Summary
リン酸カルシウム沈殿法は、培養細胞のトランスフェクションのため便利で経済的な方法である。最適化により、一次ニューロンのような困難なトランスフェ細胞上で、この方法を使用することが可能である。ここでは、アストログリア細胞と共培養した海馬神経細胞のリン酸カルシウムトランスフェクションのための私達の詳細なプロトコルを記述します。
Abstract
リン酸カルシウム沈殿法は、培養細胞のトランスフェクションのため便利で経済的な方法である。最適化により、一次ニューロンのような困難なトランスフェ細胞上で、この方法を使用することが可能である。ここでは、アストログリア細胞と共培養した海馬神経細胞のリン酸カルシウムトランスフェクションのための私達の詳細なプロトコルを記述します。
Introduction
一次ニューロンは、それらが有糸分裂後で、微小環境の変化に非常に敏感であるようにトランスフェクトする最も困難な細胞タイプの一つである。これらの細胞1における外来遺伝子および短期ヘアピンRNA（shRNAの）の発現のための方法の4一般的に使用されるタイプがあります。それぞれ独自の長所と短所があります。細胞はトランスフェクションのためのキュベットに移しなければならないので、例えば、エレクトロポレーションは、通常、新たに単離されたニューロン2上で実行される。ウイルス感染は通常、非常に高い効率3を達成するが、事業者のためのより多くの労働集約的で危険であることができます。多くの脂質媒介トランスフェクション試薬は、ニューロンおよび細胞毒性の異なるレベルにおける成功の度合いは様々で、市販されている。
リン酸カルシウムトランスフェクションは、神経細胞に外来遺伝子を導入するための、便利で経済的な方法を表す。方法は、第一の哺乳類セルへのアデノウイルスDNAを導入するために使用されたグラハムとファンデEB（1973）によるLS 4。トランスフェクションは、リン酸緩衝液中の組換えDNAと塩化カルシウムを混合することにより行った。これは、徐々に細胞の単層上に滴下したとき、細胞表面に付着し、DNA /リン酸カルシウム沈殿物の形成は、エンドサイトーシスによって取り込まれることができ、最終的に核に5を入力してください。このプロセスは、標的細胞における導入外来遺伝子の発現につながる。 0.5〜5％、6〜8の間のリン酸カルシウムトランスフェクション範囲の典型的な効率。しかしながら、慎重な最適化および実験プロトコルの一貫性のある実行と、それは約50％のトランスフェクション効率を達成することができる。ここでは、サンドイッチフォーマット9にアストログリア細胞と共培養された初代海馬ニューロンのリン酸カルシウムトランスフェクション、私たちの詳細なプロトコルを記述します。
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Protocol
1。馴化培地およびアストロサイトニューロン共培養ラットアストロサイト培養物を調製。
- （BSSレシピについては表1を参照）解剖バッファを用意し、4℃で保存し、使用直前まで。
- 500ミリリットルのビーカー内のイソフルランで新生ラットの仔（P0-P2）を麻酔。
- 子犬が動かないときは、70％エタノールでスプレーし、首を切る。
- 脳を削除します。
- デュモン＃5ピンセットでしっかりと頭を保持し、皮膚や頭蓋骨を通して正中切開を作るために細かいハサミを使用しています。
- 側面に頭蓋骨を反射することによって、脳を公開、冷BSSを含む皿に脳を削除します。
- 解剖スコープの下で間脳および脳幹から大脳半球を分離する。慎重にピンセットの1組で組織を安定化させ、静かに鉗子の別のペアで髄膜を離れて引っ張ることで、すべての髄膜を除去します。
- すべての半球を収集IN 1 60mmディッシュ。できる限り細かく、ミンチ組織を小さなハサミを使用して。その後、50ミリリットルコニカルチューブにみじん切りの組織を移す。
- 脳に1％のDNase Iと2.5％トリプシンとBSSの12ミリリットル（15ミリリットルの全容量）の1.5ミリリットルの1.5ミリリットルを追加します。 37℃で15分間、振盪水浴中でインキュベート良好な混合を確実にするために、チューブを手で5分毎に旋回される。
- 新しい50ミリリットルコニカルチューブの上に70μmの細胞濾過器上清を移す。この上清に3ミリリットルFBSを追加します。
- 残りの部分に、13.5 BSSミリリットルと1.5ミリリットル、2.5％トリプシンを追加し、さらに15分間揺れ水浴中でインキュベートする。
- セルストレーナーを通して残りの上清を移し、ステップ1.8から上清を兼ね備えています。
- 細胞をペレットに5分間1,000 rpmで遠心分離します。
- グリアメディアの5ミリリットルに再懸濁ペレット。上清を残りの細胞をペレット化し、再び遠心分離することができる。
- 血球計数器を用いて細胞を数える。
- プレートCEL1×10 7センチあたり150 2フラスコの密度でLS。
- めっき後の新鮮なグリアメディアデーにメディアを変更します。その後、グリアメディアで週二回、細胞を養う。
