Summary
Precipitação com fosfato de cálcio é um método conveniente e económico para a transfecção de células em cultura. Com a otimização, é possível usar esse método em células de difícil transfecção como neurônios primários. Aqui nós descrevemos o nosso protocolo detalhado para a transfecção de fosfato de cálcio dos neurônios do hipocampo co-cultivadas com células gliais.
Abstract
Precipitação com fosfato de cálcio é um método conveniente e económico para a transfecção de células em cultura. Com a otimização, é possível usar esse método em células de difícil transfecção como neurônios primários. Aqui nós descrevemos o nosso protocolo detalhado para a transfecção de fosfato de cálcio dos neurônios do hipocampo co-cultivadas com células gliais.
Introduction
Neurónios primários são um dos tipos de células difíceis de transfectar, como eles são pós-mitótico e são muito sensíveis às alterações de micro-ambientais. Existem quatro tipos vulgarmente utilizados para os métodos de expressão de genes exógenos e RNAs de curto hairpin (shRNAs) nestas células 1. Cada um tem suas próprias vantagens e desvantagens. Por exemplo, a electroporação, são geralmente realizados em neurónios recentemente isolados 2, como as células têm de ser transferidos para cuvetes de transfecção. Infecção pelo vírus geralmente pode alcançar uma eficiência muito alta 3, mas é mais trabalhoso e arriscado para os operadores. Muitos reagentes de transfecção mediada por lipidos são disponíveis comercialmente, com variados graus de sucesso em neurónios e diferentes níveis de citotoxicidade.
Transfecção com fosfato de cálcio representa um método conveniente e económico para a introdução de genes estranhos em neurónios. O método foi usado pela primeira vez para introduzir o DNA do adenovírus em cel mamíferosls por Graham e Van der Eb (1973) 4. A transfecção foi realizada por mistura de cloreto de cálcio com o ADN recombinante, em tampão fosfato. Isto permite a formação de fosfato de DNA / precipitados de cálcio que, quando gradualmente libertado para uma monocamada de células, aderem à superfície da célula, são ocupados por endocitose e, finalmente, entrar no núcleo 5. Este processo conduzirá à expressão de genes estranhos introduzidos na célula alvo. Eficiência típicos de cálcio gama de transfecção de fosfato de entre 0,5-5% 6-8. No entanto, com cuidado e optimização execução consistente do protocolo experimental, é possível atingir uma eficiência de transfecção de quase 50%. Aqui, descrevemos a protocolo detalhado para a transfecção com fosfato de cálcio de neurónios do hipocampo primárias, que são co-cultivadas com células gliais em um formato de sanduíche 9.
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Protocol
1. Preparando Rat Astrocyte Cultura para meios condicionados e Astrocyte neurônio-co-culturas.
- Preparar tampão de dissecção (BSS, ver Tabela 1 para receita) e armazenar a 4 ° C até que esteja pronto para uso.
- Anestesiar filhotes de ratos neonatais (P0-P2) com isoflurano em um copo de 500 ml.
- Quando os filhotes são imóveis, spray com etanol 70% e decapitar.
- Remover o cérebro.
- Segure a cabeça com firmeza com um par de Dumont # 5 fórceps, e usar uma tesoura fina para fazer uma incisão na linha média através da pele e crânio.
- Exponha o cérebro, refletindo o crânio para os lados, e remover o cérebro em um prato contendo frio BSS.
- Separa-se os hemisférios cerebrais do diencéfalo e do tronco cerebral, sob um escopo de dissecação. Retire com cuidado todas as meninges através da estabilização do tecido com um par de fórceps e puxando suavemente as meninges com outro par de fórceps.
- Colete todos os hemisférios in um prato de 60 milímetros. Com uma tesoura pequena, tecido picada finamente quanto possível. Em seguida, transferir o tecido picada para um tubo cônico de 50 ml.
