Summary
कैल्शियम फॉस्फेट तेज़ी संवर्धित कोशिकाओं के अभिकर्मक के लिए एक सुविधाजनक और किफायती तरीका है. अनुकूलन के साथ, यह प्राथमिक न्यूरॉन्स की तरह मुश्किल से transfect कोशिकाओं पर इस विधि का उपयोग करने के लिए संभव है. यहाँ हम astroglial कोशिकाओं के साथ cocultured hippocampal न्यूरॉन्स की कैल्शियम फॉस्फेट अभिकर्मक के लिए हमारे विस्तृत प्रोटोकॉल का वर्णन.
Abstract
कैल्शियम फॉस्फेट तेज़ी संवर्धित कोशिकाओं के अभिकर्मक के लिए एक सुविधाजनक और किफायती तरीका है. अनुकूलन के साथ, यह प्राथमिक न्यूरॉन्स की तरह मुश्किल से transfect कोशिकाओं पर इस विधि का उपयोग करने के लिए संभव है. यहाँ हम astroglial कोशिकाओं के साथ cocultured hippocampal न्यूरॉन्स की कैल्शियम फॉस्फेट अभिकर्मक के लिए हमारे विस्तृत प्रोटोकॉल का वर्णन.
Introduction
प्राथमिक न्यूरॉन्स वे postmitotic हैं और सूक्ष्म पर्यावरण परिवर्तन के प्रति बहुत संवेदनशील हैं के रूप में transfect करने के लिए सबसे कठिन प्रकार की कोशिकाओं में से एक हैं. इन कोशिकाओं 1 में एक्सोजेनस जीन और लघु बाल के लिये कांटा RNAs (shRNAs) की अभिव्यक्ति के लिए तरीकों की चार आमतौर पर इस्तेमाल किया प्रकार के होते हैं. प्रत्येक के अपने फायदे और नुकसान है. कोशिकाओं अभिकर्मक के लिए cuvettes में स्थानांतरित किया जाना चाहिए के रूप में उदाहरण के लिए, electroporation आमतौर पर, हौसले से अलग न्यूरॉन्स 2 पर किया जाता है. वायरस संक्रमण आमतौर पर बहुत उच्च क्षमता 3 को प्राप्त है, लेकिन अधिक श्रम प्रधान ऑपरेटरों के लिए और जोखिम भरा है सकते हैं. कई लिपिड की मध्यस्थता अभिकर्मक अभिकर्मकों न्यूरॉन्स और cytotoxicity के विभिन्न स्तरों में सफलता की डिग्री बदलती के साथ, व्यावसायिक रूप से उपलब्ध हैं.
कैल्शियम फॉस्फेट अभिकर्मक न्यूरॉन्स में विदेशी जीन शुरू करने के लिए एक सुविधाजनक और किफायती तरीका का प्रतिनिधित्व करता है. विधि प्रथम स्तनधारी सेल में adenovirus डीएनए को पेश किया गया थाग्राहम और वान डेर EB (1973) द्वारा लोकसभा 4. अभिकर्मक एक फॉस्फेट बफर में पुनः संयोजक डीएनए के साथ कैल्शियम क्लोराइड मिश्रण द्वारा किया गया था. यह धीरे - धीरे कोशिकाओं की एक monolayer पर गिरा जब डीएनए / कैल्शियम फॉस्फेट के गठन कोशिका की सतह का पालन करना, endocytosis द्वारा हाथ में लिया और अंत में नाभिक 5 में प्रवेश कर रहे हैं, जो precipitates की अनुमति देता है. इस प्रक्रिया लक्ष्य कक्ष में पेश विदेशी जीनों की अभिव्यक्ति के लिए नेतृत्व करेंगे. 0.5-5% 6-8 के बीच कैल्शियम फॉस्फेट अभिकर्मक श्रृंखला की विशिष्ट क्षमता. हालांकि, सावधान अनुकूलन और प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल के अनुरूप निष्पादन के साथ, यह लगभग 50% की एक अभिकर्मक दक्षता तक पहुँचने के लिए संभव है. यहाँ हम एक सैंडविच प्रारूप 9 में astroglial कोशिकाओं के साथ cocultured रहे हैं जो प्राथमिक hippocampal न्यूरॉन्स की कैल्शियम फॉस्फेट अभिकर्मक के लिए हमारे विस्तृत प्रोटोकॉल का वर्णन.
