Summary
Calciumphosphat-Präzipitation ist eine bequeme und kostengünstige Methode zur Transfektion von kultivierten Zellen. Mit Optimierung ist es möglich, dieses Verfahren auf Fest transfizierbaren Zellen wie primäre Neuronen verwendet werden. Hier beschreiben wir unsere detaillierten Protokoll für die Calciumphosphat-Transfektion von Neuronen im Hippocampus mit Astroglia-Zellen kokultiviert.
Abstract
Calciumphosphat-Präzipitation ist eine bequeme und kostengünstige Methode zur Transfektion von kultivierten Zellen. Mit Optimierung ist es möglich, dieses Verfahren auf Fest transfizierbaren Zellen wie primäre Neuronen verwendet werden. Hier beschreiben wir unsere detaillierten Protokoll für die Calciumphosphat-Transfektion von Neuronen im Hippocampus mit Astroglia-Zellen kokultiviert.
Introduction
Primären Neuronen eine der schwierigsten Zelltypen zu transfizieren, wie sie sind postmitotischen und sind sehr empfindlich gegenüber Mikroumweltveränderungen. Es gibt vier häufigsten verwendeten Arten von Verfahren zur Expression von exogenen Genen und Kurzhaarnadel-RNAs (shRNAs) in diesen Zellen ein. Jeder hat seine eigenen Vorteile und Nachteile. Zum Beispiel wird in der Regel auf Elektroporation frisch isolierten Neuronen 2 durchgeführt, wie Zellen müssen in Küvetten für die Transfektion übertragen werden. Virus-Infektion kann in der Regel sehr hohen Wirkungsgrad erreichen, 3, ist aber arbeitsintensiv und riskant für die Betreiber. Viele Lipid-vermittelte Transfektion Reagenzien sind kommerziell erhältlich, mit unterschiedlichem Erfolg in Neuronen und verschiedene Ebenen der Zytotoxizität.
Calciumphosphat-Transfektion eine bequeme und kostengünstige Methode zur Einführung von Fremdgenen in Neuronen. Die Methode wurde zuerst verwendet, um Adenovirus-DNA in Säuger cel vorstellenls von Graham und van der Eb (1973) 4. Transfektion wurde durch Mischen von Calciumchlorid, die mit rekombinanten DNA in einem Phosphatpuffer durchgeführt. Dies ermöglicht die Bildung von DNA / Calciumphosphat-Präzipitate, die, wenn nach und nach auf eine Monoschicht von Zellen gesunken, sich an die Zelloberfläche werden durch Endozytose aufgenommen und schließlich in den Kern 5. Dieses Verfahren würde die Expression von Fremdgenen eingeführt in der Zielzelle führen. Typische Wirkungsgrade von Calciumphosphat-Transfektion Bereich zwischen 0,5-5% 6-8. Bei sorgfältiger Optimierung und konsistente Ausführung des experimentellen Protokolls ist es jedoch möglich, eine Transfektionseffizienz von nahezu 50% erreichen. Hier beschreiben wir unsere detaillierten Protokoll für die Calciumphosphat-Transfektion von primären Hippocampus-Neuronen, die mit Astroglia-Zellen in einem Sandwich-Format 9 kokultiviert werden.
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Protocol
1. Vorbereiten Rat Astrocyte Kultur für konditionierte Medien und Astrocyte-Neuron-Kokulturen.
- Bereiten Dissektion Puffer (BSS, siehe Tabelle 1 für Rezept) und bei 4 ° C bis zur Verwendung.
- Anesthetize neonatalen Rattenjungen (P0-P2) mit Isofluran in einem 500 ml-Becherglas.
- Bei Jungtieren sind unbeweglich, Spray mit 70% Ethanol und enthaupten.
- Entfernen Sie das Gehirn.
- Halten Sie den Kopf fest mit einem Paar von Dumont Nr. 5 Pinzette und einer feinen Schere verwenden, um einen Mittelschnitt durch die Haut und Schädel zu machen.
- Expose das Gehirn durch die Reflexion der Schädel an den Seiten, und entfernen Sie das Gehirn in eine Schale mit kaltem BSS.
- Trennen Sie die Gehirnhälften aus dem Zwischenhirn und Hirnstamm unter einem Binokular. Entfernen Sie vorsichtig alle Hirnhäute durch die Stabilisierung des Gewebes mit einer Pinzette und sanft zog sich die Hirnhaut mit einer anderen Pinzette.