- Adicionar 1,5 ml de 1% de DNase I e 1,5 ml de 2,5% de tripsina e 12 ml de BSS (volume total de 15 ml) para o cérebro. Incubar em um banho de água com agitação durante 15 min a 37 ° C. Para garantir uma boa mistura, o tubo é rodou pela mão a cada 5 min.
- Transfira o sobrenadante através de um filtro de 70 mM celular sobre um novo tubo de 50 ml. Adicionar 3 ml de FBS a este sobrenadante.
- Para as peças restantes, adicione 13,5 ml de BSS e 1,5 ml de 2,5% de tripsina e incubar em banho-maria com agitação durante mais 15 min.
- Transferir o sobrenadante restante através do filtro de células e combinam-se com o sobrenadante do passo 1.8.
- Centrifugar a 1000 rpm durante 5 min para sedimentar as células.
- Ressuspender as peletes em 5 mL de meio gliais. O sobrenadante pode ser centrifugado novamente para sedimentar as restantes células.
- Contagem de células utilizando um hemocitómetro.
- Placa cells a uma densidade de 1 x 10 frasco 7 para 150 cm 2.
- Mude de mídia para mídia gliais frescos do dia após o plaqueamento. Posteriormente, alimentar as células duas vezes por semana com meios glial.
- Quando as células atingiram> 80% de confluência (aproximadamente 10 dias após o plaqueamento), congelar células para baixo em 90% de soro de cavalo e 10% DMSO e manter estoques em nitrogênio líquido. As células são congeladas a 2 x 10 6 por frasco. Aproximadamente 5 frascos podem ser congeladas a partir de cada frasco.
- Cerca de 10-14 dias antes da configuração da cultura do hipocampo, as células gliais são banhados dos estoques congelados. Costumamos chapa cinco placas de 6 poços, o que é suficiente para suportar o crescimento de 90 lamelas de neurônios do hipocampo (três lamelas de 15 milímetros rodada por poço). Também placa um oito a dez 60 milímetros pratos adicionais de células da glia, que é usado para a mídia condicionado N2.1 para transfecção. Um dia antes de cultura neuronal, as células devem ser alimentados com a mídia NB27. Os astrócitos deve ser idealmente> 90% confluentes no thé o ponto. Descobrimos que o congelamento reduz grandemente o número de microglia nas culturas astrogliais. Desde aumentou neurotoxicidade é observado quando microglia está presente nas culturas astrogliais, usamos sempre a cultura astroglial preparados a partir de estoques congelados por co-cultura com os neurônios.
2. Neuronal Cultura
- Lamelas de vidro limpo de primeira lavagem em milliQ 2x água. Eles são, em seguida, embebidas em ácido nítrico concentrado, durante 24 horas, e lavado com água MilliQ para, pelo menos, cinco vezes durante um total de 2 horas. As lamelas são secos e esterilizados por cozimento num forno a 225 ° C durante 6 horas.
- Transferência de lamelas de 60 milímetros pratos após a esterilização. Coloque quatro pontos de parafina estéril perto do bordo exterior de cada lamela para manter neurónios separar a partir de células da glia durante a cocultura.
- Lamelas revestimento com 1 mg / ml de poli-L-lisina em tampão borato 0,1 M durante a noite a 37 ° C em incubadora.
- No dia seguinte, lave lamelas duas vezes em m estérililliQ água por pelo menos 15 min cada. Eles são, então, incubadas durante a noite em meio de plaqueamento em 37 ° C incubadora.
- Eutanásia ratos fêmeas grávidas (E18) pela anestesia isoflurano seguido por pneumotórax, e sacrificá ratos embrionárias por decapitação. Remover os cérebros e dissecar os hemisférios cerebrais, como descrito acima.
- Dissecar o hipocampo do hemisfério cerebral. Coloque todos os hipocampos em um tubo de 15 ml, e digest com 0,25% de tripsina (0,5 ml de 2,5% de tripsina, 4,5 ml de BSS) a 37 ℃ durante 15 min.