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Protocol
1. वातानुकूलित मीडिया और astrocyte न्यूरॉन cocultures के लिए चूहा astrocyte संस्कृति की तैयारी.
- (बीएसएस नुस्खा के लिए 1 टेबल देखें) विच्छेदन बफर तैयार है और 4 डिग्री सेल्सियस पर दुकान उपयोग के लिए तैयार है जब तक.
- एक 500 मिलीलीटर बीकर में isoflurane के साथ नवजात चूहे पिल्ले (P0-P2) anesthetize.
- पिल्ले स्थिर रहे हैं, 70% इथेनॉल के साथ स्प्रे और सिर काटना.
- मस्तिष्क निकालें.
- Dumont # 5 संदंश की एक जोड़ी के साथ मजबूती से सिर पकड़ और त्वचा और खोपड़ी के माध्यम से एक midline चीरा बनाने के लिए ठीक कैंची का उपयोग करें.
- पक्षों के लिए खोपड़ी को दर्शाती द्वारा मस्तिष्क का पर्दाफाश, और ठंड बीएसएस युक्त एक डिश में मस्तिष्क को हटा दें.
- एक विदारक गुंजाइश के तहत diencephalon और ब्रेन स्टेम से मस्तिष्क गोलार्द्धों अलग. ध्यान से संदंश की एक जोड़ी के साथ ऊतक स्थिर और धीरे संदंश की एक और जोड़ी के साथ तानिका दूर खींच द्वारा सभी तानिका हटा दें.
- सभी गोलार्द्धों लीजिए मैंn एक 60 मिमी पकवान. छोटे कैंची, कीमा ऊतक के रूप में पतले संभव के रूप में उपयोग करना. फिर एक 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब कीमा बनाया हुआ ऊतक स्थानांतरण.
- 1.5 1% DNase मैं के मिलीग्राम और 1.5 मिलीलीटर 2.5% trypsin और दिमाग को बीएसएस (15ml की कुल मात्रा) का 12 मिलीलीटर जोड़ें. 37 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए एक मिलाते हुए पानी के स्नान में सेते अच्छा मिश्रण को सुनिश्चित करने के लिए, ट्यूब हाथ से हर 5 मिनट swirled है.
- एक नया 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब पर एक 70 माइक्रोन सेल झरनी के माध्यम से सतह पर तैरनेवाला स्थानांतरण. इस सतह पर तैरनेवाला के लिए 3 मिलीग्राम FBS जोड़ें.
- शेष टुकड़े करने के लिए, 13.5 बीएसएस के मिलीग्राम और 1.5 मिलीलीटर 2.5% trypsin जोड़ सकते हैं और एक और 15 मिनट के लिए मिलाते हुए waterbath में सेते हैं.
- सेल झरनी के माध्यम से शेष सतह पर तैरनेवाला स्थानांतरण और चरण 1.8 से सतह पर तैरनेवाला के साथ गठबंधन.
- गोली कोशिकाओं के लिए 5 मिनट के लिए 1000 rpm पर अपकेंद्रित्र.
- Glial मीडिया की 5 मिलीलीटर में Resuspend छर्रों. सतह पर तैरनेवाला शेष गोली कोशिकाओं को फिर centrifuged किया जा सकता है.
- एक hemocytometer का उपयोग कोशिकाओं की गणना.
- प्लेट सीईएल1 10 x 7 सेमी 150 प्रति 2 कुप्पी के घनत्व पर रास.
