Summary
인산 칼슘 침전은 배양 된 세포의 형질 전환을위한 편리하고 경제적 인 방법입니다. 최적화로, 일차 뉴런 같은 어려운 형질 세포에이 방법을 사용하는 것이 가능하다. 여기에서 우리는 astroglial 세포와 공 배양 된 해마 신경 세포의 칼슘 형질 전환을위한 우리의 상세한 프로토콜을 설명합니다.
Abstract
인산 칼슘 침전은 배양 된 세포의 형질 전환을위한 편리하고 경제적 인 방법입니다. 최적화로, 일차 뉴런 같은 어려운 형질 세포에이 방법을 사용하는 것이 가능하다. 여기에서 우리는 astroglial 세포와 공 배양 된 해마 신경 세포의 칼슘 형질 전환을위한 우리의 상세한 프로토콜을 설명합니다.
Introduction
차 뉴런들이 postmitotic이며 마이크로 환경 변화에 매우 민감하다 같이 트랜 어려운 세포 유형의 하나이다. 이러한 세포 1 외인성 유전자와 짧은 헤어핀 RNA를 (shRNAs)의 표현 방법의 네 가지 일반적으로 사용되는 유형이있다. 각각은 자신의 장점과 단점이 있습니다. 세포 형질 감염을위한 큐벳에 전송해야 예를 들어, 전기 천공은 일반적 갓 절연 뉴런이 수행된다. 바이러스 감염은 일반적으로 매우 높은 효율 3를 달성하지만, 더 노동 집약적 인 운영과 위험하다 할 수 있습니다. 많은 지질 매개 형질 전환 시약은 신경 세포와 세포 독성의 다른 수준에있는 성공의 학위를 변화와 함께, 상업적으로 이용 가능하다.
인산 칼슘 형질 감염은 뉴런에 외래 유전자를 도입하기위한 편리하고 경제적 인 방법을 나타낸다. 첫번째 방법은 포유 동물 CEL에 아데노 바이러스 DNA를 도입하기 위해 사용 하였다그레이엄과 반 데르 EB를 (1973)에 의해 LS 4. 형질 포스페이트 완충액에서의 재조합 DNA와 염화 칼슘을 혼합함으로써 수행되었다. 이것은 서서히 세포 단층 상에 떨어질 때 DNA / 칼슘 포스페이트의 형성은 세포 표면에 부착, 엔도 사이토 시스에 의해 다루어 최종적 핵 5를 입력되며, 이는 석출물 허용한다. 이 과정은 표적 세포에 도입 된 외래 유전자의 발현을 초래할 것이다. 0.5-5 % 6-8 사이 인산 칼슘 형질 범위의 전형적인 효율성. 그러나, 조심 최적화 실험 프로토콜의 일관된 실행을, 거의 50 %의 형질 감염 효율에 도달 할 수있다. 여기에서 우리는 샌드위치 형식 9 astroglial 세포와 공 배양하는 기본 해마 신경 세포의 칼슘 형질 전환을위한 우리의 상세한 프로토콜을 설명합니다.
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Protocol
1. 에어컨 미디어 및 성상 세포 신경 세포 공 배양에 쥐 성상 세포 문화를 준비합니다.
- (BSS 레시피 표 1 참조) 해부 버퍼를 준비하고 4 ° C에서 보관 사용 준비가 될 때까지.
- 500 ㎖ 비이커에 이소 플루 란과 신생아 쥐 새끼 (P0-P2)를 마취.
- 강아지가 움직 인 경우, 70 % 에탄올로 스프레이 목을 베다.
- 뇌를 제거합니다.
- 뒤몽 # 5 포셉 한 쌍의 단단히 머리를 잡아, 피부와 두개골을 통해 중간 선 절개를 만들기 위해 미세 가위를 사용합니다.
- 측면에 두개골을 반영하여 뇌를 노출, 차가운 BSS를 포함하는 접시에 두뇌를 제거합니다.
- 해부 범위에서 간뇌와 뇌간에서 대뇌 반구를 분리합니다. 조심스럽게 집게 일쌍과 조직을 안정화하고 부드럽게 포셉의 다른 쌍의 수막을 떼어 모든 수막을 제거합니다.
- 모든 반구를 수집 IN 개의 60mm 접시. 작은 가위, 다진 조직과 같은 미세 가능한 한 사용. 그런 다음 50 ML 원뿔 튜브에 다진 조직을 전송합니다.
