Summary
Фосфат кальция осадков удобный и экономичный способ для трансфекции культивируемых клеток. С оптимизации, можно использовать этот метод на труднодоступных трансфекции клеток, как первичных нейронов. Здесь мы опишем наш подробный протокол для кальций-фосфатного трансфекции нейронов гиппокампа совместно культивировали с астроглиальных клеток.
Abstract
Фосфат кальция осадков удобный и экономичный способ для трансфекции культивируемых клеток. При оптимизации, можно использовать этот метод на труднодоступных трансфекции клеток, как первичных нейронов. Здесь мы опишем наш подробный протокол для кальций-фосфатного трансфекции нейронов гиппокампа совместно культивировали с астроглиальных клеток.
Introduction
Первичные нейроны являются одним из самых сложных типов клеток для трансфекции, как они постмитотическими и очень чувствительны к микро-экологических изменений. Есть четыре наиболее часто используемые типы из методов экспрессии экзогенных генов и короткого шпильки РНК (shRNAs) в этих клетках 1. Каждый имеет свои преимущества и недостатки. Например, электропорацию обычно выполняется на свежеизолированных нейронов 2, как клетки должны быть переданы в кюветы для трансфекции. Вирус инфекция, как правило, добиться очень высокой эффективности 3, но более трудоемким и рискованным для операторов. Многие липидов-опосредованной трансфекции реагенты коммерчески доступны, с разной степенью успеха в нейронах и на разных уровнях цитотоксичности.
Фосфат кальция трансфекции представляет собой удобный и экономичный способ введения чужеродных генов в нейронах. Этот метод был впервые использован ввести аденовируса ДНК в чел млекопитающихлс по Грэм и Ван Дер Eb (1973) 4. Трансфекцию проводили путем смешивания хлорида кальция с рекомбинантной ДНК в фосфатном буфере. Это позволяет формирование фосфат ДНК / кальция выпадает в осадок, который при постепенно падает на монослой клеток, прилипают к поверхности клетки, принимаются к эндоцитоза и, наконец, проникает в ядро 5. Этот процесс приведет к экспрессии чужеродных генов, введенных в клетки-мишени. Типичные КПД фосфата кальция диапазоне трансфекции между 0,5-5% 6-8. Тем не менее, с тщательной оптимизации и последовательного выполнения экспериментального протокола, можно достичь эффективности трансфекции почти на 50%. Здесь мы опишем наш подробный протокол для кальций-фосфатного трансфекции первичных нейронов гиппокампа, которые совместно культивировали с астроглиальных клеток в сэндвич формате 9.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Подготовка Rat астроцитов культуры для кондиционированной среды и астроцитов нейронов совместных культурах.
- Приготовить рассечение буфера (BSS, см. таблицу 1 для рецепта) и хранить при температуре 4 ° С до готовности к использованию.
- Обезболить новорожденных крысят (P0-P2) изофлураном в стакан емкостью 500 мл.
- Когда щенки неподвижны, спрей с 70% этанола и обезглавить.
- Снимите мозг.
- Держите голову твердо с парой Дюмон # 5 щипцами, и использовать тонких ножниц сделать срединный разрез через кожу и черепа.
- Expose мозг, отражая череп в стороны, и удалить мозг в блюдо с холодной BSS.
- Отделите полушария от промежуточного мозга и ствола мозга при вскрытии рамки. Осторожно снимите все мозговые оболочки путем стабилизации ткани с одной парой щипцов и аккуратно отстраняясь мозговых оболочек с другой парой щипцов.
- Соберите все полушария ян один 60 мм блюдо. Использование маленькие ножницы, фарш ткани как мелко, насколько это возможно. Затем трансфер фарш ткани на 50 мл коническую трубку.
- Добавить 1,5 мл 1% ДНКазы I и 1,5 мл 2,5% трипсина и 12 мл BSS (общий объем 15 мл) в мозгах. Выдержите в встряхивании на водяной бане в течение 15 мин при 37 ° С Чтобы обеспечить хорошее перемешивание, трубка вращают рукой каждые 5 мин.
- Передача супернатант через 70 мкм ячейки фильтра над новым 50 мл коническую трубку. Добавьте 3 мл FBS к этому супернатанта.