- दिन चढ़ाना के बाद ताजा glial मीडिया के लिए मीडिया बदलें. बाद में, glial मीडिया के साथ सप्ताह में दो बार कोशिकाओं खिलाओ.
- कोशिकाओं> 80% confluency (लगभग 10 दिनों चढ़ाना के बाद) तक पहुँच चुके हैं, 90% घोड़े सीरम और 10% DMSO में कोशिकाओं नीचे फ्रीज और तरल नाइट्रोजन में स्टॉक रखने के. कोशिकाओं 2 शीशी प्रति एक्स 10 6 पर जमे हुए हैं. लगभग 5 शीशियों प्रत्येक कुप्पी से जमे हुए किया जा सकता है.
- के बारे में 10-14 दिनों हिप्पोकैम्पस संस्कृति को स्थापित करने से पहले, glial कोशिकाओं जमी शेयरों से चढ़ाया जाता है. हम आम तौर पर hippocampal न्यूरॉन्स की 90 coverslips (अच्छी तरह से प्रति तीन 15 मिमी दौर coverslips) के विकास का समर्थन करने के लिए पर्याप्त है जो पाँच 6 अच्छी तरह प्लेटें, थाली. हम भी अभिकर्मक के लिए कंडीशनिंग N2.1 मीडिया के लिए प्रयोग किया जाता है जो glial कोशिकाओं की एक अतिरिक्त आठ से दस 60 मिमी बर्तन, प्लेट. दिन neuronal संस्कृति से पहले, कोशिकाओं NB27 मीडिया के साथ खिलाया जाना चाहिए. astrocytes आदर्श वीं में> 90% मिला हुआ होना चाहिएबिंदु है. हम बहुत ठंड astroglial संस्कृतियों में microglia की संख्या कम कर देता है कि लगता है. Microglia astroglial संस्कृतियों में मौजूद है जब वृद्धि हुई neurotoxicity मनाया जाता है के बाद से, हम हमेशा न्यूरॉन्स के साथ coculture के लिए जमे हुए स्टॉक से तैयार astroglial संस्कृति का उपयोग करें.
2. Neuronal संस्कृति
- MilliQ पानी 2x में पहले rinsing द्वारा स्वच्छ कांच coverslips. वे तो 2 घंटे की कुल के ऊपर कम से कम पांच बार के लिए 24 घंटे के लिए केंद्रित नाइट्रिक एसिड में भिगो, और milliQ पानी के साथ rinsed हैं. Coverslips 6 घंटे के लिए 225 डिग्री सेल्सियस पर एक ओवन में पाक द्वारा सूखे और निष्फल रहे हैं.
- स्थानांतरण नसबंदी के बाद 60 मिमी व्यंजन के लिए coverslips. न्यूरॉन्स coculture दौरान glial कोशिकाओं से अलग रखने के लिए प्रत्येक coverslip के बाहरी छोर के निकट बाँझ आयल के चार डॉट्स रखें.
- 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में रातोंरात 0.1 एम borate बफर में / एमएल पाली एल lysine 1 मिलीग्राम के साथ कोट coverslips.
- अगले दिन, बाँझ मीटर में दो बार coverslips कुल्लाकम से कम 15 मिनट प्रत्येक के लिए illiQ पानी. वे तो 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में चढ़ाना मीडिया में रातोंरात incubated हैं.
- वातिलवक्ष द्वारा पीछा isoflurane संज्ञाहरण द्वारा गर्भवती चूहा (E18) euthanize, और कत्ल के द्वारा भ्रूण चूहों euthanize. दिमाग निकालें और ऊपर वर्णित के रूप में मस्तिष्क गोलार्द्धों काटना.
- मस्तिष्क गोलार्द्ध से हिप्पोकाम्पी काटना. एक 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में सभी हिप्पोकाम्पी रखें, और 15 मिनट के लिए 37 ℃ में 0.25% trypsin (0.5 मिलीलीटर 2.5% trypsin, 4.5 मिलीलीटर बीएसएस) के साथ पचा.
