Summary
Precipitazione di fosfato di calcio è un metodo conveniente ed economico per la trasfezione di cellule in coltura. Con ottimizzazione, è possibile usare questo metodo su cellule di difficile trasfezione come neuroni primari. Qui descriviamo il nostro protocollo dettagliato per fosfato di calcio trasfezione di neuroni dell'ippocampo co-coltivate con le cellule astrogliali.
Abstract
Precipitazione di fosfato di calcio è un metodo conveniente ed economico per la trasfezione di cellule in coltura. Con ottimizzazione, è possibile usare questo metodo su cellule di difficile trasfezione come neuroni primari. Qui descriviamo il nostro protocollo dettagliato per fosfato di calcio trasfezione di neuroni dell'ippocampo co-coltivate con le cellule astrogliali.
Introduction
Neuroni primari sono uno dei tipi di cellule più difficili da trasfettare come sono postmitotico e sono molto sensibili alle variazioni microambientali. Ci sono quattro tipi comunemente usati di metodi per l'espressione di geni esogeni e RNA breve tornante (shRNAs) in queste cellule 1. Ognuno ha i suoi vantaggi e svantaggi. Ad esempio, elettroporazione viene di solito effettuata su neuroni appena isolate 2, come le cellule devono essere trasferiti in cuvette per trasfezione. Infezione da virus di solito può raggiungere un grado elevato di efficienza 3, ma è sempre rischiosa per gli operatori-intensità di lavoro. Molti reagenti di transfezione lipidi mediata sono disponibili in commercio, con vari gradi di successo nei neuroni e diversi livelli di citotossicità.
Fosfato di calcio trasfezione rappresenta un metodo conveniente ed economico per l'introduzione di geni estranei in neuroni. Il metodo è stato usato per la prima a introdurre adenovirus DNA in cel mammiferiLS di Graham e Van Der Eb (1973) 4. La trasfezione è stata eseguita miscelando cloruro di calcio con il DNA ricombinante in un tampone fosfato. Questo permette la formazione di fosfato di DNA / calcio precipitati che, quando gradualmente lasciato cadere su un monostrato di cellule, aderire alla superficie cellulare, sono assorbite per endocitosi e finalmente entrare nel nucleo 5. Questo processo porterebbe alla espressione di geni estranei introdotti nella cellula bersaglio. Tipiche efficienze di fosfato di calcio serie trasfezione tra il 0.5-5% 6-8. Tuttavia, con un'attenta ottimizzazione e coerente attuazione del protocollo sperimentale, è possibile raggiungere una efficienza di trasfezione di quasi il 50%. Qui descriviamo il nostro protocollo dettagliato per fosfato di calcio trasfezione di neuroni primari, che sono co-coltivate con le cellule astrogliali in un formato panino 9.
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Protocol
1. Preparazione Rat astrociti Cultura per Media condizionata e astrociti-neuroni co-colture.
- Preparare buffer di dissezione (BSS, vedi Tabella 1 per ricetta) e conservare a 4 ° C fino al momento dell'uso.
- Anestetizzare cuccioli di ratto neonatale (P0-P2) con isoflurano in un bicchiere da 500 ml.
- Quando cuccioli sono immobili, spruzzare con il 70% di etanolo e decapitare.
- Rimuovere il cervello.
- Tenere la testa saldamente con un paio di Dumont # 5 pinze e usare le forbici pregiati per fare un'incisione mediana attraverso la pelle e il cranio.
- Esporre il cervello, riflettendo il cranio ai lati, e rimuovere il cervello in un piatto contenente freddo BSS.
- Separare gli emisferi cerebrali dal diencefalo e il tronco cerebrale in un ambito di dissezione. Rimuovere con cura tutte le meningi stabilizzando il tessuto con un paio di pinze e tirando delicatamente le meningi con un altro paio di pinze.
- Raccogliere tutti i emisferin un 60 millimetri piatto. Utilizzando piccole forbici, tessuti trita più finemente possibile. Poi trasferire il tessuto tritato in una provetta conica da 50 ml.