- Hipocampos digeridas são lavados em 3x BSS durante 5 minutos cada. Eles são, em seguida, triturado com uma pipeta de Pasteur de vidro, e a densidade de células é determinado por meio de um hemocitómetro. Os neurónios são então semeadas a uma densidade de 2 x 10 5 células por prato de 60 milímetros.
- Sobre 2-4 horas após o plaqueamento, transferência lamelas com os neurônios ligados aos pratos contendo células gliais, com os neurônios virado para baixo em direção à glia. No DIV3, adicionar citosina arabinosido para oAs células a uma concentração final de 5 uM para parar a proliferação de células gliais.
3. A transfecção de cálcio
- Mídia Condição N2.1 em glia um dia antes da transfecção.
- No dia da transfecção, tomar mídia N2.1 condicionado fora da glia e transferir para um novo prato. Transferência de lamelas com os neurônios na mídia N2.1 condicionado. Deixe-se equilibrar na incubadora durante 10-30 min.
- Para um conjunto de tubos esterilizados, combinar 1-4 ug de ADN, 12,5 ul de 2 M de CaCl 2 e H 2 O estéril para um volume total de 100 ul. Para um segundo conjunto de tubos, adicione 100 ml de 2x HBS.
- Adicionar o volume ⅛ de 2x HBS (12,5 ul) de cada vez que o tubo contendo a mistura de CaCl 2 / ADN, vortex durante alguns segundos de cada vez. Deixe os tubos em repouso por 15 min.
- Após 15 minutos de incubação, adicionar a mistura de transfecção gota a gota às células. Incubar por 1-1,5 horas. Uma camada de precipitados areia-como deve ser visívelao microscópio utilizando uma objectiva de 10X.
- Após a incubação, lavar lamelas duas vezes com tampão de lavagem HBS quente.
- Retornar lamelas para pratos originais com glia, adicionar ácido kynurenic para uma concentração final de 0,5 mM.
- Neurônios transfectadas podem ser visualizados ao vivo ou processados para imunocitoquímica, logo no dia seguinte. Neurônios podem sobreviver até três semanas após a transfecção.
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Representative Results
Quando os diferentes parâmetros de transfecção são optimizados e cuidadosamente controlada de experiência para experiência, é possível obter eficiências de transfecção de até 50%. Figura 1 mostra um campo de neurónios que são transfectadas com GFP em DIV4. O campo contém um total de 28 neurónios, entre os quais 16 foram transfectadas. Isto representa um rendimento de mais de 50%. Uma amostragem de outros campos na mesma lamela mostra a eficiência global é de cerca de 50% (dados não mostrados). Com o sistema de co-cultura astroglial, neurónios permanecer saudável e desenvolver-se normalmente, após a transfecção. Figura 2 mostra um neurónio do hipocampo em DIV15, 10 dias após a transfecção com uma construção PSD-95-GFP. O neurônio tem desenvolvido inúmeras espinhas dendríticas em forma de cogumelo maduros, o que indica que os neurônios são saudáveis. A alta eficiência de transfecção e toxicidade mínima deste protocolo faz com que seja uma ferramenta valiosa para o estudo das funções dos genes no hipopótamo primárioneurônios Campal. Finalmente, este protocolo pode, potencialmente, ser adaptado para transfectar culturas de outros tipos de neurónios no cérebro, bem como outros tipos de células difíceis de transfectar.
Figura 1. Neurônios do hipocampo transfectadas com GFP em DIV4, mostrando alta eficiência de transfecção. 16 dos 28 neurônios no campo são positivas. Clique aqui para ver a imagem ampliada .
Figura 2. Neurônio Hippocampal transfectadas com PSD-95-GFP em DIV15, mostrando inúmeras espinhas dendríticas em forma de cogumelo maduros. Clique aqui para ver a imagem ampliada .