- पचा हिप्पोकाम्पी 5 मिनट प्रत्येक के लिए बीएसएस 3x में rinsed हैं. वे तो एक गिलास पाश्चर विंदुक के साथ triturated कर रहे हैं, और सेल घनत्व एक hemocytometer का उपयोग करके निर्धारित किया जाता है. न्यूरॉन्स तो 60 मिमी पकवान प्रति 2 एक्स 10 5 कोशिकाओं के घनत्व पर वरीयता प्राप्त हैं.
- लगभग 2-4 घंटे चढ़ाना के बाद, स्थानांतरण न्यूरॉन्स glia की ओर नीचे का सामना करना पड़ के साथ, astroglial कोशिकाओं से युक्त व्यंजन से जुड़ी न्यूरॉन्स के साथ coverslips. DIV3 में, के लिए साइटोसिन arabinoside जोड़5 सुक्ष्ममापी के अंतिम एकाग्रता में कोशिकाओं glia प्रसार को रोकने के लिए.
3. कैल्शियम अभिकर्मक
- Glia अभिकर्मक पहले दिन पर स्थिति N2.1 मीडिया.
- अभिकर्मक के दिन, glia के बंद वातानुकूलित N2.1 मीडिया लेने के लिए और एक नई डिश में हस्तांतरण. स्थानांतरण वातानुकूलित N2.1 मीडिया में न्यूरॉन्स के साथ coverslips. 10-30 मिनट के लिए इनक्यूबेटर में संतुलित करना.
- बाँझ ट्यूबों में से एक सेट करने के लिए, डीएनए की 1-4 ग्राम, 100 μl की कुल मात्रा के लिए 2 एम 2 CaCl की 12.5 μl, और बाँझ एच 2 ओ गठबंधन. ट्यूब की एक दूसरे सेट करने के लिए, 2x HBS के 100 μl जोड़ें.
- कुछ सेकंड के लिए हर बार vortexing, 2 CaCl / डीएनए मिश्रण युक्त ट्यूब के लिए एक समय में 2x HBS की ⅛ मात्रा (12.5 μl) जोड़ें. ट्यूबों 15 मिनट के लिए बैठने की अनुमति.
- 15 मिनट ऊष्मायन के बाद, कोशिकाओं को अभिकर्मक मिश्रण dropwise जोड़ने. 1-1.5 घंटे के लिए सेते हैं. रेत की तरह अवक्षेप की एक परत दिखाई जानी चाहिएएक 10x उद्देश्य का उपयोग खुर्दबीन के नीचे.
- ऊष्मायन के बाद, गर्म HBS धोने बफर के साथ दो बार coverslips कुल्ला.
- , Glia साथ मूल व्यंजन के लिए coverslips लौटें 0.5 मिमी की एक अंतिम एकाग्रता के लिए kynurenic एसिड जोड़ें.
- ट्रांसफ़ेक्ट न्यूरॉन्स लाइव imaged के रूप में या अगले दिन के रूप में immunocytochemistry के लिए कार्रवाई की जा सकती. न्यूरॉन्स अभिकर्मक के बाद तीन सप्ताह तक जीवित रह सकते हैं.