- Sammeln Sie alle Hemisphären in einem 60 mm-Schale. Mit einer kleinen Schere, zerkleinern Gewebe so fein wie möglich. Übertragen Sie anschließend die zerkleinerten Gewebes auf eine 50 ml konischen Röhrchen.
- 1,5 ml von 1% DNase und 1,5 ml 2,5% Trypsin und 12 ml BSS (Gesamtvolumen 15 ml) zu Gehirnen. Inkubieren in einem Schüttelwasserbad für 15 min bei 37 ° C. Um eine gute Durchmischung zu gewährleisten, ist das Rohr von Hand alle 5 min verwirbelt.
- Überstand durch eine 70 um Zellsieb über ein neues 50 ml konischen Röhrchen. 3 ml FBS zu dieser Überstand.
- Auf die verbleibenden Teile, addieren 13,5 ml BSS und 1,5 ml 2,5% Trypsin und Inkubation im Schüttelwasserbad für weitere 15 min.
- Die restliche Überstand durch die Zelle Sieb und verbinden sich mit dem Überstand aus Schritt 1.8.
- Zentrifugieren bei 1000 UpM für 5 min, um die Zellen zu pelletieren.
- Resuspendieren Pellets in 5 ml Gliazellen Medien. Der Überstand kann wieder zentrifugiert werden, um die restlichen Zellen zu pelletieren.
- Zählen von Zellen mit einer Zählkammer.
- Teller cells in einer Dichte von 1 x 10 7 pro 150 cm 2-Kolben.
- Ändern Sie Medien an die frische Gliazellen Medien am Tag nach der Beschichtung. Danach ernähren Zellen zweimal eine Woche mit Glia-Medien.
- Wenn Zellen> 80% Konfluenz (ca. 10 Tage nach der Beschichtung) erreicht, Gefrierzellen in 90% Pferdeserum und 10% DMSO und halten Aktien in flüssigem Stickstoff. Die Zellen werden mit 2 x 10 6 pro Fläschchen eingefroren. Etwa 5 Fläschchen können aus jedem Kolben eingefroren werden.
- Über 10-14 Tage vor der Einrichtung des Hippocampus-Kultur werden Gliazellen aus den gefrorenen Aktien plattiert. Wir Platte in der Regel fünf 6-Well-Platten, das ist genug, um das Wachstum von 90 Deckgläser von Hippocampus-Neuronen (drei 15 mm runden Deckgläsern pro Well) zu unterstützen. Wir Platte auch eine zusätzliche acht bis zehn 60-mm-Schalen von Gliazellen, die für Anlage N2.1 Medien für die Transfektion verwendet wird. Am Tag vor der neuronalen Kultur, sollten die Zellen mit NB27 Medien zugeführt werden. Die Astrozyten sollte idealerweise> 90% konfluent sein thist der Punkt. Wir finden, dass das Einfrieren stark verringert die Anzahl der Mikrogliazellen in der Astroglia-Kulturen. Da erhöhte Neurotoxizität beobachtet wird, wenn in den Mikroglia Astroglia Kulturen vorhanden ist, verwenden wir immer Astroglia-Kultur aus gefrorenen Beständen, für Co-Kultur mit den Neuronen hergestellt.
2. Neuronale Kultur
- Saubere Glas-Deckgläser von ersten Spülen in Milli-Q-Wasser 2x. Sie werden dann in konzentrierte Salpetersäure für 24 Stunden mindestens fünfmal insgesamt 2 h eingeweicht und mit Milli-Q-Wasser gespült. Die Deckgläser werden durch Backen in einem Ofen bei 225 ° C für 6 Stunden getrocknet und sterilisiert.
- Überdeckgläser bis 60 mm Schalen nach der Sterilisation. Platzieren vier Punkte sterilem Paraffin nahe der Außenkante jedes Deckglas zu halten Neuronen Gliazellen trennen während Kokultur.
- Deckmantel mit 1 mg / ml Poly-L-Lysin in 0,1 M Borat-Puffer über Nacht bei 37 ° C Inkubator.
- Am nächsten Tag, spülen Deckgläser zweimal in sterilem milliQ Wasser für jeweils mindestens 15 min. Sie werden dann über Nacht in Plattenmedien in 37 ° C-Inkubator inkubiert.
- Euthanize schwangere Ratte (E18) von Isofluran-Narkose, gefolgt von Pneumothorax und einschläfern embryonalen Ratten durch Enthauptung. Gehirn entfernen und zerlegen sich die Hirnhälften wie oben beschrieben.
