gebruikt om te bepalen of de gegevens van elke vlieg zal worden gebruikt voor data-analyse en zijn ontworpen om de vliegen die niet in staat om het voedsel te zoeken taak uit te voeren als gevolg van letsel, ziekte, stress of gebrek aan motivatie zijn te elimineren.
Vliegen die inactief voor meer dan 300 seconden zijn worden beschouwd als 'inactief' en worden uit de dataset afgewezen tenzij ze a) al zijn er in geslaagd het lokaliseren van de bron van voedsel of b) vertonen een gemiddelde snelheid> 10 mm / sec minstens 100 sec na de inactieve periode (figuren 2a, 2b, 2c).
Gezonde vliegen vertonen robuuste zoekgedrag onmiddellijk na vrijlating uit hun bedrijf kamers. Dus, om alleen die vliegen te selecteren dievertonen gezonde snelheden tijdens de vroege stadia van actieve geur zoeken, vliegt alleen dat verhuizing binnen een bepaald bereik van snelheden voor de eerste 50 seconden van de proef worden aanvaard voor data-analyse. Dit criterium is gebaseerd op waarnemingen die a) vliegt bij geurbron, hun snelheid verminderen en b) paar vliegen bereikt de geur doel binnen de eerste 50 seconden van de test. De snelheid criteria worden bepaald door het evalueren van de gemiddelde snelheid van ten minste 100 controle vliegen op een gegeven experimentele temperatuur. De bovenste / onderste snelheidslimieten worden door de gemiddelde snelheid + / set - standaarddeviatie, respectievelijk. Bijvoorbeeld, bij 21 ° C, vliegt alleen die bewegen tussen 3,5-10,5 mm / sec in de eerste 50 seconden van de proef worden gebruikt voor gegevensanalyse. Uitzonderingen op deze regel zijn gemaakt voor vliegen die met succes zich de geur bron binnen de eerste 50 sec en zijn dus langzamer dan de lagere snelheidslimiet.
Vliegen die niet bewegen door alle vier kwadranten in de arena en ga meteenvoor de voedselbron na het proces begint zijn afgewezen (figuur 2d).
Vliegen die weven naar en van de voedselbron binnen een straal van 10 mm ten minste 50 seconden worden geacht met succes vonden de voedselbron. De grafiek die afstand van de vlieg van de geurbron tijd kan worden gebruikt om deze zeldzame geval evalueren. Dit is het enige geval van een succesvolle zoektocht die niet automatisch wordt gedetecteerd door de huidige gegevensanalyse macro moet handmatig worden gedetecteerd (figuur 2e)
Arenas met zichtbare artefacten in vlieg positie trace worden geweigerd. Artefacten kunnen worden gemaakt door een evenement waar de data-acquisitie software van een ander dan de vlieg object detecteert. Ze verschijnen vaak als lange, rechte lijnen die overspanning over de arena of uitstralen vanuit het midden (figuur 2f).
In figuur 3, volwassen vliegen uitgehongerd 18-24 uur vertonen een hogere olfactory gevoeligheid voor voedsel gerelateerde geuren dan hun tegenhangers gevoed 1. Een grafische voorstelling van het cumulatieve percentage van vliegen die met succes een levensmiddel geurbron lokaliseren toont 30% van alle uitgehongerde vliegen slagen binnen een 10 minuten raam, in tegenstelling, slechts 7% van alle gevoed vliegen doen (figuur 3). Deze verhoogde olfactorische gedragsreactie werd aangetoond intact antennes 1 nodig. Het uitblijven van een duidelijk verschil tussen gevoed en uitgehongerd controle vliegen observeren in deze test kan worden opgelost door het onderzoeken van milieu-opvoeding en testen voorwaarden.