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Representative Results
अभिकर्मक के विभिन्न मापदंडों अनुकूलित और सावधानी से प्रयोग करने के लिए प्रयोग से नियंत्रित किया जाता है, यह 50% तक की अभिकर्मक क्षमता प्राप्त करने के लिए संभव है. 1 DIV4 पर GFP के साथ ट्रांसफ़ेक्ट हैं कि न्यूरॉन्स के एक क्षेत्र से पता चलता है. क्षेत्र 16 ट्रांसफ़ेक्ट थे जो बीच में 28 न्यूरॉन्स की कुल शामिल हैं. यह 50% से अधिक की दक्षता का प्रतिनिधित्व करता है. एक ही coverslip पर अन्य क्षेत्रों का एक नमूना समग्र दक्षता (नहीं दिखाया डेटा) 50% के आसपास है दिखाता है. Astroglial coculture प्रणाली के साथ, न्यूरॉन्स स्वस्थ रहना और अभिकर्मक के बाद सामान्य रूप से विकसित करना. 2 से 10 दिनों एक PSD-95-GFP निर्माण के साथ अभिकर्मक के बाद, DIV15 पर एक हिप्पोकैम्पस न्यूरॉन पता चलता है. न्यूरॉन न्यूरॉन्स स्वस्थ हैं जो इंगित करता है, कई परिपक्व मशरूम के आकार का वृक्ष के समान spines विकसित की है. उच्च अभिकर्मक दक्षता और इस प्रोटोकॉल का न्यूनतम विषाक्तता यह प्राथमिक हिप्पो में जीन कार्यों के अध्ययन के लिए एक महत्वपूर्ण उपकरण बना देता हैcampal न्यूरॉन्स. अंत में, इस प्रोटोकॉल संभवतः दिमाग में न्यूरॉन्स के अन्य प्रकार की संस्कृतियों, साथ ही अन्य मुश्किल से transfect प्रकार की कोशिकाओं transfect के लिए अनुकूलित किया जा सकता है.
चित्रा 1. Hippocampal न्यूरॉन्स क्षेत्र में 28 न्यूरॉन्स के बाहर उच्च अभिकर्मक दक्षता. 16 सकारात्मक रहे हैं, दिखा DIV4 में GFP के साथ ट्रांसफ़ेक्ट. बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें .
चित्रा 2. PSD के साथ ट्रांसफ़ेक्ट hippocampal न्यूरॉन-95-GFP कई परिपक्व मशरूम के आकार का वृक्ष के समान spines दिखा DIV15 पर,. बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें .
तालिका 1. बफर / मीडिया व्यंजनों.
| अभिकर्मक | अवयव |
| Glial मीडिया | 425 मिलीलीटर सदस्य 5 एमएल GlutaMAX 5 एमएल सोडियम पाइरूवेट, 100 मिमी 15 मिलीलीटर 20% ग्लूकोज 25 एमएल FBS (अंतिम 5%) 25 मिलीलीटर बछड़ा सीरम (अंतिम 5%) 5 एमएल पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन |
| 0.1M borate बफर | 2.48 ग्राम बोरिक एसिड 3.9 ग्राम सोडियम tetraborate (बोरेक्स) 800 मिलीलीटर milliQ H2O 8.5 NaOH के साथ पीएच बाँझ फ़िल्टर |
| चढ़ाना मीडिया | 425 मिलीलीटर सदस्य 5 एमएल GlutaMAX 5 एमएल सोडियम पाइरूवेट, 100 मिमी 15 मिलीलीटर 20% छlucose 50 मिलीलीटर FBS |
| NB27 मीडिया | 485 मिलीलीटर Neurobasal मीडिया 5 एमएल GlutaMAX 2 मिलीलीटर B27 पूरक (50x) |
| विच्छेदन बफर (बीएसएस) | 50 मिलीलीटर 10x HBSS 5 एमएल 1 एम HEPES, 7.3 पीएच 5 एमएल पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन 440 मिलीलीटर एच 2 हे |
| N2.1 मीडिया | 425 मिलीलीटर सदस्य 5 एमएल GlutaMAX 5 एमएल सोडियम पाइरूवेट, 100 मिमी 15 मिलीलीटर 20% ग्लूकोज सदस्य में 50 मिलीलीटर ovalbumin, 1% 5 एमएल एन 2 के पूरक |
| 2x HEPES buffered खारा (HBS), बाँझ | 274 मिमी NaCl 9.5 मिमी KCl 15 मिमी ग्लूकोज 42 मिमी HEPES 1.4 मिमी ना 2 4 HPO 3 अलग पीएच (7.05, 7.10, 7.15) के बैच तैयार |
| धो बफर (HEPES buffered खारा) | 50 मिलीलीटर 10x HBSS 5 एमएल 1 एम HEPES, 7.3 पीएच 445 मिलीलीटर एच 2 हे |
| 50 मिमी kynurenic एसिड | 1x पीबीएस में kynurenic एसिड की 0.473 ग्राम भंग. समाधान में इसे पाने के लिए NaOH की बूँदें जोड़ें. फिर 7.0 पीएच वापस समायोजित करने के लिए एचसीएल का उपयोग |
तालिका 2. संस्कृति तैयार करने के लिए समय रेखा.