- Präparieren Sie die hippocampi von der Großhirnhemisphäre. Zeigen alle Hippocampus in eine 15 ml konischen Röhrchen und Verdau mit 0,25% Trypsin (0,5 ml 2,5% Trypsin, 4,5 ml BSS) bei 37 ℃ für 15 min.
- Aufgeschlossene hippocampi in BSS 3x für jeweils 5 Minuten gespült. Sie werden dann mit einer Glaspasteurpipette zerrieben, und die Zelldichte wird unter Verwendung einer Zählkammer bestimmt. Neuronen werden dann in einer Dichte von 2 x 10 5 Zellen pro 60 mm-Schale ausgesät.
- Etwa 2-4 Stunden nach der Beschichtung, Transferdeckgläser mit ange Neuronen zu den Schalen, die Astroglia-Zellen mit Nervenzellen in Richtung der Glia nach unten. Bei DIV3, fügen Cytosinarabinosid dieZellen in einer Endkonzentration von 5 &mgr; M bis Glia-Proliferation zu stoppen.
3. Calcium Transfektion
- Zustand N2.1 Medien auf Glia der Tag vor der Transfektion.
- Am Tag der Transfektion nehmen Anlage N2.1 Medien aus der Glia und übertragen in eine neue Schüssel. Überdeckgläser mit den Neuronen in der konditionierten Medien N2.1. Lassen Sie ins Gleichgewicht im Inkubator für 10-30 min.
- Einem Satz von sterilen Röhrchen verbinden 1-4 ug DNA, 12,5 &mgr; l 2 M CaCl 2 und sterilem H 2 O für ein Gesamtvolumen von 100 ul. Einem zweiten Satz von Rohren, mit 100 ul 2x HBS.
- Hinzufügen ⅛ Volumen 2 × HBS (12,5 ul) zu einem Zeitpunkt zu dem Röhrchen mit dem CaCl 2 / DNA-Mischung, Vortexen für ein paar Sekunden jedesmal. Ermöglichen, dass die Rohre für 15 min stehen.
- Nach 15 min Inkubation, fügen Sie die Transfektion Mischung tropfenweise zu den Zellen. Inkubieren 1-1,5 Stunden. Eine Schicht aus einem sandartigen Ausfällungen sichtbar sein sollunter dem Mikroskop mit einem 10X-Objektiv.
- Nach Inkubation spülen Deckgläser zweimal mit warmem HBS Waschpuffer.
- Zurück zur ursprünglichen Deckschalen mit Glia, fügen Kynurensäure zu einer endgültigen Konzentration von 0,5 mM.
- Transfizierten Neuronen können live abgebildet oder Immunzytochemie schon am nächsten Tag verarbeitet werden. Neuronen können bis zu drei Wochen nach der Transfektion überleben.
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Representative Results
Wenn die verschiedenen Parameter der Transfektion optimiert und sorgfältig von Experiment zu Experiment gesteuert, ist es möglich, Transfektionseffizienzen von bis zu 50% zu erhalten. Fig. 1 zeigt ein Feld von Neuronen, die mit GFP auf DIV4 transfiziert sind. Das Feld enthält insgesamt 28 Neuronen, von denen 16 wurden transfiziert. Dies entspricht einem Wirkungsgrad von über 50%. Eine Probenahme von anderen Bereichen auf dem gleichen Deck zeigt den Gesamtwirkungsgrad liegt bei 50% (Daten nicht gezeigt). Mit der Astroglia Kokultursystem bleiben Neuronen gesund und normal entwickeln nach der Transfektion. Fig. 2 zeigt eine Hippocampus bei DIV15, 10 Tage nach der Transfektion mit einer PSD-95-GFP-Konstrukt. Das Neuron hat zahlreiche reife pilzförmigen dendritischen Dornen entwickelt, die zeigt, die Neuronen sind gesund. Die hohe Transfektionseffizienz und minimale Toxizität dieses Protokolls macht es zu einem wertvollen Werkzeug für die Untersuchung von Genfunktionen in der Grund NilpferdCampal Neuronen. Schließlich kann dieses Protokoll potentiell geeignet Kulturen anderer Typen von Neuronen im Gehirn, als auch andere schwer zu transfizierenden Zelltypen zu transfizieren.
