Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Фосфат кальция Трансфекцию первичной нейронов гиппокампа

25.8K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/50808

⸱

12 ноября 2013 г.

 ,  ,  ,  , 
1Department of Neuroscience and Cell Biology, Robert Wood Johnson Medical School, Rutgers University

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

Фосфат кальция осадков удобный и экономичный способ для трансфекции культивируемых клеток. С оптимизации, можно использовать этот метод на труднодоступных трансфекции клеток, как первичных нейронов. Здесь мы опишем наш подробный протокол для кальций-фосфатного трансфекции нейронов гиппокампа совместно культивировали с астроглиальных клеток.

Аннотация

Фосфат кальция осадков удобный и экономичный способ для трансфекции культивируемых клеток. При оптимизации, можно использовать этот метод на труднодоступных трансфекции клеток, как первичных нейронов. Здесь мы опишем наш подробный протокол для кальций-фосфатного трансфекции нейронов гиппокампа совместно культивировали с астроглиальных клеток.

Введение

Первичные нейроны являются одним из самых сложных типов клеток для трансфекции, как они постмитотическими и очень чувствительны к микро-экологических изменений. Есть четыре наиболее часто используемые типы из методов экспрессии экзогенных генов и короткого шпильки РНК (shRNAs) в этих клетках 1. Каждый имеет свои преимущества и недостатки. Например, электропорацию обычно выполняется на свежеизолированных нейронов 2, как клетки должны быть переданы в кюветы для трансфекции. Вирус инфекция, как правило, добиться очень высокой эффективности 3, но более трудоемким и рискованным для операторов. Многие липидов-опосредованной трансфекции реагенты коммерчески доступны, с разной степенью успеха в нейронах и на разных уровнях цитотоксичности.

Фосфат кальция трансфекции представляет собой удобный и экономичный способ введения чужеродных генов в нейронах. Этот метод был впервые использован ввести аденовируса ДНК в чел млекопитающихлс по Грэм и Ван Дер Eb (1973) 4. Трансфекцию проводили путем смешивания хлорида кальция с рекомбинантной ДНК в фосфатном буфере. Это позволяет формирование фосфат ДНК / кальция выпадает в осадок, который при постепенно падает на монослой клеток, прилипают к поверхности клетки, принимаются к эндоцитоза и, наконец, проникает в ядро 5. Этот процесс приведет к экспрессии чужеродных генов, введенных в клетки-мишени. Типичные КПД фосфата кальция диапазоне трансфекции между 0,5-5% 6-8. Тем не менее, с тщательной оптимизации и последовательного выполнения экспериментального протокола, можно достичь эффективности трансфекции почти на 50%. Здесь мы опишем наш подробный протокол для кальций-фосфатного трансфекции первичных нейронов гиппокампа, которые совместно культивировали с астроглиальных клеток в сэндвич формате 9.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. Подготовка Rat астроцитов культуры для кондиционированной среды и астроцитов нейронов совместных культурах.