Een bruikbare strategie voor het testen van het oplossen van problemen voorwaarden is om te onderzoeken of vliegen worden aangetrokken tot andere dan de geur doel door het meten fly aantrekkingskracht uit op de geur voertuig, agarose extra cues. Uitgehongerd vliegen moet een aanzienlijk grotere aantrekkingskracht heeft om azijn dan de agarose voertuig alleen (figuur 4b). Figuur 4avertoont resultaten van een experiment dat voedsel zoeken werd uitgevoerd bij 32 ° C met een vochtigheidsgraad van milieu 35% met wildtype vliegen. In deze dataset, geen significant verschil tussen fly aantrekkingskracht azijn en de agarose controle werd ontdekt. Dit is waarschijnlijk het gevolg van een toenemende aantrekkingskracht op het water in de agarose druppel onder warmere temperaturen testen. Door het verhogen van het testen vochtigheid 50-60%, waren we in staat om te corrigeren voor deze gedrags-verandering en het grote verschil tussen de aantrekkingskracht te herstellen naar azijn en de agarose voertuig (figuur 4b, * geeft p-waarde <0,05).
Figuur 1. Een typische analyse software data layout illustreert vliegen positie in de tijd, vliegen afstand van geurbron in de tijd, en vliegen snelheid over de tijd. De 2 kolom tabel in de linkerbovenhoekhoek van elke arena toont de gemiddelde snelheid (mm / sec) gedurende de eerste 50 sec (kolom 1) en de latentie van voedsel vinden in sec (kolom 2). Daarnaast wordt de naam van de geopende tekstbestand toegevoegd aan de linker benedenhoek (geïllustreerd als, "OZ120807_ORCODTKRi_1% _S4"). Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken .
Figuur 2. Voorbeelden van verschillende soorten sporen aangepakt Analyse criteria. A.) Fly die actief is geweest voor 300 + sec wordt afgewezen. B.) Fly dat inactief is geweest na het succesvol opsporen van voedsel wordt aanvaard. C.) Fly dat niet actief is geweest 300 + sec maar toont robuust activiteit gedurende ten minste 100 sec na inactieve periode wordt aanvaard. D.) Fly th bij hoofden direct naar de bron van voedsel na de release wordt afgewezen. E.) Flies dat weven naar en weg van de bron van voedsel binnen een straal van 10 mm voor een minimum van 50 seconden worden geacht met succes te hebben gevonden de bron van voedsel en worden geaccepteerd. F .) Arenas met zichtbare artefacten in de lay-out worden geweigerd. Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken .
Figuur 3. Grafische voorstelling toont een cumulatieve percentage van de Fed en uitgehongerd vliegen die geur bron te vinden in de tijd met behulp van latentie van voedsel vinden. (N = 88-96 vliegen; * geeft p-waarde <0,05, ** geeft p-waarde <0,01).
ad/50801/50801fig4.jpg "/>
Figuur 4. Problemen testomstandigheden A) Grafische grafiek die cumulatieve percentage van vliegen die 1% azijn of agarose voertuig over tijd te vinden. Er werd geen significant verschil waargenomen in fly aantrekkingskracht om ofwel doel geur bij het testen van omstandigheden waren bij 32 ° C en 35% luchtvochtigheid (n = 62-94 vliegen). B) Grafische grafiek die cumulatieve percentage van vliegen die 1% azijn of agarose voertuig vinden na verloop van tijd. Testomstandigheden waren bij 32 ° C en 50-60% vochtigheid. Onder deze omstandigheden, vliegen beduidend meer aangetrokken tot 1% azijn dan de agarose voertuig (n = 55-71 vliegt; * geeft p-waarde <0,05).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
In dit protocol beschrijven we een stap-voor-stap procedure voor het eten zoekgedrag assay. Naast voedsel gerelateerde geuren kan ook worden aangepast voor de studie van het vermogen van de vlieg andere geur objecten lokaliseren. Bijvoorbeeld kan het worden toegepast naar de studie van mate lokalisatie gedrag bij mannelijke vliegen 3 Er zijn verschillende aanvullende overwegingen voor dit protocol dat wij hier vermelden over deze procedure.:
Ten eerste, de opfok temperatuur bepaalt hoe lang experimentele vliegen voordat testen moeten worden verouderd. Het wordt aanbevolen om een scala van leeftijden worden onderzocht om de meest geschikte leeftijd voor het experiment te bepalen. Bijvoorbeeld, in onze ervaring, wanneer gekweekt bij 21 ° C, de verschillen tussen gevoed en uitgehongerd fly reacties zijn meest robuuste nadat ze 4-5 dagen verouderd.