- Для остальных частей, добавить 13,5 мл ПБС и 1,5 мл 2,5% трипсина и инкубировали в водяной бане встряхивания в течение еще 15 мин.
- Передача оставшегося супернатанта через клеточный фильтр и в сочетании с надосадочной жидкости со стадии 1.8.
- Центрифуге при 1000 оборотов в минуту в течение 5 минут для осаждения клеток.
- Ресуспендируют гранулы в 5 мл глиальных информации. Супернатант может быть снова центрифугируют для осаждения остальные клетки.
- Граф клеток с помощью гемоцитометра.
- Тарелка челлс при плотности 1 х 10 7 на 150 см 2 колбы.
- Изменение средств массовой информации для свежих глиальных СМИ на следующий день после посева. Впоследствии, кормить клетки два раза в неделю с глиальных СМИ.
- Когда клетки достигли> 80% слияния (примерно 10 дней после посева), замораживание клеток вниз в 90% лошадиной сыворотки и 10% ДМСО и держать запасы в жидком азоте. Клетки замораживают при 2 х 10 6 на флакон. Примерно 5 флаконов могут быть заморожены из каждой колбы.
- О 10-14 дней перед настройкой гиппокампа культуры, глиальные клетки высевают из замороженных запасов. Мы обычно пластины пять 6-луночных, что достаточно, чтобы поддерживать рост 90 покровные нейронов гиппокампа (три 15 мм круглые покровные на лунку). Мы также пластины дополнительно от восьми до десяти 60 мм блюда глиальных клеток, который используется для кондиционирования N2.1 средств массовой информации для трансфекции. Накануне нейронов культуры, клетки должны быть поданы с NB27 СМИ. Астроциты в идеале должно быть> 90% сливной в гоявляется точка. Мы считаем, что значительно замораживание уменьшает количество микроглии в астроглиальных культур. Поскольку увеличивается нейротоксичность наблюдается при микроглии присутствует в астроглиальных культур, мы всегда используем астроглиальную культуру, приготовленный из замороженных запасов для совместного культивирования с нейронами.
2. Нейронов Культура
- Чистые покровные стекла по первой промывки в MilliQ воды 2x. Они затем замачивают в концентрированной азотной кислоте в течение 24 часов, и промывают MilliQ водой в течение не менее пяти раз в течение в общей сложности 2 часа. Покровные стекла высушивают и стерилизуют путем выпечки в печи при 225 ° С в течение 6 часов.
- Передача покровные до 60 мм блюд после стерилизации. Поместите четыре точки стерильного парафина вблизи внешней кромки каждого покровного стекла, чтобы сохранить нейроны отдельно от глиальных клеток в течение сокультивирования.
- Coat покровные с 1 мг / мл поли-L-лизина в 0,1 М боратного буфера в течение ночи в 37 ° C инкубаторе.
- На следующий день, промыть покровные дважды в стерильной мilliQ воды не менее 15 минут каждый. Затем они инкубировали в течение ночи в металлизации СМИ в 37 ° С инкубатор.
- Усыпить беременную крысу (E18) на изофлурановой анестезии, после чего пневмоторакса и эвтаназии эмбрионов крыс путем обезглавливания. Удалить мозги и рассекать из полушарий, как описано выше.
- Рассеките из гиппокампа от полушария головного мозга. Поместите все гиппокампе в 15 мл коническую пробирку и переварить с 0,25% трипсина (0,5 мл 2,5% трипсин, 4,5 мл ПБС) при 37 ℃ в течение 15 мин.
- Переваривается гиппокамп промыть в BSS 3x в течение 5 минут каждый. Они затем растирали со стеклянной пипетки Пастера и плотность клеток определяется с помощью гемоцитометра. Нейроны затем высевали при плотности 2 × 10 5 клеток на 60 мм чашку.
- О 2-4 ч после посева, передача покровные с прикрепленными нейронов на блюдах, содержащих астроглиальных клеток, с нейроны вниз к глии. В DIV3, добавить цитозинарабинозид кклетки в конечной концентрации 5 мкМ, чтобы остановить глии пролиферацию.
3. Кальций Трансфекцию
- Состояние N2.1 СМИ на глии день до трансфекции.