  1. Приготовить рассечение буфера (BSS, см. таблицу 1 для рецепта) и хранить при температуре 4 ° С до готовности к использованию.
  2. Обезболить новорожденных крысят (P0-P2) изофлураном в стакан емкостью 500 мл.
  3. Когда щенки неподвижны, спрей с 70% этанола и обезглавить.
  4. Снимите мозг.
    1. Держите голову твердо с парой Дюмон # 5 щипцами, и использовать тонких ножниц сделать срединный разрез через кожу и черепа.
    2. Expose мозг, отражая череп в стороны, и удалить мозг в блюдо с холодной BSS.
  5. Отделите полушария от промежуточного мозга и ствола мозга при вскрытии рамки. Осторожно снимите все мозговые оболочки путем стабилизации ткани с одной парой щипцов и аккуратно отстраняясь мозговых оболочек с другой парой щипцов.
  6. Соберите все полушария ян один 60 мм блюдо. Использование маленькие ножницы, фарш ткани как мелко, насколько это возможно. Затем трансфер фарш ткани на 50 мл коническую трубку.
  7. Добавить 1,5 мл 1% ДНКазы I и 1,5 мл 2,5% трипсина и 12 мл BSS (общий объем 15 мл) в мозгах. Выдержите в встряхивании на водяной бане в течение 15 мин при 37 ° С Чтобы обеспечить хорошее перемешивание, трубка вращают рукой каждые 5 мин.
  8. Передача супернатант через 70 мкм ячейки фильтра над новым 50 мл коническую трубку. Добавьте 3 мл FBS к этому супернатанта.
  9. Для остальных частей, добавить 13,5 мл ПБС и 1,5 мл 2,5% трипсина и инкубировали в водяной бане встряхивания в течение еще 15 мин.
  10. Передача оставшегося супернатанта через клеточный фильтр и в сочетании с надосадочной жидкости со стадии 1.8.
  11. Центрифуге при 1000 оборотов в минуту в течение 5 минут для осаждения клеток.
  12. Ресуспендируют гранулы в 5 мл глиальных информации. Супернатант может быть снова центрифугируют для осаждения остальные клетки.
  13. Граф клеток с помощью гемоцитометра.
  14. Тарелка челлс при плотности 1 х 10 7 на 150 см 2 колбы.
  15. Изменение средств массовой информации для свежих глиальных СМИ на следующий день после посева. Впоследствии, кормить клетки два раза в неделю с глиальных СМИ.
  16. Когда клетки достигли> 80% слияния (примерно 10 дней после посева), замораживание клеток вниз в 90% лошадиной сыворотки и 10% ДМСО и держать запасы в жидком азоте. Клетки замораживают при 2 х 10 6 на флакон. Примерно 5 флаконов могут быть заморожены из каждой колбы.
  17. О 10-14 дней перед настройкой гиппокампа культуры, глиальные клетки высевают из замороженных запасов. Мы обычно пластины пять 6-луночных, что достаточно, чтобы поддерживать рост 90 покровные нейронов гиппокампа (три 15 мм круглые покровные на лунку). Мы также пластины дополнительно от восьми до десяти 60 мм блюда глиальных клеток, который используется для кондиционирования N2.1 средств массовой информации для трансфекции. Накануне нейронов культуры, клетки должны быть поданы с NB27 СМИ. Астроциты в идеале должно быть> 90% сливной в гоявляется точка. Мы считаем, что значительно замораживание уменьшает количество микроглии в астроглиальных культур. Поскольку увеличивается нейротоксичность наблюдается при микроглии присутствует в астроглиальных культур, мы всегда используем астроглиальную культуру, приготовленный из замороженных запасов для совместного культивирования с нейронами.

2. Нейронов Культура

  1. Чистые покровные стекла по первой промывки в MilliQ воды 2x. Они затем замачивают в концентрированной азотной кислоте в течение 24 часов, и промывают MilliQ водой в течение не менее пяти раз в течение в общей сложности 2 часа. Покровные стекла высушивают и стерилизуют путем выпечки в печи при 225 ° С в течение 6 часов.
  2. Передача покровные до 60 мм блюд после стерилизации. Поместите четыре точки стерильного парафина вблизи внешней кромки каждого покровного стекла, чтобы сохранить нейроны отдельно от глиальных клеток в течение сокультивирования.
  3. Coat покровные с 1 мг / мл поли-L-лизина в 0,1 М боратного буфера в течение ночи в 37 ° C инкубаторе.
  4. На следующий день, промыть покровные дважды в стерильной мilliQ воды не менее 15 минут каждый. Затем они инкубировали в течение ночи в металлизации СМИ в 37 ° С инкубатор.
  5. Усыпить беременную крысу (E18) на изофлурановой анестезии, после чего пневмоторакса и эвтаназии эмбрионов крыс путем обезглавливания. Удалить мозги и рассекать из полушарий, как описано выше.
  6. Рассеките из гиппокампа от полушария головного мозга. Поместите все гиппокампе в 15 мл коническую пробирку и переварить с 0,25% трипсина (0,5 мл 2,5% трипсин, 4,5 мл ПБС) при 37 ℃ в течение 15 мин.
  7. Переваривается гиппокамп промыть в BSS 3x в течение 5 минут каждый. Они затем растирали со стеклянной пипетки Пастера и плотность клеток определяется с помощью гемоцитометра. Нейроны затем высевали при плотности 2 × 10 5 клеток на 60 мм чашку.
  8. О 2-4 ч после посева, передача покровные с прикрепленными нейронов на блюдах, содержащих астроглиальных клеток, с нейроны вниз к глии. В DIV3, добавить цитозинарабинозид кклетки в конечной концентрации 5 мкМ, чтобы остановить глии пролиферацию.