| दिन | कार्रवाई |
| शुरू करने से पहले | Astrocyte संस्कृति को तैयार है और कोशिकाओं नीचे फ्रीज. Astrocyte संस्कृति का एक बैच आमतौर पर हिप्पोकैम्पस संस्कृतियों के कई महीनों का समर्थन कर सकते हैं. |
| सप्ताह 1 सोमवार | Astrocytes पिघलना. |
| सप्ताह 1 मंगलवार | Astrocytes फ़ीड. |
| 1 सप्ताह शुक्रवार | Astrocytes फ़ीड. |
| 2 सप्ताह सोमवार | Astrocytes फ़ीड. फिर 24 घंटे के लिए नाइट्रिक एसिड में लेना, एच 2 ओ में coverslips कुल्ला. |
| 2 सप्ताह मंगलवार | रिनएसई 5x coverslips. सूखी coverslips बाँझ. |
| 2 सप्ताह बुधवार | Coverslips पर आयल डॉट्स रखें. कोट पाली एल lysine साथ coverslips. |
| 2 सप्ताह गुरुवार | बाँझ एच 2 ओ में लेपित coverslips कुल्ला, तो 37 डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात मीडिया चढ़ाना में coverslips सेते NB27 को astrocytes पर मीडिया बदलें. |
| सप्ताह 2 शुक्रवार | हिप्पोकैम्पस के विच्छेदन और चढ़ाना. |
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Discussion
ध्यान से लगातार सफल transfections 10,11 के लिए नियंत्रित करने की आवश्यकता है कि कई महत्वपूर्ण पैरामीटर शामिल हैं. कैल्शियम फॉस्फेट अभिकर्मक के लिए सबसे महत्वपूर्ण पैरामीटर हमारे हाथ में आमतौर पर 7.10-7.15 के बीच होती है जो 2x HBS, का पीएच मान है. हम पीएच मीटर के बीच अंतर के लिए खाते में 0.05 वेतन वृद्धि में पीएच मान के साथ शेयरों की तीन बैचों बनाने की सिफारिश. वैकल्पिक रूप से, Clontech स्तनधारी अभिकर्मक किट लगातार अच्छा दक्षता है कि पैदावार 2x HBS प्रदान करता है. फ्रीजर में संग्रहीत भी जब समाधान के पीएच, समय के साथ बदल जाएगा कि ध्यान में रखें. हम आम तौर पर एक महीने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 2x HBS की aliquots रखना, और अप करने के लिए एक वर्ष के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर.
दूसरा पैरामीटर संस्कृति के माध्यम से पीएच है. इस संगत, N2.1 मध्यम रखने के लिए नियमित रूप से रात भर नहीं बल्कि अधिक से अधिक 24 घंटा astroglial संस्कृतियों पर वातानुकूलित हैं. इसके अलावा, हम astroglial संस्कृतियों वें इस्तेमाल करने की कोशिशपर confluency में समान हैं. glia वातानुकूलित मीडिया का उपयोग भी अभिकर्मक दौरान न्यूरॉन्स के लिए विषाक्तता को कम करने में मदद करता है. अभिकर्मक लगातार पीएच रखने के पहले वातानुकूलित मीडिया इनक्यूबेटर में equilibrated रहे हैं.