Abbildung 1. Hippocampus-Neuronen mit GFP transfiziert bei DIV4, welche 16 von 28 Neuronen im Feld hohe Transfektionseffizienz. Sind positiv. Klicken Sie hier für eine größere Ansicht .
2. Hippocampus-Neuronen mit PSD-transfizierten-95-GFP auf DIV15, zeigt zahlreiche reife pilzförmigen dendritischen Dornen. Klicken Sie hier für eine größere Ansicht .
Tabelle 1. Buffer / Medien Rezepte.
| Reagens | Komponenten |
| Gliazellen Medien | 425 ml MEM 5 ml Glutamax 5 ml Natriumpyruvat, 100 mM 15 ml 20% Glucose 25 ml FBS (5% final) 25 ml Kälberserum (Endkonzentration von 5%) 5 ml Penicillin / Streptomycin |
| 0,1 M Boratpuffer | 2,48 g Borsäure 3,9 g Natriumtetra (Borax) 800 ml Milli-Q H2O pH mit NaOH auf 8,5 filtersterilisieren |
| Plating Medien | 425 ml MEM 5 ml Glutamax 5 ml Natriumpyruvat, 100 mM 15 ml 20% glucose 50 ml FBS |
| NB27 Medien | 485 ml Neurobasal Medien 5 ml Glutamax 2 ml B27 Ergänzung (50x) |
| Dissection Buffer (BSS) | 50 ml 10x HBSS 5 ml 1 M HEPES, pH 7,3, 5 ml Penicillin / Streptomycin 440 ml H 2 O |
| N2.1 Medien | 425 ml MEM 5 ml Glutamax 5 ml Natriumpyruvat, 100 mM 15 ml 20% Glucose 50 ml Ovalbumin, 1% MEM 5 ml N2 Ergänzung |
| 2x HEPES gepufferte Kochsalzlösung (HBS), steril | 274 mM NaCl 9,5 mM KCl 15 mM Glukose 42 mM HEPES 1,4 mM Na 2 HPO 4 Bereiten Chargen von 3 verschiedenen pH-Wert (7.05, 7.10, 7.15) |
| Waschpuffer (HEPES gepufferte Kochsalzlösung) | 50 ml 10x HBSS 5 ml 1 M HEPES, pH 7,3, 445 ml H 2 O |
| 50 mM Kynurensäure | Lösen 0,473 g Kynurensäure in 1x PBS. In Tropfen NaOH, um sie in Lösung zu erhalten. Dann nutzen HCl auf pH-Wert wieder auf 7,0 einzustellen |
Tabelle 2. Zeitlinie für Kultur Vorbereitung.
| Tag | Aktion |
| Vor dem Start | Bereiten Astrozyten Kultur und einfrieren Zellen nach unten. Eine Charge von Astrozyten-Kultur kann in der Regel mehrere Monate unterstützt von Hippocampus-Kulturen. |
| Woche 1 Montag | Auftauen Astrozyten. |
| Woche 1 Dienstag | Astrozyten-Feed. |
| Woche 1 Freitag | Astrozyten-Feed. |
| Woche 2 Montag | Astrozyten-Feed. Spülen Deckgläser in H 2 O, dann in Salpetersäure einweichen für 24 Stunden. |
| Woche 2 Dienstag | Rinse Deckgläser 5x. Trocken sterilisieren Deckgläser. |
| Woche 2 Mittwoch | Zeigen Paraffin Punkte auf Deckgläsern. Coat Deckgläser mit Poly-L-Lysin. |
| Woche 2 Donnerstag | Spülen beschichtete Deckgläser in sterilem H2O, dann inkubieren Deckbeschichtung in Medien über Nacht bei 37 ° C Ändern Sie Medien auf Astrozyten zu NB27. |
| Woche 2 Freitag | Hippocampus-Dissektion und Beschichtung. |
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Discussion
Es gibt mehrere wichtige Parameter, die sorgfältig für konsequent erfolgreiche Transfektionen 10,11 kontrolliert werden müssen. Der kritischste Parameter zur Calciumphosphat-Transfektion ist der pH-Wert von 2 x HBS, die in unseren Händen variiert üblicherweise zwischen 7,10 bis 7,15. Es wird empfohlen, drei Chargen von Titeln mit pH-Werten in 0,05-Schritten, um die Differenz zwischen den pH-Meter ausmachen. Alternativ stellt die Clontech Säugetier Transfektion Kit 2x HBS, die durchweg guten Wirkungsgrad ergibt. Beachten Sie, dass der pH-Wert der Lösung im Laufe der Zeit ändern, auch wenn sie in der Tiefkühltruhe gelagert. Wir führen in der Regel Aliquots von 2x HBS bei 4 ° C für bis zu einem Monat, und bei -20 ° C für bis zu einem Jahr.