3. Кальций Трансфекцию

  1. Состояние N2.1 СМИ на глии день до трансфекции.
  2. В день трансфекции взять условный N2.1 СМИ прочь глии и передачи в новое блюдо. Передача покровные с нейронами в кондиционированной N2.1 СМИ. Пусть равновесие в инкубаторе в течение 10-30 мин.
  3. Для одного набора стерильные пробирки, объединить 1-4 мкг ДНК, 12,5 мкл 2 М CaCl 2, и стерильной H 2 O при общем объеме 100 мкл. Для второго набора труб, добавьте 100 мкл 2х HBS.
  4. Добавить ⅛ объем 2x HBS (12,5 мкл) в то время, в пробирку, содержащую смесь CaCl 2 / ДНК, встряхиванием в течение нескольких секунд каждый раз. Разрешить трубы, чтобы сидеть в течение 15 мин.
  5. После 15 мин инкубации, добавить по каплям смесь трансфекции в клетки. Выдержите в течение 1-1,5 часов. Слой песка, как выделений должна быть виднапод микроскопом с использованием объектива 10х.
  6. После инкубации промыть покровные дважды теплой HBS промывочного буфера.
  7. Возврат к покровные оригинальных блюд с глии, добавьте кинуреновой кислоту до конечной концентрации 0,5 мМ.
  8. Трансфицированные нейроны могут быть отображены в прямом эфире или обработанные для иммуноцитохимии уже в течение следующего дня. Нейроны могут выживать до трех недель после трансфекции.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Когда различные параметры трансфекции оптимизированы и тщательно контролировать от эксперимента к эксперименту, можно получить эффективность трансфекции до 50%. Фиг.1 показывает поле нейронов, которые трансфицированных GFP на DIV4. Поле содержит в общей сложности 28 нейронов, среди которых 16 были трансфектированных. Это представляет собой эффективность более чем на 50%. Осуществление выборки других областях на той же покровным показывает общий КПД составляет около 50% (данные не показаны). С астроглиал...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Есть несколько ключевых параметров, которые должны быть тщательно контролируется для последовательно успешных трансфекций 10,11. Наиболее важным параметром для фосфата кальция трансфекции является значение рН 2х HBS, которые в наших руках, как правило, колеблется в пределах 7,10-7,15. Мы рекомендуем сделать три партии запасов с рН с шагом 0,05 для учета разницы между рН-метров. С другой стороны, млекопитающих комплект трансфекции Clontech предоставляет 2x HBS, которые постоянно дающий хорошую эффективность. И...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Нет конфликта заинтересованы не объявлена.

