Summary
I denna video artikeln beskriver vi en automatiserad analys för att mäta effekten av hunger eller mättnad på luktberoende mat sökbeteende i den vuxna bananflugan Drosophila melanogaster.
Abstract
För många djur, främjar hunger förändringar i luktsystemet på ett sätt som underlättar sökandet efter lämpliga livsmedel källor. I denna video artikeln beskriver vi en automatiserad analys för att mäta effekten av hunger eller mättnad på luktberoende mat sökbeteende i den vuxna bananflugan Drosophila melanogaster. I en ljustät låda belyst med rött ljus som är osynligt för bananflugor, en kamera kopplad till anpassade datainsamling programvara övervakar positionen för sex flugor samtidigt. Varje fluga är begränsad till vandra i enskilda arenor som innehåller en mat lukt i centrum. Test arenor vilar på en porös våning som fungerar för att förhindra lukt ackumulering. Latens för att lokalisera luktkällan, ett mått som speglar lukt känslighet under olika fysiologiska tillstånd, bestäms av programvaruanalys. Här diskuterar vi de kritiska mekanik för att driva detta beteende paradigm och täcka specifika frågor om fluga loading, luktförorening, analystemperatur, datakvalitet, och statistisk analys.
Introduction
Staterna av hunger främjar två typer av begärs beteenden: mat sök-och konsumtions 1 mat. Denna enkla beteendeanalys är användbar för att studera kemotaktiska beteenden i samband med födosök 2,3. Specifikt, följer den fluga läge, gånghastighet och latens att hitta en livsmedels lukt mål. Latens för att hitta mat tjänar som mått för att mäta förändringar i känslighet flugans luktdetektionssystem nedströms förändringar i sin interna appetitive tillstånd. En manuell version av denna analys har tidigare använts för att visa GABA-B-receptorsignalering är viktigt för lukt lokalisering beteenden i vuxna flugor 3. Den nuvarande automatiserade versionen av analysen bidrog till studiet av hur kort neuropeptid-F (sNPF) signalering omformar lukt kartan i Drosophila och influenser appetitive beteenden 2.
Provningen utförs på en mörk, kontrollerad temperatur och luftfuktighet rum. Digitalvideokameror som anges ovan de klara akryl testplattor spårar flugor backlit av 660-nm LED-belysning. Information från kameran bearbetas i realtid av en dator stationerad bredvid testområdet. Vi använder datainsamling programvara för att spela in och spara koordinaterna för flyga positioner under testperioden.
I detta paradigm, är ämnet släpps ut i en arena som innehåller en livsmedels lukt i centrum, lukt objektet skapar en mat lukt lutning i arenan som inducerar mat sökbeteende i gylfen. Ett liknande lukt sökprotokoll har tillämpats mot studier av chemosensation i enstaka Drosophila larver 7. Medan andra beteendemässiga analyser såsom fyra fälts olfactometer 4,5 eller t-labyrint 6 utvärdera lukt aversion eller attraktion beteenden är detta paradigm bäst lämpade för att utvärdera luktkänslighet och kemotaxi beteenden.
Flera viktiga fördelar följa denna assay. Först tillåter det snabba förvärv av stora datamängder, eftersom datainsamling och analys är oftast automatiserade. För det andra, isolerar denna analys och mäter beteendet hos enskilda flugor, vilket eliminerar sociala lukt ledtrådar som kan påverka deras beteende. För det tredje, enkelheten i protokollet och enkel experimentell design gör analysen effektiv och lätt att lära andra.
Dessutom kan denna analys användas för att ytterligare undersöka neurala kretsar underliggande mat sökning beteende genom att kombinera det med den omfattande genetiska verktyg tillgängliga för Drosophila melanogaster 8. Targeted expression av transgener som tystnad eller exciterar neuroner kan uppnås med verktyg såsom GAL4-UAS-systemet såväl som UAS-shibire TS1, UAS-tetanus-toxin, och UAS-TRPA1 (B) transgener 9-12.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Fly Insamling och svält
- Bakre de experimentella flugor under kontrollerade temperatur-och fuktighetsförhållanden (t.ex. 21 ° C, 50-60% relativ luftfuktighet) på en 12-timmars ljus / mörker-cykel.