- Aggiungere 1,5 ml di 1% DNasi I e 1,5 ml di 2,5% tripsina e 12 ml di BSS (volume totale di 15 ml) al cervello. Incubare in un bagno d'acqua per 15 minuti a 37 ° C. Per garantire una buona miscelazione, il tubo viene agitato a mano ogni 5 min.
- Trasferire il surnatante attraverso un filtro 70 micron cella su un nuovo tubo conico da 50 ml. Aggiungere 3 ml FBS a questo surnatante.
- Per i pezzi rimanenti, aggiungere 13,5 ml di BSS e 1,5 ml 2,5% tripsina e incubare nel bagnomaria agitazione per altri 15 min.
- Trasferire il supernatante residuo attraverso il filtro cella e si combinano con il supernatante dal passo 1,8.
- Centrifugare a 1000 rpm per 5 minuti per far sedimentare le cellule.
- Risospendere pellet in 5 ml di media gliali. Surnatante può essere nuovamente centrifugato per far sedimentare le cellule rimanenti.
- Contare le cellule utilizzando un emocitometro.
- Piatto cells ad una densità di 1 x 10 7 ogni 150 cm 2 matraccio.
- Cambiare media per mezzi freschi gliali il giorno dopo la placcatura. Successivamente, mangimi cellule due volte alla settimana con i media gliale.
- Quando le cellule hanno raggiunto> 80% di confluenza (circa 10 giorni dopo placcatura), congelare le cellule dal siero di cavallo 90% e 10% DMSO e mantenere scorte in azoto liquido. Le cellule sono congelati a 2 x 10 6 per flaconcino. Circa 5 fiale possono essere congelati da ciascun flacone.
- Circa 10-14 giorni prima di impostare la cultura dell'ippocampo, cellule gliali sono placcati dalle scorte congelate. Noi di solito piatto di cinque piastre da 6 pozzetti, il che è sufficiente a sostenere la crescita di 90 vetrini di neuroni dell'ippocampo (tre coprioggetto 15 millimetri rotondi per pozzetto). Abbiamo anche piastra ulteriori otto a dieci 60 millimetri piatti a base di cellule gliali, che viene utilizzato per i media condizionata N2.1 per la trasfezione. Il giorno prima colture neuronali, cellule dovrebbe essere alimentato con i media NB27. Gli astrociti dovrebbero idealmente essere> 90% confluenti al secoloè il punto. Troviamo che il congelamento riduce notevolmente il numero di microglia nelle culture astrogliali. Dal momento che una maggiore neurotossicità si osserva quando la microglia è presente nelle culture astrogliali, usiamo sempre la cultura astrogliale preparato da scorte congelate per co-coltura con i neuroni.
2. Cultura neuronale
- Pulire i vetrini per primo risciacquo in acqua MilliQ 2x. Essi vengono quindi immersi in acido nitrico concentrato per 24 ore, e risciacquati con acqua milliQ per almeno cinque volte per un totale di 2 ore. Coprioggetto vengono essiccati e sterilizzati mediante cottura in un forno a 225 ° C per 6 ore.
- Trasferimento coprioggetto di 60 millimetri piatti dopo la sterilizzazione. Posizionare quattro punti di paraffina sterile vicino al bordo esterno di ogni coprioggetto per mantenere separati i neuroni da cellule gliali durante co-coltura.
- Coprioggetto cappotto con 1 mg / ml di poli-L-lisina in 0.1 M tampone borato pernottamento a 37 ° C incubatore.
- Il giorno dopo, lavare vetrini due volte in m sterileilliQ acqua per almeno 15 minuti ciascuno. Essi vengono poi incubate durante la notte nei media placcatura in 37 ° C incubatore.
- Euthanize ratto gravide (E18) da anestesia isoflurano seguita da pneumotorace, e eutanasia topi embrionali per decapitazione. Rimuovere il cervello e sezionare i emisferi cerebrali come descritto sopra.