- 細胞が> 80％の集密度（めっき後約10日）に達したときに、90％ウマ血清および10％DMSO中で細胞をダウン凍結し、液体窒素中で株式を保つ。細胞は、バイアル当たり2×10 6で凍結されています。約5バイアルを各フラスコから凍結することができる。
- 約10〜14日間の海馬の文化を設定する前に、グリア細胞は、凍結ストックから播種する。私たちは通常、海馬ニューロンの90カバーグラス（ウェル当たり3 15ミリメートルラウンドカバーガラス）の成長をサポートするのに十分である5 6ウェルプレートを、プレート。我々はまた、トランスフェクションのためのコンディショニングN2.1のメディアに使用されるグリア細胞の追加の八から十60ミリメートル料理をプレート。神経培養前日に、細胞がNB27の培地を供給する必要があります。アストロサイトは、理想的に目で> 90％コンフルエントであるべきポイントです。大幅に凍結するとアストログリア培養におけるミクログリアの数が減少していることを、私たちを見つける。ミクログリアは、アストログリア培養物中に存在する場合に増加した神経毒性が観察されているので、私たちは常に神経細胞との共培養のために凍結ストックから調製したアストログリアの文化を使用しています。
2。神経培養
- ミリQ水2Xの最初すすぐことによって清浄なガラス製カバースリップ。次いで、これらを24時間、濃硝酸に浸漬し、2時間の合計よりも少なくとも5回milliQ水ですすぐ。カバーガラスを6時間225℃のオーブンで焼成して乾燥し、滅菌する。
- 転送は、滅菌後60ミリメートル皿にカバースリップ。共培養の際にグリア細胞とは別の神経細胞を維持するために、各カバースリップの外側のエッジ付近の滅菌パラフィンの4ドットを配置します。
- 1ミリグラム/ 37℃インキュベーター内の0.1 Mホウ酸緩衝溶液中で一晩、ポリ-L-リシンでコートしたカバー。
- 次の日、無菌メートルで二度カバースリップを洗う少なくとも15分間ずつilliQ水。次いで、これらを37℃のインキュベーター中でプレート培地中で一晩インキュベートする。
- 気胸が続くイソフルラン麻酔による妊娠ラット（E18）を安楽死させると、断頭により胚性ラットを安楽死させる。脳を取り出して、上記のように大脳半球を解剖する。
- 大脳半球から海馬を解剖する。 15ミリリットルコニカルチューブにすべての海馬を置き、15分間37℃で0.25％トリプシン（0.5ミリリットル、2.5％トリプシン、4.5ミリリットルBSS）で消化する。
- 消化された海馬は、5分間ずつ、BSS 3Xですすぐ。次いで、それらをガラスパスツールピペットで磨砕し、細胞密度を血球計を用いて決定される。ニューロンを60 mmディッシュ当たり2×10 5細胞の密度で播種する。
- めっき後約2〜4時間後、転送がニューロンはグリアに向けて下向きにして、アストログリア細胞を含むディッシュに装着ニューロンとカバースリップ。 DIV3で、シトシンアラビノシドを追加5μmの最終濃度で細胞はグリア増殖を停止します。
3。カルシウムトランスフェクション
- グリアトランスフェクションの前日に、条件N2.1メディア。
- トランスフェクションの日に、グリアのオフエアコンN2.1メディアを取り、新たな皿に移す。転送はエアコンN2.1メディアへのニューロンとカバースリップ。 10月30日分間インキュベーター内で平衡化してみましょう。
- 滅菌チューブの1に設定するには、DNAの1-4μgを全量100μlのための2MのCaCl 2の12.5μL、及び滅菌H 2 Oを兼ね備えています。チューブの第二のセットに、2X HBSを100μlを加える。
- 数秒間毎回ボルテックス、 塩化カルシウム/ DNA混合物を含むチューブに一度2X HBSの⅛量（12.5μL）を追加します。チューブは15分間座ってすることができます。
- 15分のインキュベーション後、細胞にトランスフェクション混合物を滴下する。 1〜1.5時間インキュベートする。砂のような沈殿物の層が見えるはずです10×対物レンズを用いて顕微鏡下で。
- インキュベーション後、温かいHBS洗浄緩衝液で2回カバースリップをすすぐ。
- グリアとオリジナル料理にカバースリップを返し、最終濃度0.5mMにキヌレン酸を追加します。
- トランスフェクションしたニューロンは、ライブ画像化や、早くも次の日などの免疫細胞化学のために処理することができる。ニューロンは、トランスフェクション後3週間まで生き残ることができる。
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Representative Results
トランスフェクションの異なるパラメータを最適化し、注意深く実験毎に制御される場合には、50％までのトランスフェクション効率を得ることができる。 図1は DIV4でGFPでトランスフェクトされたニューロンのフィールドを示している。フィールドが16をトランスフェクトした、そのうち28ニューロンの合計が含まれています。これは、50％以上の効率を表しています。同じカバーガラス上の他のフィールドのサンプリング（データは示さず）全体の効率は50％前後であることを示している。アストログリア共培養システムでは、ニューロンは、健康を維持し、トランスフェクション後正常に発達。2は 10日、PSD-95-GFP構築物でトランスフェクション後、DIV15で海馬ニューロンを示しています。ニューロンは、ニューロンが健全であることを示している、非常に多くの成熟したキノコ型樹状突起棘を開発しました。高いトランスフェクション効率およびこのプロトコルの最小の毒性は、一次カバにおける遺伝子機能を研究するための貴重なツールになるcampalニューロン。最後に、このプロトコルは、潜在的に脳内のニューロンの他のタイプの培養物、ならびに他の困難なトランスフェクト細胞型をトランスフェクトするために適合させることができる。