Der zweite Parameter ist der pH-Wert des Kulturmediums. Um diese konsequent, N2.1 Medium halten werden routinemäßig auf Astroglia-Kulturen über Nacht aber nicht mehr als 24 Stunden konditioniert. Darüber hinaus versuchen wir, Astroglia Kulturen th verwendenbei sind ähnlich in der Konfluenz. Die Verwendung von Glia-konditionierten Medien hilft auch Toxizität während der Transfektion zu reduzieren, um Neuronen. Die konditionierten Medien sind in den Inkubator ins Gleichgewicht vor der Transfektion, um den pH konsistent zu halten.
Die Größe und Dichte der Calciumphosphat-Niederschlag ist entscheidend für die erfolgreiche Transfektion. Kleine Niederschläge würden zu niedrige Transfektionseffizienz führen, während die großen, klobigen Niederschläge in der Regel, um die Zytotoxizität 10 führen. Um konsistente Calciumphosphat Niederschlagsbildung zu gewährleisten, verwenden wir intermittierende Verwirbelung beim Mischen der DNA / CaCl 2 und 2x HBS 11. Eine weitere, häufig verwendete Methode zur Vermischung durch Einblasen von Luftblasen mit einer Pasteurpipette 12. Wir haben die intermittierende Wirbeln, um konsistentere Niederschlag gefunden Bildung zu erhalten, vor allem für kleine Volumina der Transfektion Mischung.
Andere Variablen zu berücksichtigen sind, die Qualität der DNA und das Alter des Neurons. Finden wir, dass die Transfektion arbeiten konsequent, wenn Neuronen erreichen DIV2, jedoch beginnt die Effizienz zu sinken, wenn Neuronen über DIV10. Schließlich wird die Gesundheit der neuronalen Kulturen selbst ist ein weiterer wichtiger Parameter. Wir finden die Verwendung des Co-Kultur-System um den besten Weg zu gesunden primären Hippocampus-Kulturen zu generieren. Wenn die Neuronen nicht gesund sind, werden sie nicht lange nach der Transfektion überleben. Mit der Co-Kultur-System kann niedriger Dichte Neuronen für bis zu 3 Wochen nach der Transfektion, die Langzeitstudien erleichtert überleben.
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Disclosures
Konflikte Interesse erklärt.
Acknowledgments
Diese Arbeit wird von NIH NS065183 und Start-up-Fonds von der Rutgers Robert Wood Johnson Medical School unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dumont #5 forceps | Fine Science Tools | 11251-20 | |
| Fine scissors | Fine Science Tools | 14090-09 | straight / sharp 8.5 cm |
| Vannas-Tubinger spring scissors | Fine Science Tools | 15008-08 | angled / sharp / 8.5 cm / 5 mm cutting edge |
| Standard pattern forceps | Fine Science Tools | 11000-16 | |
| Student surgical scissors | Fine Science Tools | 91401-14 | blunt / 14.5 cm |
| Spring scissors | Fine Science Tools | 15006-09 | angled to side / 9 cm / 10 mm cutting edge |
| Isoflurane | Webster Veterinary | 14043-225-06 | |
| Poly-L-lysine | Sigma | P2636 | |
| MEM | Sigma | M2279 | |
| 100 mM Sodium pyruvate | Sigma | S8636 | |
| Glucose | Sigma | G8270 | |
| 10x HBSS | Sigma | H4385 | |
| 1 M HEPES, pH 7.3 | Gibco/Invitrogen | 15630-080 | |
| GlutaMAX | Gibco/Invitrogen | 35050-061 | |
| Neurobasal Media | Gibco/Invitrogen | 21130-049 | |
| B27 Supplement (50x) | Gibco/Invitrogen | 17504-044 | |
| N2 Supplement | Gibco/Invitrogen | 17502-048 | |
| Ovalbumin | Sigma | A5503 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco/Invitrogen | 15070-063 | |
| 2.5% Trypsin | Gibco/Invitrogen | 15090-046 | |
| DNase I | Sigma | DN-25 | |
| Cytosine arabinoside | Calbiochem/EMD Millipore | 251010 | |
| Kynurenic acid | Sigma | K3375 |
References
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