- Sezionare il ippocampi dall'emisfero cerebrale. Mettere tutti ippocampi in una provetta conica da 15 ml, e digerire con tripsina 0,25% (0,5 ml 2,5% tripsina, 4,5 ml BSS) a 37 ℃ per 15 min.
- Ippocampi digeriti vengono risciacquati in BSS 3x per 5 minuti ciascuno. Vengono poi triturato con una pipetta Pasteur di vetro, e la densità cellulare è determinato utilizzando un emocitometro. I neuroni sono poi seminate ad una densità di 2 x 10 5 cellule ogni 60 mm senza coperchio.
- Circa 2-4 ore dopo la placcatura, il trasferimento coprioggetto con i neuroni collegati ai piatti contenenti cellule astrogliali, con i neuroni rivolto verso la glia. A DIV3, aggiungere citosina arabinoside alcellule ad una concentrazione finale di 5 mM per fermare glia proliferazione.
3. Calcio Transfezione
- Supporti Condizione N2.1 sulla glia il giorno prima trasfezione.
- Il giorno della trasfezione, adottare mezzi N2.1 condizionata fuori della glia e trasferire in un nuovo piatto. Trasferimento coprioggetto con i neuroni nel supporto N2.1 condizionato. Lasciare equilibrare in incubatrice per 10-30 min.
- Per una serie di provette sterili, combinare 1-4 mg di DNA, 12,5 ml di 2 M CaCl 2 e H 2 O sterile per un volume totale di 100 microlitri. Per un secondo gruppo di tubi, aggiungere 100 ml di 2x HBS.
- Aggiungere ⅛ volume di 2x HBS (12,5 mL) alla volta alla provetta contenente la miscela CaCl 2 / DNA, vortex per pochi secondi ogni volta. Lasciare le provette a sedere per 15 min.
- Dopo 15 minuti di incubazione, aggiungere goccia a goccia la miscela di trasfezione per le cellule. Incubare per 1-1,5 ore. Uno strato di precipitati sabbia come dovrebbe essere visibilesotto il microscopio usando un obiettivo 10X.
- Dopo l'incubazione, lavare vetrini due volte con caldo tampone di lavaggio HBS.
- Coprioggetti Ritorno a piatti originali con glia, aggiungere acido kynurenic ad una concentrazione finale di 0,5 mm.
- Neuroni trasfettati possono essere esposte in diretta o trattati per immunocitochimica già a partire dal giorno successivo. I neuroni possono sopravvivere fino a tre settimane dopo la trasfezione.
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Representative Results
Quando i diversi parametri della trasfezione sono ottimizzati e accuratamente controllati da esperimento per sperimentare, è possibile avere efficienze di trasfezione fino al 50%. Figura 1 mostra un campo di neuroni che sono trasfettate con GFP su DIV4. Il campo contiene un totale di 28 neuroni, tra cui 16 sono state trasfettate. Ciò rappresenta un rendimento di oltre il 50%. Un campione di altri campi sullo stesso vetrino mostra l'efficienza complessiva è di circa il 50% (dati non mostrati). Con il sistema di co-coltura astrogliale, neuroni rimangono sani e sviluppano normalmente dopo trasfezione. Figura 2 mostra un neurone dell'ippocampo a DIV15, 10 giorni dopo la transfezione con un costrutto PSD-95-GFP. Il neurone ha sviluppato numerose spine dendritiche mature a forma di fungo, che indica i neuroni sono sani. L'alta efficienza di trasfezione e la minima tossicità di questo protocollo lo rende uno strumento prezioso per studiare le funzioni del gene in hippo primarianeuroni Campal. Infine, questo protocollo può potenzialmente essere adattato per trasfettare culture di altri tipi di neuroni nel cervello, così come altri tipi di cellule di difficile trasfezione.
Figura 1. Neuroni dell'ippocampo trasfettate con GFP a DIV4, mostrando ad alta efficienza di trasfezione. 16 su 28 neuroni nel settore sono positivi. Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita .
Figura 2. Neurone dell'ippocampo trasfettate con PSD-95-GFP a DIV15, mostrando numerose spine dendritiche mature a forma di fungo. Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita .
Tabella 1. Buffer / Media Ricette.
| Reagente | Componenti |
| Glial media | 425 ml di MEM 5 ml GlutaMAX 5 ml di sodio piruvato, 100 mM 15 ml 20% glucosio 25 ml FBS (finale 5%) Siero 25 ml di vitello (finale 5%) 5 ml penicillina / streptomicina |
| 0.1M borato Buffer | 2.48 g di acido borico 3.9 g di tetraborato di sodio (borace) 800 ml milliQ H2O pH con NaOH a 8,5 filtro sterilizzare |
| Placcatura media | 425 ml di MEM 5 ml GlutaMAX 5 ml di sodio piruvato, 100 mM 15 ml 20% glucose 50 ml FBS |
| NB27 media | 485 ml Neurobasal media 5 ml GlutaMAX 2 Supplemento ml B27 (50x) |
| Dissection Buffer (BSS) | 50 ml 10x HBSS 5 ml 1 M HEPES, pH 7.3 5 ml penicillina / streptomicina 440 ml H 2 O |
| N2.1 media | 425 ml di MEM 5 ml GlutaMAX 5 ml di sodio piruvato, 100 mM 15 ml 20% glucosio 50 ml ovoalbumina, 1% in MEM 5 ml integratore N2 |
| 2x HEPES Buffered Saline (HBS), sterile | 274 mM NaCl 9.5 mM KCl 15 mM glucosio 42 mM HEPES 1.4 mM Na 2 HPO 4 Preparare lotti di 3 diversi pH (7.05, 7.10, 7.15) |
| Tampone di lavaggio (HEPES Buffered Saline) | 50 ml 10x HBSS 5 ml 1 M HEPES, pH 7.3 445 ml H 2 O |
| 50 mM Kynurenic acido | Sciogliere 0,473 g di acido kynurenic in 1x PBS. Aggiungere gocce di NaOH per arrivare in soluzione. Quindi utilizzare HCl per aggiustare il pH torna a 7,0 |
Tabella 2. Linea di tempo per la preparazione culturale.
| Giorno | Azione |
| Prima di iniziare | Preparare la cultura astrociti e congelare cellule giù. Una partita di cultura astrociti di solito può supportare diversi mesi di culture dell'ippocampo. |
| Settimana 1 Lunedi | Scongelare astrociti. |
| Settimana 1 Martedì | Concime astrociti. |
| Settimana 1 Venerdì | Concime astrociti. |
| Settimana 2 Lunedi | Concime astrociti. Sciacquare coprioggetto in H 2 O, poi immergere in acido nitrico per 24 ore. |
| Settimana 2 Martedì | Rinse coprioggetto 5x. Dry sterilizzare lamelle. |
| Settimana 2 Mercoledì | Mettere i puntini di paraffina su vetrini. Coat coprioggetto con poli-L-lisina. |
| Settimana 2 Giovedi | Sciacquare coprioggetto rivestiti in H2O sterile, poi incubare vetrini in placcatura dei media durante la notte a 37 ° C. Cambiare media su astrociti a NB27. |
| Settimana 2 Venerdì | Dissezione ippocampale e placcatura. |
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Discussion
Ci sono diversi parametri chiave che devono essere attentamente controllata per trasfezioni costantemente successo 10,11. Il parametro più critico per il fosfato di calcio trasfezione è il valore di pH 2x HBS, che nelle nostre mani solito varia tra 7,10-7,15. Si consiglia di fare tre lotti di titoli con valori di pH in 0.05 incrementi per spiegare la differenza tra pH-metri. In alternativa, il kit di transfezione mammiferi Clontech fornisce 2x HBS che produce costantemente buona efficienza. Tenere presente che il pH della soluzione cambia nel tempo, anche se conservato in freezer. In genere teniamo aliquote di 2x HBS a 4 ° C per un massimo di un mese e a -20 ° C per un massimo di un anno.