- 1.5 1 % DNA 분해 효소 I ㎖ 및 1.5 ㎖의 2.5 % 트립신과 두뇌에 BSS (15ML의 총 부피)의 12 ML을 추가합니다. 37 ℃에서 15 분 동안 진탕 수조에서 부화 좋은 혼합을 보장하기 위해, 튜브는 손으로 5 분마다 소용돌이된다.
- 새로운 50 ML 원뿔 관에 70 μm의 셀 스트레이너를 통해 뜨는을 전송합니다. 이 상층에 3 ㎖의 FBS를 추가합니다.
- 나머지 조각, 13.5 BSS ㎖ 및 1.5 ㎖의 2.5 % 트립신을 추가하고 또 다른 15 분 동안 진탕 수조에서 배양한다.
- 셀 스트레이너를 통해 나머지 뜨는을 전송하고 단계 1.8에서 뜨는 결합.
- 펠릿 세포 5 분 1,000 RPM에서 원심 분리기.
- 아교 미디어 5 ㎖에 재현 탁 펠렛. 상청액 나머지 세포 펠렛을 다시 원심 분리 할 수있다.
- 혈구를 사용하여 세포를 계산합니다.
- 플레이트 CEL1 × 10 7 150cm 당 2 플라스크의 밀도로 LS.
- 하루 도금 후 신선한 아교 미디어에 미디어를 변경합니다. 그 후, 아교 미디어 일주일에 두 번 세포를 공급.
- 세포가> 80 % 컨 플루 (약 십일 도금 후)에 도달했을 때, 90 % 말 혈청과 10 % DMSO에서 세포를 동결 액체 질소에 주식을 계속. 세포는 2 바이알 당 X 10 6 동결됩니다. 약 5 병 각 플라스크에서 고정 할 수 있습니다.
- 대략 10-14 일 해마 문화를 설정하기 전에, glial 세포는 냉동 주식에서 도금된다. 우리는 일반적으로 해마 신경 세포의 90 커버 슬립 (물론 당 세 개의 15mm 라운드 커버 슬립)의 성장을 지원하기에 충분하다 다섯 6 - 웰 플레이트를, 접시. 우리는 또한 형질에 대한 조절 N2.1 매체에 사용되는 glial 세포의 추가 8 ~ 10 60mm의 요리를 접시. 하루는 신경 세포의 배양하기 전에, 세포 NB27 미디어가 공급되어야한다. 성상 세포는 이상적 일에서> 90 % 합류해야한다지점입니다. 우리는 크게 동결하면 astroglial 문화에서 미세 아교 세포의 수를 줄일 것을 찾을 수 있습니다. 미세 아교 세포가 astroglial 문화에 존재하는 경우 증가 된 신경 독성이 관찰되기 때문에, 우리는 항상 신경 세포와 공 배양 냉동 주식에서 준비 astroglial 문화를 사용합니다.
2. 신경 세포 문화
- 를 MilliQ 물 2 배 첫 번째 린스로 청소 유리 커버 슬립. 그 후, 2 시간의 전체에 걸쳐 적어도 5 회 24 시간 동안 진한 질산에 침지하고을 MilliQ 물 세정된다. coverslips는 6 시간 동안 225 ° C의 오븐에 굽고 건조 및 살균된다.
- 전송 멸균 60mm 요리에 커버 슬립. 신경 세포 공 배양시 glial 세포에서 분리 유지하기 위해 각 coverslip에의 외부 가장자리 근처에 멸균 파라핀의 네 점을 놓습니다.
- 37 ° C 배양기에서 하룻밤 0.1 M 붕산 버퍼 / ㎖ 폴리-L-라이신 1 MG와 코트 커버 슬립.
- 다음 날, 멸균 m에 두 번 coverslips를 씻어적어도 15 분마다 illiQ 물. 그들은 다음 37 ° C 배양기에서 도금 미디어에서 하룻밤 배양된다.
- 기흉 다음에 이소 플루 란 마취에 의해 임신 한 쥐 (E18)를 안락사, 그리고 잘린 배아 쥐를 안락사. 머리를 제거하고 상기 한 바와 같이 대뇌 반구를 해부하다.