図1。海馬ニューロンは、高いトランスフェクション効率を示し、DIV4のGFPをトランスフェクトした。分野で28のニューロンのうち16が陽性である。 拡大画像を表示するには、ここをクリックしてください 。
図2。 PSDをトランスフェクションした海馬ニューロン数々の成熟したキノコ型樹状突起棘を示すDIV15 AT-95-GFP。 拡大画像を表示するには、ここをクリックしてください 。
表1。バッファ/メディアレシピ。
| 試薬 | コンポーネント |
| グリアメディア | 425ミリリットルのMEM 5ミリリットルグルタ 5ミリリットルのピルビン酸ナトリウム、100mMの 15ミリリットルの20％グルコース を25ml FBS（最終5％） 25ミリリットル胎児血清（最終5％） 5ミリリットルペニシリン/ストレプトマイシン |
| 0.1Mホウ酸緩衝液 | 2.48グラムのホウ酸 3.9グラムの四ホウ酸ナトリウム（ホウ砂） 800ミリリットルミリQ H2O 8.5をNaOHでpH 濾過滅菌 |
| メッキメディア | 425ミリリットルのMEM 5ミリリットルグルタ 5ミリリットルのピルビン酸ナトリウム、100mMの 15ミリリットルの20％グラムlucose を50ml FBS |
| NB27メディア | 485ミリリットルニューロベーメディア 5ミリリットルグルタ 2ミリリットルのB27サプリメント（50X） |
| 解剖バッファー（BSS） | 50ミリリットル10倍のHBSS 5ミリリットルの1M HEPES、pHは7.3 5ミリリットルペニシリン/ストレプトマイシン 440ミリリットルのH 2 O |
| N2.1メディア | 425ミリリットルのMEM 5ミリリットルグルタ 5ミリリットルのピルビン酸ナトリウム、100mMの 15ミリリットルの20％グルコース MEM中50ミリリットルの卵白アルブミン、1％ 5ミリリットルN2サプリメント |
| 2X HEPES緩衝生理食塩水（HBS）、無菌 | 274のNaCl 9.5のKCl 15 mMグルコース 42のHEPES 1.4のNa 2 HPO 4 3異なるpH（7.05、7.10、7.15）のバッチを準備 |
| 洗浄バッファー（HEPES緩衝生理食塩水） | 50ミリリットル10倍のHBSS 5ミリリットルの1M HEPES、pHは7.3 445ミリリットルのH 2 O |
| 50 mMのキヌレン酸 | 1X PBS中キヌレン酸の0.473グラムを溶解する。溶液中にそれを得るためのNaOHの滴を追加します。再び7.0にpHを調整するために塩酸を使用する |
表2。培養の準備のためのタイムライン。
| 日 | アクション |
| 始める前に | アストロサイトの文化を作成し、セルを下に凍結。アストロサイトの文化の一つのバッチは通常、海馬培養の数ヶ月をサポートすることができます。 |
| 週1月曜日 | アストロサイトを解凍する。 |
| 週1火曜日 | アストロサイトを養う。 |
| 週1金曜日 | アストロサイトを養う。 |
| 週2月曜日 | アストロサイトを養う。 24時間硝酸に浸した後、H 2 O中カバーグラスを洗浄します。 |
| 週2火曜日 | RINSEカバースリップ5X。乾いたカバースリップを殺菌。 |
| 週2水曜日 | カバーガラス上のパラフィンドットを配置します。コートはポリ-L-リジンでカバースリップ。 |
| 週2木曜日 | 無菌H2Oでコートしたカバーガラスをすすぎ、その後、37℃で一晩メディアをメッキでカバースリップをインキュベートNB27にアストロサイト上のメディアを変更します。 |
| 週2金曜日 | 海馬解剖めっき。 |
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Discussion
慎重に、一貫して成功したトランスフェクション10,11のために制御する必要があるいくつかの重要なパラメータがあります。リン酸カルシウムトランスフェクションのための最も重要なパラメータは、我々の手で、通常7.10から7.15の間で変化する2×HBS、pH値である。私たちは、pH計との違いを説明するために0.05刻みでpH値を有する株式の3つのバッチを作るお勧めします。別の方法として、クロンテック哺乳類トランスフェクションキットは、一貫して良好な効率が得2X HBSを提供しています。冷凍庫で保存しても溶液のpHは、時間の経過とともに変化することに注意してください。我々は一般的に、最大1ヶ月間、-20℃で1年間まで、4℃で2X HBSの分量を保つ。