- Samla kvinnliga flyger på dagen för eclosion och placera dem tillsammans med 4-5 hanar, i nya livsmedels flaskor (max 30 per flaska). Ålder flyger 2-5 dagar.
- Förbered kamrarna för fluga svält.
- Skjut en enda vävnad (4,8 x 8,4 tum) ner till botten av en tom plastflaska. Helt blöt vävnaden med destillerat vatten. Använd ett föremål för att trycka ner på vävnaden och försiktigt pressa ut överflödigt vatten.
- Vänd injektionsflaskan för att göra sig av med extra vatten. Det bör finnas tillräckligt med vatten för att hålla flugorna hydrerad och svält kammaren fuktig, men inte tillräckligt för att dränka flugorna.
- Överför flugorna från flaskan mat in i en svält kammare och anslut flaskan cirka 18-24 timmar innan försöket påbörjas. Förvaraampuller under kontrollerade temperatur-och fuktighetsförhållanden över natten tills experimentet börjar nästa dag.
2. Beredning av mat lukt
- Bered en 1% agaros-lösning genom att tillsätta 0,1 g av låg smälttemperatur agarosen till 10 ml destillerat vatten i en glaskolv. Värm agaroslösningen i en mikrovågsugn bara tills den börjar koka, men långt innan det kokar över.
- Stoppa mikrovågsugn och snurra kolven en gång. Upprepa detta steg två gånger tills agarosen helt upplöst. Håll agaroslösningen i ett flytande tillstånd genom att hålla flaskan varm på en värmeplatta inställd på 50 ° C.
- Lägg till 990 l av agaroslösningen 1% och 10 pl äppelcidervinäger till ett 1,5 ml Eppendorf-rör för att göra en 1% äppelcidervinäger lösning. Vortex lösningen tills blandade och placera i en torr bad inkubator inställd på 50 ° C.
3. Test Room and Behavior Chamber Setup
- Sätt på LED-panelen (660 nm).
- Skölj siktar och testplattor med varmt vatten och värma dem i en torkugn tills all fukt har avdunstat. Kyl siktar och tallrikar ned till test rumstemperatur innan börjar experiment.
- Placera en grund skål ovanpå diffusorplattan och fylla den med vatten för att öka den lokala fuktighet och för att maskera vattnet i agaros droppen.
- Placera siktarna över vattnet skålen.
4. Fly Läser in i test Plates
Diagram med specifikationer för provningsplattor finns i Supple Files avsnittet. Testplattan är tillverkad av klar akryl och består av 6 testarenor. Ett enkelt skjutreglage innehåller håller kammare som tillåter fluga lastning, tillfällig inneslutning, och samtidig frisättning av 6 flugor i sina respektive kammare vidstarten av experimentet. Hårkors etsade i mitten av varje arena i plattan visar var odörer ska pipetteras.
- Sätt reglagen i akryl testplattan.
- Skjut försiktigt sug i flaskan förbi bomullspropp och låt ca 6 flugor för att gå in i aspirator.it är viktigt att vara så skonsam som möjligt att hantera dem. Man kan dra nytta av phototactic fluga beteende för att förmå flugor krypa mot sugapparaten genom att peka flaskans öppning mot ett svagt ljus källa. Vid behov kan man även tillämpa skonsam sugkraft för att aspirera cirka 6 kvinnliga flugor.
- För in spetsen på suganordningen i det första hålet för provplåten. Låt en enda fluga att passera in i hållcellen och försiktigt föra skjutreglaget framåt för att läsa in en fluga till nästa hål. Fortsätt tills flugor uppta alla sex hållceller i plattan.
- Pipettera 5 pl av 1% äppelcidervinäger agaroslösningen direkt på mitten av spOss-hår på insidan av testplattan.
5. Placering av Testing Plate
- För att centrera testa plattan, öppna filen med namnet "Positionering Tool.vi." "LabVIEW VI för Positioning Tool. vi finns i Supple Files avsnittet. Kör filen genom att klicka på den vita pilen i det övre vänstra hörnet av skärmen.
- Placera provplåten ovanpå sikten sådan att arenan öppning är vänd mot siktgolvet och odören Målet är på taket av plattan. Rikta hårkorset etsade i baksidan av testplattan med hårkorset på skärmen.
- När justeringen är klar avbryta exekvering genom att klicka på den röda pricken ligger nära det övre vänstra hörnet av skärmen.