- В день трансфекции взять условный N2.1 СМИ прочь глии и передачи в новое блюдо. Передача покровные с нейронами в кондиционированной N2.1 СМИ. Пусть равновесие в инкубаторе в течение 10-30 мин.
- Для одного набора стерильные пробирки, объединить 1-4 мкг ДНК, 12,5 мкл 2 М CaCl 2, и стерильной H 2 O при общем объеме 100 мкл. Для второго набора труб, добавьте 100 мкл 2х HBS.
- Добавить ⅛ объем 2x HBS (12,5 мкл) в то время, в пробирку, содержащую смесь CaCl 2 / ДНК, встряхиванием в течение нескольких секунд каждый раз. Разрешить трубы, чтобы сидеть в течение 15 мин.
- После 15 мин инкубации, добавить по каплям смесь трансфекции в клетки. Выдержите в течение 1-1,5 часов. Слой песка, как выделений должна быть виднапод микроскопом с использованием объектива 10х.
- После инкубации промыть покровные дважды теплой HBS промывочного буфера.
- Возврат к покровные оригинальных блюд с глии, добавьте кинуреновой кислоту до конечной концентрации 0,5 мМ.
- Трансфицированные нейроны могут быть отображены в прямом эфире или обработанные для иммуноцитохимии уже в течение следующего дня. Нейроны могут выживать до трех недель после трансфекции.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Когда различные параметры трансфекции оптимизированы и тщательно контролировать от эксперимента к эксперименту, можно получить эффективность трансфекции до 50%. Фиг.1 показывает поле нейронов, которые трансфицированных GFP на DIV4. Поле содержит в общей сложности 28 нейронов, среди которых 16 были трансфектированных. Это представляет собой эффективность более чем на 50%. Осуществление выборки других областях на той же покровным показывает общий КПД составляет около 50% (данные не показаны). С астроглиального системы сокультивирования, нейроны оставаться здоровым и нормально развиваться после трансфекции. Рисунок 2 показывает гиппокампа нейрон в DIV15, через 10 дней после трансфекции с PSD-95-GFP конструкции. Нейрон разработала многочисленные зрелые грибовидных дендритных шипиков, который указывает, нейроны здоровы. Высокая эффективность трансфекции и минимальное токсичность этого протокола делает его ценным инструментом для изучения функций генов в начальной бегемотаCampal нейроны. Наконец, этот протокол потенциально могут быть адаптированы для трансфекции культуры других типов нейронов в головном мозге, а также другие типы труднодоступных трансфекции клеток.
Рисунок 1. Нейронов гиппокампа трансфецировали GFP в DIV4, показывая высокую эффективность трансфекции. 16 из 28 нейронов в области положительны. Нажмите здесь, чтобы увеличить изображение .
Рисунок 2. Гиппокампа нейрон трансфецировали PSD-95-GFP в DIV15, показывая многочисленные зрелые грибовидных дендритных шипиков. Нажмите здесь, чтобы увеличить изображение .
Таблица 1. Буфер / СМИ Рецепты.
| Реагент | Компоненты |
| Глиальных Медиа | 425 мл MEM 5 мл Glutamax 5 пируват натрия мл, 100 мМ 15 мл 20% глюкозы 25 мл FBS (конечная 5%) 25 мл сыворотки теленка (конечная 5%) 5 мл пенициллина / стрептомицина |
| 0,1 М боратного буфера | 2,48 г борной кислоты 3,9 г натрия тетраборат (Бура) +800 Мл MilliQ H2O рН с NaOH до 8,5 фильтр стерилизуют |
| Покрытие Медиа | 425 мл MEM 5 мл Glutamax 5 пируват натрия мл, 100 мМ 15 мл 20% гlucose 50 мл FBS |
| NB27 Медиа | 485 мл Neurobasal Медиа 5 мл Glutamax 2 мл B27 добавка (50x) |
| Вскрытие буфера (BSS) | 50 мл 10x ССРХ 5 мл 1 М HEPES, рН 7,3 5 мл пенициллина / стрептомицина 440 мл H 2 O |
| N2.1 Медиа | 425 мл MEM 5 мл Glutamax 5 пируват натрия мл, 100 мМ 15 мл 20% глюкозы 50 мл овальбумина, 1% в MEM 5 мл N2 добавка |
| 2x HEPES-солевом буфере (HBS), стерильный | 274 мм NaCl 9.5 мМ КСl 15 мм глюкозы 42 мм HEPES 1.4 мМ Na 2 HPO 4 Подготовка партий 3 различных рН (7,05, 7,10, 7,15) |
| Промывочного буфера (HEPES-солевой буфер) | 50 мл 10x ССРХ 5 мл 1 М HEPES, рН 7,3 445 мл H 2 O |
| 50 ммоль Kynurenic кислоты | Растворите 0,473 г кинуреновой кислоты в 1x PBS. Добавить капель NaOH, чтобы получить его в раствор. Затем с помощью HCl, чтобы отрегулировать рН спину до 7,0 |
Таблица 2. Линия Время для подготовки культуры.