二番目のパラメータは、培地のpHである。この一貫性のある、N2.1媒体を維持するために定期的に一晩ではなく、24以上の時間アストログリアの文化を条件としている。加えて、我々は番目のアストログリアの文化を使用しようとするの集密度に似ています。グリア馴化培地の使用はまた、トランスフェクションの際に神経細胞への毒性を減らすことができます。馴化培地は、一貫性のpHを維持するために、トランスフェクション前に、インキュベーター内で平衡化する。
リン酸カルシウムの析出物の大きさ及び密度はトランスフェクションの成功への鍵である。大規模な、塊状の析出物は通常、細胞毒性10につながりながら、小さな析出物は、低トランスフェクション効率につながる。 DNA / CaCl 2および2×HBS 11を混合する際に一貫性のリン酸カルシウム沈殿物の形成を確実にするために、我々は、断続的にボルテックスを使用する。混合のための別の一般的に使用される方法は、パスツールピペット12を用いて空気の泡を吹き込みによるものである。我々は、特に、トランスフェクション混合物を少量のために、より一貫性の沈殿物の形成を得間欠ボルテックスを発見した。
考慮すべき他の変数は、DNAの質、および神経の年齢、NS。我々は、トランスフェクションは、ニューロンがDIV2に達したときに、一貫して作業を開始することがわかりますが、効率はニューロンがDIV10を超えているときに減少し始めます。最後に、神経細胞培養自身の健康はもう一つの重要なパラメータである。我々は、共培養システムの使用は、健康な一次海馬培養を生成するための最良の方法であることがわかりました。神経細胞が健康でない場合は、トランスフェクション後に長く生存しないであろう。共培養システムを用いて、低密度ニューロンは長期試験を容易にする、トランスフェクション後3週間まで生存することができる。
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Disclosures
興味の競合が宣言されていない。
Acknowledgments
この作品は、NIHの助成金NS065183とラトガースロバートウッドジョンソンメディカルスクールからの起動の資金によってサポートされています。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dumont #5 forceps | Fine Science Tools | 11251-20 | |
| Fine scissors | Fine Science Tools | 14090-09 | straight / sharp 8.5 cm |
| Vannas-Tubinger spring scissors | Fine Science Tools | 15008-08 | angled / sharp / 8.5 cm / 5 mm cutting edge |
| Standard pattern forceps | Fine Science Tools | 11000-16 | |
| Student surgical scissors | Fine Science Tools | 91401-14 | blunt / 14.5 cm |
| Spring scissors | Fine Science Tools | 15006-09 | angled to side / 9 cm / 10 mm cutting edge |
| Isoflurane | Webster Veterinary | 14043-225-06 | |
| Poly-L-lysine | Sigma | P2636 | |
| MEM | Sigma | M2279 | |
| 100 mM Sodium pyruvate | Sigma | S8636 | |
| Glucose | Sigma | G8270 | |
| 10x HBSS | Sigma | H4385 | |
| 1 M HEPES, pH 7.3 | Gibco/Invitrogen | 15630-080 | |
| GlutaMAX | Gibco/Invitrogen | 35050-061 | |
| Neurobasal Media | Gibco/Invitrogen | 21130-049 | |
| B27 Supplement (50x) | Gibco/Invitrogen | 17504-044 | |
| N2 Supplement | Gibco/Invitrogen | 17502-048 | |
| Ovalbumin | Sigma | A5503 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco/Invitrogen | 15070-063 | |
| 2.5% Trypsin | Gibco/Invitrogen | 15090-046 | |
| DNase I | Sigma | DN-25 | |
| Cytosine arabinoside | Calbiochem/EMD Millipore | 251010 | |
| Kynurenic acid | Sigma | K3375 |
References
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