6. Anteckna Fly position under försöket
- Att spåra och registrera koordinaterna för flugan under varje livsmedelsökning rättegång, öppnar förvärvet programvarufilen "Fly Tracking -. sex Zones.vi "LabVIEW VIs för" Fly Tracking - Sex Zones.vi "kan hittas i Supple Files avsnittet Kör filen genom att klicka på den vita pilen i det övre vänstra hörnet av skärmen. .
- Tilldela filen ett namn och klicka på "OK."
- Advance reglagen i testkammare för att frigöra flugorna i testarenor. Var noga med att inte röra testkammare eftersom detta kommer att leda till felaktig inriktning med analysprogram koordinater.
- Klicka på "Start" (inspelningen startar) och se till att den enda källan till ljus i testkammaren är 660 nm LED-panel.
- När rättegången är klar, ta bort silen och beteende kammare. Lyft provplåten från sikten och avlägsna flugorna genom att sänka plattan i is. Rengör försiktigt plåten med hett vatten och ta bort eventuella agaros skräp. Placera testplattor i en torkugn för att avlägsna fukt.
- Ventilera provningsområdet genom att slå på en small fläkt under ca 2 min. Slå av fläkten och ladda nästa grupp av flugor in i nästa provplåten.
7. Data Analysis Använda Custom Software
"Data Analysis för Fly Tracking-sex zoner" kan hittas i Supple Files avsnittet. Under datainsamling, koordinerar förvärvs programvara registrerar enskild fluga positionen för varje tidpunkt i en textfil. En enda digital kamera placerad ovanför testplattorna förvärvar bilder med en bildfrekvens på 0,5 Hz. Analysen programmet "Data Analysis för Fly Tracking-sex zoner" extraherar information från den textfil till a) beräkna den genomsnittliga hastigheten, b) fastställa den tidpunkt vid vilken en fluga framgångsrikt hittat luktkällan, och c) bygga grafiska fönster som tillåter användaren att se: flyga plats, avstånd flugan från luktkällan över tid och genomsnittlig fluga hastighet över tiden. Den formaterar även data för enkel export till en SPREadsheet programmet. I detta makro, är mat söklatens definieras som den tidpunkt vid vilken flyger spendera minst 5 sekunder inom en 5 mm radie från centrum av arenan.
- Öppna analysprogram filen "Data Analysis för Fly Tracking - Sex zoner". Under fliken "Windows", klicka på "Skapa ny tabell." Upprepa detta steg tills sex tabeller har skapats.
- Under "Makron" fliken, klicka på "Foodfinding." En huvudpanelen ska visas med följande alternativ: Öppna Raw datafil för layout, Öppna Raw datafil för datafil, Fly Plats, Avstånd, hastighet, Layout, FormatDataFile.
- För att se rådata utan att lägga till värden till en textfil, klicka på "Öppna Raw datafil för layout." Leta upp och markera den experimentella datafilen i webbläsarfönstret som visas. Klicka på "Öppna".
- Klicka på "Fly plats" för att visa varje fluga läge i var och en av de sex arenorna (sex XY tomter som visar varje fluga "position över tiden ska visas på skärmen).
- Klicka på "Avstånd" för att visa varje flugans avstånd från luktkällan (sex tomter som skildrar flugans avstånd från luktkällan över tiden ska visas på skärmen). Den horisontella linjen i y = 5 mm anger den tröskel vid vilken flugan anses vara beläget vid matkälla.
- Klicka på "Speed" för att visa varje flugans medelhastighet under rättegången (sex tomter som skildrar flugans hastighet över tiden ska visas på skärmen).
- Klicka på "Layout" för att visa en layout med alla fluga läge, distans och hastighet diagram i tillägg till den genomsnittliga hastigheten (under de första 50 sek) och latens att hitta luktkälla för varje fluga (Figur 1). För att korrekt visa layouten kan det vara nödvändigt att justera de marginaler. För att göra detta, klicka först på layoutfönstret. Under "Arkiv"-fliken, klicka på "Utskriftsformat för layout." Återställ marginalerna till0.2 inches och klicka på "OK." Omedelbart till vänster om varje plats tomten finns ett litet bord med rubrikerna "Speed" och "Latency". De värden som anges under varje rubrik anger medelhastigheten i mm / sek och livsmedels söklatens i sekunder. Tomma poster under Latency anger farten misslyckades med att lokalisera luktkällan. Mat söklatens definieras som den tidpunkt vid vilken flugorna bringat minst 5 sekunder inom en 5 mm radie från mitten av kammaren.