| День | Действие |
| Перед началом | Подготовка астроцитов культуры и заморозить клетки вниз. Одну партию астроцитов культуры, как правило, поддерживают несколько месяцев гиппокампа культур. |
| Неделя 1 Понедельник | Оттепель астроциты. |
| Неделя 1 Вторник | Поток астроциты. |
| Неделя 1 Пятница | Поток астроциты. |
| Неделя 2 Понедельник | Поток астроциты. Промыть покровные в H 2 O, затем замочить в азотной кислоте в течение 24 часов. |
| Неделя 2 Вторник | Ринсебе покровные 5x. Сухой стерилизовать покровные. |
| Неделя 2 Среда | Наведите парафиновые точки на покровные. Пальто покровные с поли-L-лизина. |
| Неделя 2 Четверг | Промыть покрытием покровные в стерильной Н2О, то инкубировать покровные в покрытие СМИ в течение ночи при 37 ° С Изменение средств массовой информации на астроциты в NB27. |
| Неделя 2 Пятница | Гиппокампа вскрытие и обшивки. |
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Есть несколько ключевых параметров, которые должны быть тщательно контролируется для последовательно успешных трансфекций 10,11. Наиболее важным параметром для фосфата кальция трансфекции является значение рН 2х HBS, которые в наших руках, как правило, колеблется в пределах 7,10-7,15. Мы рекомендуем сделать три партии запасов с рН с шагом 0,05 для учета разницы между рН-метров. С другой стороны, млекопитающих комплект трансфекции Clontech предоставляет 2x HBS, которые постоянно дающий хорошую эффективность. Имейте в виду, что рН раствора будет меняться с течением времени, даже при хранении в морозильной камере. Мы вообще держать аликвоты 2х HBS при 4 ° С в течение одного месяца, а при -20 ° С в течение до одного года.
Вторым параметром является значение рН культуральной среды. Чтобы сохранить эту последовательную, N2.1 среды регулярно обусловлено астроглиальных культур на ночь, но не более 24 часа в сутки. Кроме того, мы стараемся использовать астроглиальных культур йна схожи в сплошности. Использование глии кондиционером СМИ также помогает снизить токсичность для нейронов во время трансфекции. Кондиционированные среды уравновешивают в инкубаторе до трансфекции дл поддержани рН последовательным.
Размер и плотность фосфата кальция осадков является ключом к успешной трансфекции. Небольшие осадки приведут к низкой эффективности трансфекции, в то время как большие, массивный осадки обычно приводят к цитотоксичности 10. Для обеспечения последовательного формирования фосфата кальция осадка, мы используем прерывистый вихревание при смешивании ДНК / CaCl 2 и 2x HBS 11. Другой часто используемый метод для смешивания через дует пузырьки воздуха с помощью пипетки Пастера 12. Мы нашли прерывистый вихревание с получением более последовательную образование осадка, особенно для небольших объемов трансфекции смеси.
Другие переменные, которые следует рассмотреть качество ДНК и возраст нейронс. Мы считаем, что трансфекции начать работать последовательно, когда нейроны достигают div2, однако, эффективность начинает снижаться, когда нейроны находятся вне DIV10. Наконец, здоровье самих нейронов культур представляет собой еще один важный параметр. Мы находим использование системы совместного культивирования быть лучшим способом для получения здоровых культур первичной гиппокампа. Если нейроны не являются здоровыми, они долго не протянет после трансфекции. С помощью системы совместного культивирования, низкие нейроны плотности могут выживать в течение до 3 недель после трансфекции, что облегчает долгосрочные исследования.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Нет конфликта заинтересованы не объявлена.