Благодарности

Эта работа поддерживается NIH грант NS065183 и пуско-наладочных средств из Rutgers Роберта Вуда Джонсона медицинской школы.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Щипцы Dumont #5Fine Science Tools11251-20
Тонкие ножницыFine Science Tools14090-09прямые / острые 8,5 см
Vannas-Tubinger пружинные ножницыFine Science Tools15008-08угловые / острые / 8,5 см / 5 мм режущая кромка
Стандартный шаблон щипцовFine Science Tools11000-16
Student surgical ножницы Fine Science Tools91401-14тупые / 14,5 см
Пружинные ножницыFine Science Tools15006-09наклоненные в сторону / 9 см / 10 мм режущая кромка
IsofluraneWebster Veterinary14043-225-06
Poly-L-лизинSigmaP2636
MEMSigmaM2279
100 мМ Пируват натрияSigmaS8636
ГлюкозаSigmaG8270
10x HBSSSigmaH4385
1 М HEPES, pH 7,3Gibco/Invitrogen15630-080
GlutaMAXGibco/Invitrogen35050-061
Нейробазальная средаGibco/Invitrogen21130-049
B27 Добавка (50x)Gibco/ Invitrogen17504-044
N2 SupplementGibco/Invitrogen17502-048
ОвальбуминSigmaA5503
Пенициллин/СтрептомицинGibco/Invitrogen15070-063
2,5% ТрипсинGibco/Invitrogen15090-046
DNase ISigmaDN-25
Цитозин арабинозидCalbiochem/EMD Millipore251010
Кинуреновая кислотаSigmaK3375

Ссылки

  1. Karra, D., Dahm, R. Transfection techniques for neuronal cells. J. Neurosci. 30, 6171-6177 (2010).
  2. Zeitelhofer, M., et al. High-efficiency transfection of mammalian neurons via nucleofection. Nat. Protoc. 2, 1692-1704 (2007).
  3. Janas, J., Skowronski, J., Van Aelst, L. Lentiviral delivery of RNAi in hippocampal neurons. Method Enzymol. 406, 593-605 (2006).
  4. Graham, F. L., vander Eb, A. J. A new technique for the assay of infectivity of human adenovirus 5 DNA. Virology. 52, 456-467 (1973).
  5. Craig, A. M. Transfecting cultured neurons. Culturing Nerve Cells. Banker, G. aG. K. , 2nd edition, MIT Press. Cambridge, MA. (1998).
  6. Alavian, K. N., et al. Bcl-xL regulates metabolic efficiency of neurons through interaction with the mitochondrial F1FO ATP synthase. Nat. Cell Biol. 13, 1224-1233 (2011).
  7. Zhang, Y., et al. Modulation of synaptic function by VAC14, a protein that regulates the phosphoinositides PI(3,5)P(2) and PI(5)P. EMBO J. 31, 3442-3456 (2012).
  8. Dudek, H., Ghosh, A., Greenberg, M. E. Calcium phosphate transfection of DNA into neurons in primary culture. Curr. Protoc. Neurosci. Chapter 3, Unit 3 11(2001).
  9. Goslin, K. A. H., Banker, G. Rat Hippocampal Neurons in Low-Density Culture. Culturing Nerve Cells. Banker, G. aG. K. , MIT Press. Cambridge, MA. (1998).
  10. Kohrmann, M., et al. Fast, convenient, and effective method to transiently transfect primary hippocampal neurons. J. Neurosci. Res. 58, 831-835 (1999).
  11. Jiang, M., Chen, G. High Ca2+-phosphate transfection efficiency in low-density neuronal cultures. Nat. Protoc. 1, 695-700 (2006).
  12. Goetze, B., Grunewald, B., Baldassa, S., Kiebler, M. Chemically controlled formation of a DNA/calcium phosphate coprecipitate: application for transfection of mature hippocampal neurons. J. Neurobiol. 60, 517-525 (2004).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Больше статей

Культура астроглиальных клетокфлуоресцентная микроскопияэффективность трансфекции клетокметод осаждения ДНКсистема нейрональной кокультурыкондиционирование глиальной средыпротокол трипсинизациитрансфекция на покровных стеклах
Фосфат кальция Трансфекцию первичной нейронов гиппокампа
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.