- För att skriva ut en layout, klicka på layoutområdet (uppdateringar layout till nuvarande fil). Klicka på "File" och klicka sedan på "Utskriftslayout".
- Om du vill visa nästa fil, klicka på "Öppna Raw datafil för layout." Klicka på nästa rådatafilen som du vill visa och klicka på "OK." Klicka på Layout-fönstret för att uppdatera fönstret med den nya datafilen.
- Inställningarna kan sparas i ett experiment fil för senare användning.
8. Exportera data frånData Analysis Software till ett kalkylprogram
- Att exportera hastighet och latens uppgifter för varje fil, klicka på "Öppna Raw datafil för datafil." Välj en experimentell datafil och klicka på "Öppna". Ett nytt webbläsarfönster visas.
- I det nya fönstret, högerklicka på "Ny" och klicka sedan på "Textdokument." Namnge den nya textdokument. Markera det nya namnet textfilen och klicka på "Öppna". Dessa lagrar data från rådatafilen i textfilen.
- För att exportera data från en annan fil, klicka på "Öppna Raw datafil för datafil." Klicka på en annan fil och klicka på "Öppna". Markera textfilen från steg 8,2). Fortsätt med detta i de återstående datafiler som du vill exportera.
- När alla önskade datafiler har lagts till i textfilen, klicka på "Format datafil." Välj Textdokument som används för att lagra data från föregående steg och klicka på "Öppna" (en ny window öppnas automatiskt).
- Skapa ett nytt textdokument i fönstret, tilldela filen ett namn och klicka på "Spara". Detta skapar en textfil som innehåller filnamnet, medelhastighet, och latens för varje flyga och kan importeras till ett kalkylprogram.
- Kumulativa kurvor konstrueras från data avseende det totala antalet flugor som når livsmedels lukt mål som en funktion av tid (Figur 3).
- Experimentella datauppsättningar analyseras med avseende på statistisk signifikans med användning av en z-test för proportioner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den dataanalys programvara och layout, ett exempel på detta kan ses i figur 1, används för att utvärdera varje fluga prestationer under sin 10 min rättegång enligt en rad kriterier för analys. Följande kriterier används för att avgöra om data från varje fluga kommer att användas för dataanalys och är utformade för att undanröja dessa flugor som inte kan utföra livsmedels sökuppdrag på grund av skada, sjukdom, stress eller brist på motivation.
Flugor som är inaktiv i mer än 300 sekunder anses vara "inaktiva" och avvisas från datamängden om de a) redan har lyckats lokalisera näringskälla eller b) uppvisar en medelhastighet> 10 mm / sek under minst 100 sek Följande den inaktiva period (fig. 2a, 2b, 2c).
Friska flugor uppvisar robusta sökbeteende omedelbart efter frisläppandet från sina behållarkamrama. Således, att välja endast de flugor somuppvisar friska hastigheter under de tidiga stadierna av aktiv luktökning, flyger bara att flytta inom ett visst intervall av hastigheter för de första 50 sek av rättegången accepteras för dataanalys. Detta villkor är baserad på våra observationer som a) som flugor nära luktkällan, deras hastigheter minskar och b) få flugor når lukt målet inom den första 50 sekunder av analysen. Kriterierna hastighet bestäms genom att utvärdera de genomsnittliga hastigheter på minst 100 kontroll flugor vid en given experimentell temperatur. De övre / lägre hastighetsgränser sätts av medelhastigheten + / - standardavvikelse, respektive. Till exempel vid 21 ° C, flugor endast som rör sig mellan 3,5 till 10,5 mm / sek i den första 50 sek av försök användes för dataanalys. Undantag från denna regel görs för flugor som framgångsrikt placerade lukten källa inom den första 50 sekunder och är därmed långsammare än den lägre hastighetsgräns.
Flugor som inte rör sig genom alla fyra kvadranter i arenan och huvudet raktför näringskälla efter rättegången inleds avvisas (figur 2d).