Ten tweede, de LED's verlichten een glazen diffuser plaat die dient om constant te maken, zelfs onder e verlichtinge acryl kamers. Voldoende vlak, constant, en heldere verlichting is van cruciaal belang voor het geautomatiseerd volgen van vliegverkeer. Ongelijkmatige verlichting of flikkerend licht bronnen kunnen leiden tot fouten in de geautomatiseerde volgen van de vlieg die ofwel leiden tot intermitterende onvermogen om de positie van de vlieg te sporen of ervoor zorgen dat de software aan het licht artefacten fout als de vlieg. We hebben zowel een commercieel verkrijgbare LED-achtergrondverlichting of een op maat gemaakte LED-array werk even goed bij het voldoen aan de verlichting nodig voor deze test gevonden.
Ten derde, als de software per ongeluk kleine veranderingen in verlichting of agarose als extra objecten, de detectie-instellingen van objecten in de "Fly Tracking-zes zones" acquisitie software detecteert kan worden aangepast voor drempel evenals grootte object. De detectie instellingen Instellen zorgt ervoor dat slechts een object wordt gedetecteerd in elke arena. Om het aantal objecten die worden bijgehouden in elke arena te bekijken, klik op de "drempel" tab van het "Fly Tracking-Six Zones "acquisitie software. Als er meer dan een object wordt bijgehouden, kan men de Min Grootte, Max Maat, Min Threshold of Max Threshold te stellen totdat de gedetecteerde artefact verdwijnt.
Ten vierde, vliegen voorraden gebruikt in deze experimenten moeten worden isogenized. Behavioral voorstellingen in dit paradigma zijn zeer gevoelig voor verschillen in genetische achtergronden. Bevruchte vrouwtjes worden gebruikt om potentiële gedrags variabiliteit geassocieerd met paring status of geslacht te verminderen. Er is geen reden te geloven deze test niet even effectief bestuderen van het gedrag van mannetjes of maagdelijke vrouwtjes.
Ten vijfde moet de zeef iets boven de lichtdiffusorplaat worden opgeschort om de geur verzadiging van de geur gradiënt (de schorsing is ongeveer 2 cm met onze winkel gekochte model) te voorkomen. We maken gebruik van in de handel verkrijgbare zeven een poreuze vloer te creëren onder het testen platen.
Ten slotte, om aan betrouwbare gegevens tesets, is consistentie nodig in experimentele kweek en testomstandigheden. Elke niet-significante verschillen tussen gevoed en uitgehongerd reacties in controle vliegen zien kan worden opgelost door te controleren om ervoor te zorgen dat 1) vliegen worden gefokt onder stabiele temperatuur en vochtigheid, zijn 2) vliegen gevoed met vers voedsel en worden niet gefokt in overvolle voorwaarden, 3) nieuw eclosed vliegen blootstelling aan CO 2 wordt geminimaliseerd, 4) vliegt ervaring dezelfde lengte van de honger, 5) vliegen worden getest onder stabiele temperatuur en vochtigheid, en 6) de testomgeving en de kamers zijn niet besmet met geuren van vorige proeven of experimenten. Behalve de hiervoor genoemde parameters, isogenization van vlieg voorraden is belangrijk omdat verschillende genetische achtergronden fly prestaties beïnvloeden deze assay. Bovendien, als azijn wordt gebruikt als geurbron, moet erop worden gelet dat het zijn vermogen verliest door hem goed afgesloten en bewaard bij 4 ° C.