- 대뇌 반구에서 해마를 해부하다. 15 ML 원뿔 튜브에 모든 해마를 놓고 15 분 동안 37 ℃에서 0.25 % 트립신 (0.5 ml의 2.5 % 트립신, 4.5 ml의 BSS)과 소화.
- 소화 해마는 5 분마다 BSS 배에 씻어서. 이들은이어서 유리 파스퇴르 피펫으로 분쇄하고, 세포 밀도는 혈구 계를 사용하여 결정된다. 뉴런이어서 60mm 디쉬 당 2 × 105 세포의 밀도로 시딩 하였다.
- 대략 2-4 시간 도금 후, 전송이 신경 교세포으로 아래를 향하도록, astroglial 세포를 포함하는 요리에 연결된 뉴런의 coverslips. DIV3에서에 시토신 아라 비노 시드를 추가5 μM의 최종 농도에서 세포 glia의 증식을 정지합니다.
3. 칼슘 형질
- glia의 형질 전날의 조건 N2.1 미디어.
- 형질의 날, 아교 오프 에어컨 N2.1 미디어를 가지고 새로운 요리로 전송할 수 있습니다. 전송 에어컨 N2.1 미디어에 뉴런의 coverslips. 10 ~ 30 분 동안 인큐베이터에서 평형을 보자.
- 멸균 튜브의 한 세트로, DNA의 1-4 μg, 100 μL의 총 볼륨에 대한 2 M 염화칼슘 12.5 μL, 멸균 H 2 O를 결합. 튜브의 두 번째 세트에 2 배 HBS 100 μl를 추가합니다.
- 몇 초마다 볼 텍싱, 염화칼슘 / DNA 혼합물을 포함하는 튜브에 한번에 2X HBS의 ⅛ 체적 (12.5 μL)을 추가한다. 튜브가 15 분 동안 앉아 수 있습니다.
- 15 분 배양 후, 세포에 형질 감염 혼합물 적가. 1.5 시간 동안 배양한다. 모래 같은 침전물 층이 볼 수 있어야합니다10X 목표를 사용하여 현미경.
- 배양 후, 따뜻한 HBS 세척 버퍼로 두 번 커버 슬립을 씻어.
- , 아교와 창작 요리로 커버 슬립을 반환 0.5 mm의 최종 농도 kynurenic 산을 추가합니다.
- 형질 전환 된 뉴런의 이미지를 생성하거나 이미 다음 날 같은 면역 세포에 처리 할 수 있습니다. 신경 세포는 형질 전환 후 3 주까지 살아남을 수 있습니다.
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Representative Results
형질의 다른 매개 변수를 최적화하고 신중하게 실험 실험에서 제어하는 경우, 최대 50 %의 형질 전환 효율을 얻을 수있다. 1 DIV4에 GFP 형질 전환 된 뉴런의 필드를 보여줍니다. 필드 (16)가 형질 전환 된 가운데 28 뉴런의 전체를 포함한다. 이것은 50 %의 효율을 나타냅니다. 동일한 커버 슬립에 다른 필드의 샘플링은 전체적인 효율 (데이터 미도시) 주변의 50 %이다. astroglial 공 배양 시스템과, 신경은 건강을 유지하고 형질 전환 한 후 일반적으로 개발한다. 2 10 일 PSD-95-GFP 구조와 형질 전환 한 후, DIV15에서 해마의 신경 세포를 보여줍니다. 신경 세포는 신경 세포가 건강을 나타냅니다, 많은 성숙한 버섯 모양의 돌기 쪽을 개발했다. 높은 형질 전환 효율이 프로토콜의 최소한의 독성은 기본 하마에서 유전자 기능을 연구하기위한 유용한 도구가 있습니다campal 신경. 마지막으로,이 프로토콜은 잠재적으로 뇌의 뉴런의 다른 유형의 문화 등 어려운 형질 세포 유형을 형질하도록 구성 될 수있다.
그림 1. 해마 신경 세포 분야의 28 뉴런 중 높은 형질 전환 효율. (16)가 긍정적 보여 DIV4에서 GFP로 형질. 더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오 .
그림 2. PSD로 형질 해마 신경 세포-95-GFP 많은 성숙한 버섯 모양의 돌기 쪽을 보여주는 DIV15으로는,. 더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오 .