Flugor som väver mot och bort från maten anläggning inom radien 10 mm i minst 50 sekunder anses ha lyckats hitta maten källan. Kurvan som visar avståndet i farten från luktkällan över tid kan användas för att utvärdera denna sällsynta fall. Detta är den enda instans av en lyckad sökning som inte identifieras automatiskt av den aktuella dataanalys makro och måste upptäckas manuellt (figur 2e)
Arenor med synliga artefakter i fluga läge spår avvisas. Artefakter kan skapas genom att varje fall där datainsamling programvara upptäcker en annan än flugan objektet. De visas ofta som långa, raka linjer som sträcker sig över arenan eller strålar ut från dess mitt (figur 2f).
I figur 3 vuxna flugor svalt 18-24 tim uppvisar en högre olfactory känslighet för livsmedelsrelaterade lukter än sina matade motsvarigheter 1. Ett diagram över den kumulativa andelen flugor som lyckas hitta en livsmedelsluktkälla visar 30% av alla utsvultna flugor lyckas inom en 10 min fönster, däremot endast 7% av alla fed flugor gör det (Figur 3). Denna ökade luktbeteendesvar har tidigare visat att kräva intakt antenner 1. Underlåtenhet att följa en tydlig skillnad mellan födointag och utsvultna kontroll flugor i denna analys kan lösas genom att undersöka miljö uppfödning och testförhållanden.
En användbar strategi för felsökning testmetoder är att undersöka om flugor dras till andra än lukten målet genom att mäta farten attraktion till lukt fordonet, agaros ytterligare ledtrådar. Utsvultna flugor bör uppvisa en betydligt större attraktion till vinäger än till agaros fordonet ensam (figur 4b). Figur 4auppvisar resultat från en mat sökning experiment som genomfördes vid 32 ° C med en miljö-fuktighet av 35% under användning av vildtyp flugor. I denna uppsättning data, sågs ingen signifikant skillnad mellan fluga attraktion till vinäger och agaros kontroll upptäcks. Detta beror sannolikt på en ökad attraktion till det vatten som finns i agarosen droppen enligt varmare provningstemperaturer. Genom att öka testning luftfuktighet på 50-60%, kunde vi korrigera för detta beteende skift och återställa den stora skillnaden mellan attraktion till vinäger och agaros fordonet (figur 4b, * betecknar p-värde <0,05).
Figur 1. En typisk analysprogram uppgifter layout illustrerar flyga position över tiden, flyga avstånd från luktkälla med tiden, och flyga hastighet över tiden. Den två kolumner i den övre vänstrahörnet på varje arena visar medelhastighet (mm / sek) under de första 50 sek (kolumn 1) och latensen för att hitta mat i sek (kolumn 2). Dessutom är namnet på den öppna textfilen läggs till i nedre vänstra hörnet (illustrerad som, "OZ120807_ORCODTKRi_1% _S4"). Klicka här för att visa en större bild .
Figur 2. Exempel på olika typer av spår som behandlas i analyskriterier. A.) Fly som varit inaktiv för 300 + sek avvisas. B.) Fly som varit inaktiv efter att framgångsrikt lokalisera livsmedel accepteras. C.) Fly som har varit inaktiv 300 + sek men visar stark aktivitet under minst 100 sek efter inaktiv period accepteras. D.) Fly: e på huvudet rakt för näringskälla efter frigivningen avvisas. E.) Flugor att väva mot och bort från maten anläggning inom radien 10 mm i minst 50 sekunder anses ha lyckats hittat näringskälla och accepteras. F .) Arenor med synliga artefakter i layouten avvisas. Klicka här för att visa en större bild .
Figur 3. Grafisk kurva som visar en kumulativ andel av födointag och utsvultna flugor som hittar luktkälla över tiden med hjälp av latens för att hitta mat. (n = 88-96 flugor, * betecknar p-värde <0,05, ** betecknar p-värde <0,01).