Acknowledgments
Эта работа поддерживается NIH грант NS065183 и пуско-наладочных средств из Rutgers Роберта Вуда Джонсона медицинской школы.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dumont #5 forceps | Fine Science Tools | 11251-20 | |
| Fine scissors | Fine Science Tools | 14090-09 | straight / sharp 8.5 cm |
| Vannas-Tubinger spring scissors | Fine Science Tools | 15008-08 | angled / sharp / 8.5 cm / 5 mm cutting edge |
| Standard pattern forceps | Fine Science Tools | 11000-16 | |
| Student surgical scissors | Fine Science Tools | 91401-14 | blunt / 14.5 cm |
| Spring scissors | Fine Science Tools | 15006-09 | angled to side / 9 cm / 10 mm cutting edge |
| Isoflurane | Webster Veterinary | 14043-225-06 | |
| Poly-L-lysine | Sigma | P2636 | |
| MEM | Sigma | M2279 | |
| 100 mM Sodium pyruvate | Sigma | S8636 | |
| Glucose | Sigma | G8270 | |
| 10x HBSS | Sigma | H4385 | |
| 1 M HEPES, pH 7.3 | Gibco/Invitrogen | 15630-080 | |
| GlutaMAX | Gibco/Invitrogen | 35050-061 | |
| Neurobasal Media | Gibco/Invitrogen | 21130-049 | |
| B27 Supplement (50x) | Gibco/Invitrogen | 17504-044 | |
| N2 Supplement | Gibco/Invitrogen | 17502-048 | |
| Ovalbumin | Sigma | A5503 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco/Invitrogen | 15070-063 | |
| 2.5% Trypsin | Gibco/Invitrogen | 15090-046 | |
| DNase I | Sigma | DN-25 | |
| Cytosine arabinoside | Calbiochem/EMD Millipore | 251010 | |
| Kynurenic acid | Sigma | K3375 |
References
- Karra, D., Dahm, R. Transfection techniques for neuronal cells. J. Neurosci. 30, 6171-6177 (2010).
- Zeitelhofer, M., et al. High-efficiency transfection of mammalian neurons via nucleofection. Nat. Protoc. 2, 1692-1704 (2007).
- Janas, J., Skowronski, J., Van Aelst, L. Lentiviral delivery of RNAi in hippocampal neurons. Method Enzymol. 406, 593-605 (2006).
- Graham, F. L., vander Eb, A. J. A new technique for the assay of infectivity of human adenovirus 5 DNA. Virology. 52, 456-467 (1973).
- Craig, A. M. Transfecting cultured neurons. Culturing Nerve Cells. Banker, G. aG. K. , 2nd edition, MIT Press. Cambridge, MA. (1998).
- Alavian, K. N., et al. Bcl-xL regulates metabolic efficiency of neurons through interaction with the mitochondrial F1FO ATP synthase. Nat. Cell Biol. 13, 1224-1233 (2011).
- Zhang, Y., et al. Modulation of synaptic function by VAC14, a protein that regulates the phosphoinositides PI(3,5)P(2) and PI(5)P. EMBO J. 31, 3442-3456 (2012).
- Dudek, H., Ghosh, A., Greenberg, M. E. Calcium phosphate transfection of DNA into neurons in primary culture. Curr. Protoc. Neurosci. Chapter 3, Unit 3 11 (2001).
- Goslin, K. A. H., Banker, G. Rat Hippocampal Neurons in Low-Density Culture. Culturing Nerve Cells. Banker, G. aG. K. , MIT Press. Cambridge, MA. (1998).
- Kohrmann, M., et al. Fast, convenient, and effective method to transiently transfect primary hippocampal neurons. J. Neurosci. Res. 58, 831-835 (1999).
- Jiang, M., Chen, G. High Ca2+-phosphate transfection efficiency in low-density neuronal cultures. Nat. Protoc. 1, 695-700 (2006).
- Goetze, B., Grunewald, B., Baldassa, S., Kiebler, M. Chemically controlled formation of a DNA/calcium phosphate coprecipitate: application for transfection of mature hippocampal neurons. J. Neurobiol. 60, 517-525 (2004).