표 1. 버퍼 / 미디어 조리법.
| 시약 | 구성 요소들 |
| 아교 미디어 | 425 ㎖의 MEM 5 ㎖ 루타 5 ㎖ 피루브산 나트륨, 100 ㎜ 15 ㎖의 20 % 포도당 25 ML의 FBS (최종 5 %) 25 ML의 혈청 (최종 5 %) 5 ㎖ 페니실린 / 스트렙토 마이신 |
| 0.1M 붕산 버퍼 | 2.48 g 붕산 3.9 g 나트륨 붕산 (붕사) 800 ㎖의 물을 MilliQ 8.5 NaOH로 pH를 필터 소독 |
| 도금 미디어 | 425 ㎖의 MEM 5 ㎖ 루타 5 ㎖ 피루브산 나트륨, 100 ㎜ 15 ㎖의 20 % glucose 50 ㎖ FBS |
| NB27 미디어 | 485 ML Neurobasal 미디어 5 ㎖ 루타 2 ㎖의 B27 보충 (50X) |
| 해부 버퍼 (BSS) | 50 ㎖ 10 배 HBSS 5 ㎖ 1 M HEPES, pH를 7.3 5 ㎖ 페니실린 / 스트렙토 마이신 440 ML의 H 2 O |
| N2.1 미디어 | 425 ㎖의 MEM 5 ㎖ 루타 5 ㎖ 피루브산 나트륨, 100 ㎜ 15 ㎖의 20 % 포도당 MEM에 50 ㎖의 알부민, 1 % 5 ㎖ N2 보충 |
| 배 HEPES 완충 생리 식염수 (HBS), 멸균 | 274 mM의 NaCl을 9.5 밀리미터의 KCl 15 mM의 포도당 42 mM의 HEPES 1.4 밀리미터 나 2 HPO 4 3 가지의 pH (7.05, 7.10, 7.15)의 배치를 준비 |
| 세척 버퍼 (HEPES 버퍼 생리 식염수) | 50 ㎖ 10 배 HBSS 5 ㎖ 1 M HEPES, pH를 7.3 445 ML의 H 2 O |
| 50 mM의 Kynurenic 산 | 1X PBS에서 kynurenic 산 0.473 g을 녹인다. 솔루션에 그걸 얻기 위해 수산화 나트륨의 방울을 추가합니다. 그런 다음 7.0의 pH 등을 조정하기 위해 염산을 사용하여 |
표 2. 문화 준비를위한 타임 라인.
| 일 | 활동 |
| 시작하기 전에 | 성상 세포 배양을 준비하고 세포를 동결. 성상 세포 문화의 하나의 일괄 처리는 일반적으로 해마 문화의 몇 개월을 지원할 수 있습니다. |
| 1 주 월요일 | 성상 세포를 해동. |
| 1 주 화요일 | 성상 세포를 공급. |
| 1 주 금요일 | 성상 세포를 공급. |
| 주 2 월요일 | 성상 세포를 공급. 다음 24 시간 동안 질산에 담가, H 2 O에 커버 슬립을 씻어. |
| 주 2 화요일 | 린SE는 배를 커버 슬립. 드라이 coverslips를 소독. |
| 주 2 (수) | 커버 슬립에 파라핀 점을 놓습니다. 코트는 폴리-L-라이신과 커버 슬립. |
| 주 2 목요일 | 멸균 물에 코팅 된 커버 슬립을 씻어 후, 37 ℃에서 하룻밤 미디어 도금에 커버 슬립을 품다 NB27에 성상 세포에서 미디어를 변경합니다. |
| 주 2 금요일 | 해마 해부 도금. |
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Discussion
주의 깊게 지속적으로 성공적인 형질 (10, 11)에 대해 제어 할 필요가 몇 가지 주요 매개 변수가 있습니다. 칼슘 포스페이트 형질 감염에 대한 가장 중요한 매개 변수는 우리 손에 보통 7.10-7.15 사이에서 변화 2X HBS의 pH 값이다. 우리는 산도 미터 사이의 차이를 설명 할 수는 0.05 단위로 pH 값과 주식의 세 가지 배치를하는 것이 좋습니다. 또한, 클론 테크 포유류의 형질 전환 키트는 지속적으로 좋은 효율을 얻을 수 2X HBS를 제공합니다. 냉장고에 저장하는 경우에도 용액의 pH가 시간이 지남에 따라 변경됩니다 것을 염두에 두십시오. 우리는 일반적으로 최대 한 달 동안 4 ° C에서 2 배 HBS의 분취 량을 유지하고, 최대 1 년 -20 ° C에서.