Tabela 1. Tampão Receitas / Mídia.
| Reagente | Componentes |
| Glia Mídia | 425 ml MAM 5 ml GlutaMAX 5 ml de piruvato de sódio, 100 mM 15 ml de glicose a 20% FBS 25 ml (final de 5%) 25 ml de soro de bezerro (final de 5%) 5 mL de Penicilina / Estreptomicina |
| 0,1 M tampão borato | 2,48 g de ácido bórico 3,9 g de tetraborato de sódio (bórax) 800 ml de H2O MilliQ pH para 8,5 com NaOH filtro de esterilizar |
| Chapeamento de mídia | 425 ml MAM 5 ml GlutaMAX 5 ml de piruvato de sódio, 100 mM 15 ml de 20% glucose 50 ml de FBS |
| NB27 Mídia | 485 ml Neurobasal Mídia 5 ml GlutaMAX 2 ml suplemento B27 (50x) |
| Dissecção Buffer (BSS) | 50 ml de HBSS 10x 5 mL de HEPES 1 M, pH 7,3 5 mL de Penicilina / Estreptomicina 440 ml de H2O |
| N2.1 Mídia | 425 ml MAM 5 ml GlutaMAX 5 ml de piruvato de sódio, 100 mM 15 ml de glicose a 20% 50 ml de ovalbumina, 1% em MEM 5 ml de suplemento de N2 |
| 2x HEPES Buffered Saline (HBS), estéril | NaCl 274 mM KCl 9,5 mM 15 mM de glicose HEPES 42 mM 1,4 mM de Na 2 HPO 4 Preparar lotes de três diferentes valores de pH (7,05, 7,10, 7,15) |
| Tampão de Lavagem (HEPES Buffered Saline) | 50 ml de HBSS 10x 5 mL de HEPES 1 M, pH 7,3 445 ml de H2O |
| 50 mM ácido kynurenic | Dissolve-se 0,473 g de ácido cinurênico em PBS 1x. Adicionar gotas de NaOH para obtê-lo na solução. Em seguida, use HCl para ajustar o pH de volta para 7.0 |
Tabela 2. Linha do tempo para a preparação da cultura.
| Dia | Ação |
| Antes de iniciar | Prepare cultura de astrócitos e congelar células para baixo. Um lote de cultura de astrócitos podem geralmente suportar vários meses de culturas de hipocampo. |
| Semana 1 Segunda-feira | Descongele astrócitos. |
| Semana 1 Terça-feira | Alimente astrócitos. |
| Semana 1 sexta-feira | Alimente astrócitos. |
| Semana 2 Segunda-feira | Alimente astrócitos. Lavar lamelas em H 2 O, em seguida, mergulhar em ácido nítrico por 24 horas. |
| Semana 2 Terça-feira | Rinse lamelas de 5x. Esterilizar seco lamelas. |
| Semana 2 Quarta-feira | Coloque parafina pontos em lamelas. Casaco lamelas com poli-L-lisina. |
| Semana 2 Quinta-feira | Lavar lamelas revestidas em H2O estéril, e depois incubar, em lamelas plaqueamento media durante a noite a 37 ° C. Mude de mídia em astrócitos para NB27. |
| Semana 2 Sexta-feira | Dissecação do hipocampo e revestimento. |
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Discussion
Existem vários parâmetros-chave que precisam ser cuidadosamente controlado para transfections consistentemente bem sucedidos 10,11. O parâmetro mais crítico para a transfecção de fosfato de cálcio é o valor de 2x HBS, que nas nossas mãos geralmente varia entre 7,10-7,15 pH. Recomendamos fazer três lotes de ações com valores de pH em 0,05 incrementos para explicar a diferença entre os medidores de pH. Alternativamente, o kit de transfecção de mamíferos Clontech fornece 2x HBS que sempre rende uma boa eficiência. Tenha em mente que o pH da solução vai mudar ao longo do tempo, mesmo quando armazenado no congelador. Em geral, manter alíquotas de 2x HBS a 4 ° C, durante até um mês, e à temperatura de -20 ° C durante até um ano.