ad/50801/50801fig4.jpg "/>
Figur 4. Felsökning testförhållanden A) grafisk kurva som visar kumulativ procentuell andel av flugor som hitta en% vinäger eller agaros fordonet över tiden. Ingen signifikant skillnad kunde påvisas i fluga attraktion till någon lukt mål när testförhållandena var vid 32 ° C och 35% luftfuktighet (n = 62-94 flugor). B) Grafisk kurva som visar kumulativ andel av flugor som hittar 1% ättika eller agaros fordon över tiden. Testförhållandena var vid 32 ° C och 50-60% luftfuktighet. Under dessa förhållanden, flugor är betydligt mer attraherad av 1% ättika än till agaros fordonet (n = 55-71 flugor, * betecknar p-värde <0,05).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I detta protokoll, beskriver vi en steg-för-steg-förfarande för mat sökbeteende analysen. Förutom livsmedelsrelaterade lukter, kan det också vara anpassad för att studera flugan förmåga att lokalisera andra luktobjekt. Till exempel kan den tillämpas mot studiet av mate lokalisering beteende manliga flugor 3 Det finns flera ytterligare överväganden för detta protokoll som vi kommer att nämna här om detta förfarande.:
Först bestämmer uppfödning temperaturen hur länge experimentella flugor bör vara i åldern före testning. Det rekommenderas att en rad olika åldrar undersökas för att fastställa den lämpligaste åldern för experimentet. Till exempel i vår erfarenhet, när som odlas vid 21 ° C, skillnader mellan födointag och utsvultna gylf svar är mest robusta efter att de har åldrats 4-5 dagar.
För det andra, lysdioderna lyser en glas diffusorplatta som tjänar till att skapa konstant, även belysning under the akrylKammare. Tillräckligt med, är konstant, och ljus belysning avgörande för automatisk spårning av flygrörelser. Ojämn belysning eller flimrande ljuskällor kan leda till fel i automatisk spårning av flugan som antingen resulterar i intermittent oförmåga att upptäcka flugans position eller att programvaran inte förväxla de ljusa artefakter som flugan. Vi har hittat både en kommersiellt tillgänglig LED-bakgrundsbelysning eller en specialbyggd LED array arbete lika bra på att uppfylla belysningsbehov för analys.
För det tredje, om programmet upptäcker små förändringar i belysning eller agaros som extra objekt, inställningar objektdetektering i "Fly Tracking-sex zoner" förvärv programvara misstag kan justeras för tröskel och objektstorlek. Justera inställningarna för upptäckt säkerställer att endast ett objekt upptäcks i varje arena. Om du vill visa hur många objekt som spåras i varje arena, klicka på "Threshold" fliken i "Fly Tracking-Six Zones "förvärv programvara. Om mer än ett objekt spåras, kan man justera Min Storlek, max storlek, Min Threshold, eller Max Threshold tills detekterade artefakt försvinner.
För det fjärde, flyga lager som används i dessa experiment bör isogenized. Beteende föreställningar i detta paradigm är mycket känsliga för skillnader i genetisk bakgrund. Parade honor används för att minska potentiella beteende variabiliteten associerad med parning status eller kön. Det finns ingen anledning att tro denna analys skulle inte vara lika effektiva i att studera beteendet hos män eller jungfru honor.
Femte bör sikten avbrytas något över ljus diffusorplatta att förhindra lukt mättnad av lukten lutning (suspensionen är ca 2 cm med vår kommersiellt köpt modell). Vi använder kommersiellt tillgängliga siktar för att skapa ett poröst golv under testplattorna.
Slutligen, för att få fram tillförlitliga uppgifteruppsättningar, är konsekvent krävs i experimentell uppfödning och testförhållanden. Underlåtenhet att se signifikanta skillnader mellan födointag och svalt svar i kontroll flugor kan lösas genom att kontrollera för att se till 1) flugor föds upp under stabila temperatur-och fuktförhållanden, 2) flugor matas med färska livsmedel och inte föds upp i trånga förhållanden, 3) nyligen eclosed flyga exponering för CO2 minimeras, 4) flyger erfarenhet samma längd av svält, 5) flugor testas under stabila temperatur och luftfuktighet, och 6) testmiljön och kammare inte är förorenade med lukter från tidigare studier eller experiment. Förutom de tidigare nämnda parametrarna är isogenization av gylf bestånd viktigt eftersom olika genetiska bakgrunder kan påverka fluga prestanda i denna analys. Dessutom, om vinäger används såsom luktkällan, försiktighet måste vidtas för att säkerställa att den inte förlorar sin potens genom att hålla den tätt tillsluten och lagrades vid 4 ° C.