6 of vier-veld olfactometer 4,5 presenteren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren geen concurrerende financieel belang.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door subsidies voor onderzoek naar JWW van het National Institute of Health (R01DK092640) en de National Science Foundation (0.920.668).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Apple Cider Vinegar | Spectrum | commercially available | |
| Agarose, Type VII | Sigma-Aldrich | A0701 | low gelling temperature agarose |
| Acrylic Testing Plate | custom | Plate contains 6 arenas. Each arena is 60 mm in diameter 6 mm in height. See testing plate diagrams for specific measurements. | |
| LabVIEW V.8.5 | National Instruments | 776670-09 | platform for programs: PositioningTool.vi, FlyTracking--Six Zones.vi NOTE: "elapsed time.vi", "time into file.vi", and "two object detect.vi" are included subroutines that must be available in order for the main data acquisition program "FlyTracking--Six zones.vi" to run. |
| LabVIEW Vision 8.5 | |||
| LabVIEW Vision Acquisition Software 8.5 | |||
| LabVIEW Vision Builder AI 3.5 | |||
| Igor Pro V.6 | Wavemetric, Inc. | platform for macro: Data Analysis for Fly Tracking--Six Zones | |
| Basler scA1390-17fm | National Instruments | 779980-01 | Digital Camera NOTE: driver for camera available at Baslerweb.com |
| 8 mm lens | National Instruments | 780024-01 | Lens for Basler Digital Camera |
| Ground Glass Diffuser Plate | Edmund Optics | custom | Diffuses light, 25 cm x 30 cm |
| US Std. No. 100 | Fischer Scientific | 04-881X | Sieve with nominal opening of 150 μm |
| Lighting Option 1 | |||
| LED backlight 660 nm (20 cm x 20 cm) | Spectra West | BL47192 | a simpler but more expensive lighting option. |
| Power Supply for LED Backlight | Spectra West | ||
| Lighting Option 2 | |||
| 660 nm LEDs | Superbrightleds | RL5R1330 | Wavelength 660 nm (approximately 7 x 7 LED array for a 14.7 inch x 9.75 inch panel) |
| Linear DC Power Supply | GW Instek | GPS-1830D | Power supply for LED Panel |
| Solderless Breadboard | Digikey | 922354-ND | Breadboard for LEDs |
References
- Dethier, V. G. The hungry fly : a physiological study of the behavior associated with feeding. , Harvard University Press. (1976).
- Root, C. M., Ko, K. I., Jafari, A., Wang, J. W. Presynaptic facilitation by neuropeptide signaling mediates odor-driven food search. Cell. 145, 133-144 (2011).
- Root, C. M., et al. A presynaptic gain control mechanism fine-tunes olfactory behavior. Neuron. 59, 311-321 (2008).
- Semmelhack, J. L., Wang, J. W. Select Drosophila glomeruli mediate innate olfactory attraction and aversion. Nature. 459, 218-223 (2009).
- Faucher, C., Forstreuter, M., Hilker, M., de Bruyne, M. Behavioral responses of Drosophila to biogenic levels of carbon dioxide depend on life-stage, sex and olfactory context. J. Exp. Biol. 209, 2739-2748 (2006).
- Quinn, W. G., Harris, W. A., Benzer, S.
- Fishilevich, E., Domingos, A. I., Asahina, K., Naef, F., Vosshall, L. B., Louis, M. Chemotaxis behavior mediated by single larval olfactory neurons in Drosophila. Curr. Biol. 15, 2086-2096 (2005).
- Venken, K. J., Simpson, J. H., Bellen, H. J. Genetic manipulation of genes and cells in the nervous system of the fruit fly. Neuron. 72, 202-230 (2011).
- Hamada, F. N., et al. An internal thermal sensor controlling temperature preference in Drosophila. Nature. 454, 217-220 (2008).
- Kitamoto, T. Conditional modification of behavior in Drosophila by targeted expression of a temperature-sensitive shibire allele in defined neurons. J. Neurobiol. 47, 81-92 (2001).
- Sweeney, S. T., Broadie, K., Keane, J., Niemann, H., O'Kane, C. J. Targeted expression of tetanus toxin light chain in Drosophila specifically eliminates synaptic transmission and causes behavioral defects. Neuron. 14, 341-351 (1995).
- Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118, 401-415 (1993).