कैल्शियम फॉस्फेट अवक्षेप का आकार और घनत्व सफल अभिकर्मक के लिए महत्वपूर्ण है. बड़े, clumpy अवक्षेप आमतौर पर cytotoxicity 10 के लिए नेतृत्व करते हुए लघु अवक्षेप, कम अभिकर्मक दक्षता के लिए नेतृत्व करेंगे. डीएनए / 2 CaCl और 2x HBS 11 मिश्रण जब लगातार कैल्शियम फॉस्फेट वेग गठन सुनिश्चित करने के लिए, हम आंतरायिक vortexing का उपयोग करें. मिश्रण के लिए एक और आमतौर पर इस्तेमाल किया विधि एक पाश्चर पिपेट 12 का उपयोग करते हुए हवाई बुलबुले उड़ाने के माध्यम से है. हम विशेष रूप से अभिकर्मक मिश्रण की छोटी मात्रा के लिए, और अधिक सुसंगत वेग गठन उपज को रुक - रुक कर vortexing पाया है.
विचार करने के लिए अन्य चर डीएनए की गुणवत्ता, और न्यूरो की उम्र में शामिलएनएस. हम अभिकर्मक न्यूरॉन्स DIV2 पर पहुँचने पर लगातार काम शुरू पाते हैं कि, लेकिन, दक्षता न्यूरॉन्स DIV10 परे हैं जब गिरावट शुरू होता है. अंत में, neuronal संस्कृतियों को खुद के स्वास्थ्य के एक और महत्वपूर्ण पैरामीटर का प्रतिनिधित्व करता है. हम coculture प्रणाली का उपयोग स्वस्थ प्राथमिक hippocampal संस्कृतियों उत्पन्न करने के लिए सबसे अच्छा तरीका हो पाते हैं. न्यूरॉन्स स्वस्थ नहीं हैं, वे लंबे अभिकर्मक के बाद बच नहीं होगा. Coculture प्रणाली के साथ, कम घनत्व न्यूरॉन्स लंबे समय तक अध्ययन की सुविधा जो अभिकर्मक, बाद करने के लिए 3 सप्ताह के लिए जीवित रह सकते हैं.
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Disclosures
रुचि की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
इस काम एनआईएच अनुदान NS065183 और रटगर्स रॉबर्ट वुड जॉनसन मेडिकल स्कूल से शुरू हुआ धन के द्वारा समर्थित है.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dumont #5 forceps | Fine Science Tools | 11251-20 | |
| Fine scissors | Fine Science Tools | 14090-09 | straight / sharp 8.5 cm |
| Vannas-Tubinger spring scissors | Fine Science Tools | 15008-08 | angled / sharp / 8.5 cm / 5 mm cutting edge |
| Standard pattern forceps | Fine Science Tools | 11000-16 | |
| Student surgical scissors | Fine Science Tools | 91401-14 | blunt / 14.5 cm |
| Spring scissors | Fine Science Tools | 15006-09 | angled to side / 9 cm / 10 mm cutting edge |
| Isoflurane | Webster Veterinary | 14043-225-06 | |
| Poly-L-lysine | Sigma | P2636 | |
| MEM | Sigma | M2279 | |
| 100 mM Sodium pyruvate | Sigma | S8636 | |
| Glucose | Sigma | G8270 | |
| 10x HBSS | Sigma | H4385 | |
| 1 M HEPES, pH 7.3 | Gibco/Invitrogen | 15630-080 | |
| GlutaMAX | Gibco/Invitrogen | 35050-061 | |
| Neurobasal Media | Gibco/Invitrogen | 21130-049 | |
| B27 Supplement (50x) | Gibco/Invitrogen | 17504-044 | |
| N2 Supplement | Gibco/Invitrogen | 17502-048 | |
| Ovalbumin | Sigma | A5503 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco/Invitrogen | 15070-063 | |
| 2.5% Trypsin | Gibco/Invitrogen | 15090-046 | |
| DNase I | Sigma | DN-25 | |
| Cytosine arabinoside | Calbiochem/EMD Millipore | 251010 | |
| Kynurenic acid | Sigma | K3375 |
References
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