6 eller fyra fält olfactometer 4,5.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar ingen konkurrerande ekonomiska intressen.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av forskningsanslag till JWW från National Institute of Health (R01DK092640) och National Science Foundation (0.920.668).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Apple Cider Vinegar | Spectrum | commercially available | |
| Agarose, Type VII | Sigma-Aldrich | A0701 | low gelling temperature agarose |
| Acrylic Testing Plate | custom | Plate contains 6 arenas. Each arena is 60 mm in diameter 6 mm in height. See testing plate diagrams for specific measurements. | |
| LabVIEW V.8.5 | National Instruments | 776670-09 | platform for programs: PositioningTool.vi, FlyTracking--Six Zones.vi NOTE: "elapsed time.vi", "time into file.vi", and "two object detect.vi" are included subroutines that must be available in order for the main data acquisition program "FlyTracking--Six zones.vi" to run. |
| LabVIEW Vision 8.5 | |||
| LabVIEW Vision Acquisition Software 8.5 | |||
| LabVIEW Vision Builder AI 3.5 | |||
| Igor Pro V.6 | Wavemetric, Inc. | platform for macro: Data Analysis for Fly Tracking--Six Zones | |
| Basler scA1390-17fm | National Instruments | 779980-01 | Digital Camera NOTE: driver for camera available at Baslerweb.com |
| 8 mm lens | National Instruments | 780024-01 | Lens for Basler Digital Camera |
| Ground Glass Diffuser Plate | Edmund Optics | custom | Diffuses light, 25 cm x 30 cm |
| US Std. No. 100 | Fischer Scientific | 04-881X | Sieve with nominal opening of 150 μm |
| Lighting Option 1 | |||
| LED backlight 660 nm (20 cm x 20 cm) | Spectra West | BL47192 | a simpler but more expensive lighting option. |
| Power Supply for LED Backlight | Spectra West | ||
| Lighting Option 2 | |||
| 660 nm LEDs | Superbrightleds | RL5R1330 | Wavelength 660 nm (approximately 7 x 7 LED array for a 14.7 inch x 9.75 inch panel) |
| Linear DC Power Supply | GW Instek | GPS-1830D | Power supply for LED Panel |
| Solderless Breadboard | Digikey | 922354-ND | Breadboard for LEDs |
References
- Dethier, V. G. The hungry fly : a physiological study of the behavior associated with feeding. , Harvard University Press. (1976).
- Root, C. M., Ko, K. I., Jafari, A., Wang, J. W. Presynaptic facilitation by neuropeptide signaling mediates odor-driven food search. Cell. 145, 133-144 (2011).
- Root, C. M., et al. A presynaptic gain control mechanism fine-tunes olfactory behavior. Neuron. 59, 311-321 (2008).
- Semmelhack, J. L., Wang, J. W. Select Drosophila glomeruli mediate innate olfactory attraction and aversion. Nature. 459, 218-223 (2009).
- Faucher, C., Forstreuter, M., Hilker, M., de Bruyne, M. Behavioral responses of Drosophila to biogenic levels of carbon dioxide depend on life-stage, sex and olfactory context. J. Exp. Biol. 209, 2739-2748 (2006).
- Quinn, W. G., Harris, W. A., Benzer, S.
- Fishilevich, E., Domingos, A. I., Asahina, K., Naef, F., Vosshall, L. B., Louis, M. Chemotaxis behavior mediated by single larval olfactory neurons in Drosophila. Curr. Biol. 15, 2086-2096 (2005).
- Venken, K. J., Simpson, J. H., Bellen, H. J. Genetic manipulation of genes and cells in the nervous system of the fruit fly. Neuron. 72, 202-230 (2011).
- Hamada, F. N., et al. An internal thermal sensor controlling temperature preference in Drosophila. Nature. 454, 217-220 (2008).
- Kitamoto, T. Conditional modification of behavior in Drosophila by targeted expression of a temperature-sensitive shibire allele in defined neurons. J. Neurobiol. 47, 81-92 (2001).
- Sweeney, S. T., Broadie, K., Keane, J., Niemann, H., O'Kane, C. J. Targeted expression of tetanus toxin light chain in Drosophila specifically eliminates synaptic transmission and causes behavioral defects. Neuron. 14, 341-351 (1995).
- Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118, 401-415 (1993).