Il secondo parametro è il pH del terreno di coltura. Per mantenere questo, mezzo N2.1 coerente sono regolarmente condizione culture astrogliali durante la notte ma non superiore a 24 ore. Inoltre, cerchiamo di usare culture astrogliali °a sono simili a confluenza. L'uso di media-glia condizionata aiuta anche a ridurre la tossicità ai neuroni durante la trasfezione. Mezzi condizionati sono equilibrati in incubatrice prima della transfezione per mantenere il pH costante.
La dimensione e la densità dei precipitati di fosfato di calcio è la chiave per trasfezione di successo. Piccoli precipitati porterebbe a bassa efficienza di trasfezione, mentre le grandi, precipitati clumpy di solito portano a citotossicità 10. Per garantire la formazione coerente fosfato di calcio precipitato, usiamo vortex intermittente durante la miscelazione del DNA / CaCl 2 e 2x HBS 11. Un altro metodo comunemente utilizzato per la miscelazione tramite soffiando bolle d'aria con una pipetta Pasteur 12. Abbiamo trovato il vortex intermittente per produrre la formazione di precipitati più coerente, soprattutto per i piccoli volumi di miscela di trasfezione.
Altre variabili da considerare sono la qualità del DNA, e l'età della neurons. Troviamo che la trasfezione iniziare a lavorare costantemente quando i neuroni raggiungono DIV2, tuttavia, l'efficienza comincia a diminuire quando i neuroni sono al di là DIV10. Infine, la salute delle colture neuronali stessi rappresenta un altro importante parametro. Troviamo l'utilizzo del sistema di co-coltura di essere il modo migliore per generare colture ippocampali primario sani. Se i neuroni non sono sani, essi non sopravvivono a lungo dopo trasfezione. Con il sistema di co-coltura, neuroni bassa densità possono sopravvivere per 3 settimane dopo la trasfezione, che facilita studi a lungo termine.
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Disclosures
Nessun conflitto di interesse dichiarati.
Acknowledgments
Questo lavoro è supportato dal NIH concedere NS065183 e fondi di start-up della Facoltà di Medicina di Rutgers Robert Wood Johnson.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dumont #5 forceps | Fine Science Tools | 11251-20 | |
| Fine scissors | Fine Science Tools | 14090-09 | straight / sharp 8.5 cm |
| Vannas-Tubinger spring scissors | Fine Science Tools | 15008-08 | angled / sharp / 8.5 cm / 5 mm cutting edge |
| Standard pattern forceps | Fine Science Tools | 11000-16 | |
| Student surgical scissors | Fine Science Tools | 91401-14 | blunt / 14.5 cm |
| Spring scissors | Fine Science Tools | 15006-09 | angled to side / 9 cm / 10 mm cutting edge |
| Isoflurane | Webster Veterinary | 14043-225-06 | |
| Poly-L-lysine | Sigma | P2636 | |
| MEM | Sigma | M2279 | |
| 100 mM Sodium pyruvate | Sigma | S8636 | |
| Glucose | Sigma | G8270 | |
| 10x HBSS | Sigma | H4385 | |
| 1 M HEPES, pH 7.3 | Gibco/Invitrogen | 15630-080 | |
| GlutaMAX | Gibco/Invitrogen | 35050-061 | |
| Neurobasal Media | Gibco/Invitrogen | 21130-049 | |
| B27 Supplement (50x) | Gibco/Invitrogen | 17504-044 | |
| N2 Supplement | Gibco/Invitrogen | 17502-048 | |
| Ovalbumin | Sigma | A5503 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco/Invitrogen | 15070-063 | |
| 2.5% Trypsin | Gibco/Invitrogen | 15090-046 | |
| DNase I | Sigma | DN-25 | |
| Cytosine arabinoside | Calbiochem/EMD Millipore | 251010 | |
| Kynurenic acid | Sigma | K3375 |
References
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