두 번째 매개 변수는 배양액의 pH이다. 이 일관성, N2.1 매체를 유지하기 위해 정기적으로 하룻밤 만 이하 24 시간 astroglial 문화에 가동된다. 또한, 우리는 astroglial 문화 번째를 사용하려고에서 포화 상태에있는 유사하다. 아교 에어컨 미디어의 사용은 형질 동안 신경에 독성을 줄이는 데 도움이됩니다. 형질 일관성 pH를 유지하기 전에 에어컨 미디어는 인큐베이터에서 평형 수 있습니다.
인산 칼슘 침전물의 크기와 밀도는 성공적인 형질 열쇠이다. 큰 덩어리 진 침전물은 일반적으로 세포 독성을 10으로 이어질 동안 작은 침전물은 낮은 형질 전환 효율로 이어질 것입니다. DNA / 염화칼슘 및 2X HBS (11)를 혼합 할 때 일관성있는 인산 칼슘 침전물 형성을 보장하기 위해, 우리는 간헐적으로 소용돌이로 교반을 사용합니다. 믹싱을위한 일반적으로 사용되는 또 다른 방법은 파스퇴르 피펫 (12)를 사용하여 기포를 불어 통해서이다. 우리는 특히 형질 전환 혼합물의 작은 볼륨의 일관성 침전물 형성을 산출하기 위해 간헐적으로 소용돌이로 교반을 발견했다.
고려해야 할 다른 변수는 DNA의 품질과 신경의 나이를 포함NS. 우리는 형질이 신경이 DIV2에 도달하면 지속적으로 작업을 시작 것을 발견하지만, 효율이 신경이 DIV10 이상 때 감소하기 시작합니다. 마지막으로, 연결을 문화 자체의 건강은 또 다른 중요한 매개 변수를 나타냅니다. 우리는 공동 배양 시스템의 사용은 건강 차 해마의 문화를 생성하는 가장 좋은 방법으로 찾을 수 있습니다. 신경 세포가 건강하지 않은 경우, 그들은 긴 형질 전환 후 살아남을 수 없습니다. 공 배양 시스템으로, 저밀도 뉴런은 장기 연구를 용이하게 형질 전환, 후 최대 3 주 동안 살아남을 수 있습니다.
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Disclosures
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
이 작품은 NIH 그랜트 NS065183 및 러트 거스 로버트 우드 존슨 의과 대학에서 창업 자금을 지원합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dumont #5 forceps | Fine Science Tools | 11251-20 | |
| Fine scissors | Fine Science Tools | 14090-09 | straight / sharp 8.5 cm |
| Vannas-Tubinger spring scissors | Fine Science Tools | 15008-08 | angled / sharp / 8.5 cm / 5 mm cutting edge |
| Standard pattern forceps | Fine Science Tools | 11000-16 | |
| Student surgical scissors | Fine Science Tools | 91401-14 | blunt / 14.5 cm |
| Spring scissors | Fine Science Tools | 15006-09 | angled to side / 9 cm / 10 mm cutting edge |
| Isoflurane | Webster Veterinary | 14043-225-06 | |
| Poly-L-lysine | Sigma | P2636 | |
| MEM | Sigma | M2279 | |
| 100 mM Sodium pyruvate | Sigma | S8636 | |
| Glucose | Sigma | G8270 | |
| 10x HBSS | Sigma | H4385 | |
| 1 M HEPES, pH 7.3 | Gibco/Invitrogen | 15630-080 | |
| GlutaMAX | Gibco/Invitrogen | 35050-061 | |
| Neurobasal Media | Gibco/Invitrogen | 21130-049 | |
| B27 Supplement (50x) | Gibco/Invitrogen | 17504-044 | |
| N2 Supplement | Gibco/Invitrogen | 17502-048 | |
| Ovalbumin | Sigma | A5503 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco/Invitrogen | 15070-063 | |
| 2.5% Trypsin | Gibco/Invitrogen | 15090-046 | |
| DNase I | Sigma | DN-25 | |
| Cytosine arabinoside | Calbiochem/EMD Millipore | 251010 | |
| Kynurenic acid | Sigma | K3375 |
References
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