O segundo parâmetro é o pH do meio de cultura. Para manter este, médio N2.1 consistente são rotineiramente condicionado em culturas astrogliais noite, mas não mais do que 24 horas. Além disso, tentamos usar culturas astrogliais ªa são semelhantes em confluência. O uso de meios condicionados-glia também ajuda a reduzir a toxicidade para os neurônios durante transfecção. Os meios condicionados são equilibradas na incubadora antes de transfecção para manter o pH constante.
O tamanho e densidade dos precipitados de fosfato de cálcio é essencial para a transfecção bem sucedida. Pequenos precipitados levaria a baixa eficiência de transfecção, enquanto as grandes, precipitados aglomerada geralmente levam a citotoxicidade 10. Para assegurar a formação de precipitado de fosfato de cálcio consistente, usamos vórtex intermitente quando a mistura de ADN / CaCI2 e 2x HBS 11. Outro método comumente usado para a mistura é através soprando bolhas de ar utilizando uma pipeta Pasteur 12. Achamos o vórtex intermitente para produzir a formação de precipitado mais consistente, especialmente para pequenos volumes de mistura de transfecção.
Outras variáveis a considerar incluem a qualidade do DNA, ea idade da neurons. Nós achamos que a transfecção começar a trabalhar de forma consistente quando os neurônios alcançar DIV2, no entanto, a eficiência começa a diminuir quando os neurônios estão além DIV10. Finalmente, a saúde dos próprios culturas neuronais representa um outro parâmetro importante. Nós encontramos o uso do sistema de co-cultura para ser a melhor maneira de gerar saudáveis culturas hipocampais primário. Se os neurônios não são saudáveis, eles não vão sobreviver muito tempo depois de transfecção. Com o sistema de co-cultura, os neurônios de baixa densidade pode sobreviver por até 3 semanas após a transfecção, o que facilita os estudos de longo prazo.
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Disclosures
Não há conflitos de interesse declarados.
Acknowledgments
Este trabalho é apoiado pelo NIH conceder NS065183 e fundos de arranque da Faculdade de Medicina Robert Wood Johnson Rutgers.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dumont #5 forceps | Fine Science Tools | 11251-20 | |
| Fine scissors | Fine Science Tools | 14090-09 | straight / sharp 8.5 cm |
| Vannas-Tubinger spring scissors | Fine Science Tools | 15008-08 | angled / sharp / 8.5 cm / 5 mm cutting edge |
| Standard pattern forceps | Fine Science Tools | 11000-16 | |
| Student surgical scissors | Fine Science Tools | 91401-14 | blunt / 14.5 cm |
| Spring scissors | Fine Science Tools | 15006-09 | angled to side / 9 cm / 10 mm cutting edge |
| Isoflurane | Webster Veterinary | 14043-225-06 | |
| Poly-L-lysine | Sigma | P2636 | |
| MEM | Sigma | M2279 | |
| 100 mM Sodium pyruvate | Sigma | S8636 | |
| Glucose | Sigma | G8270 | |
| 10x HBSS | Sigma | H4385 | |
| 1 M HEPES, pH 7.3 | Gibco/Invitrogen | 15630-080 | |
| GlutaMAX | Gibco/Invitrogen | 35050-061 | |
| Neurobasal Media | Gibco/Invitrogen | 21130-049 | |
| B27 Supplement (50x) | Gibco/Invitrogen | 17504-044 | |
| N2 Supplement | Gibco/Invitrogen | 17502-048 | |
| Ovalbumin | Sigma | A5503 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco/Invitrogen | 15070-063 | |
| 2.5% Trypsin | Gibco/Invitrogen | 15090-046 | |
| DNase I | Sigma | DN-25 | |
| Cytosine arabinoside | Calbiochem/EMD Millipore | 251010 | |
| Kynurenic acid | Sigma | K3375 |
References
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