Methoden zur Analyse und Modulation von NF-kappaB-abhängigen adulte Neurogenese

Summary

Methoden zur Manipulation und Analyse von NF-kB-abhängige erwachsene Neurogenese beschrieben. Ein detailliertes Protokoll für eine Gyrus dentatus abhängige Verhaltenstest (als das räumliche Muster trenn Barnes Labyrinth) zur Untersuchung der kognitiven Ergebnis in Mäusen dargestellt. Diese Technik sollte auch dazu beitragen, dass Untersuchungen in anderen experimentellen Einstellungen.

Abstract

Der Hippocampus spielt eine zentrale Rolle bei der Bildung und Konsolidierung des episodischen Erinnerungen und der räumlichen Orientierung. Historisch ist der Hippocampus als sehr statisch anatomischen Bereich des Gehirns von Säugetieren angesehen. Allerdings haben die jüngsten Ergebnisse zeigten, dass der Gyrus dentatus des Hippocampus ist ein Bereich von enormer Plastizität bei Erwachsenen, die nicht nur Änderungen der bestehenden neuronalen Schaltkreisen, sondern auch adulte Neurogenese. Diese Plastizität ist von komplexen Transkriptionsnetz reguliert, wobei der Transkriptionsfaktor NF-&kgr; B spielt eine herausragende Rolle. Um zu untersuchen und zu manipulieren, adulte Neurogenese, ein transgenes Mausmodell für Vorderhirn-spezifische neuronale Hemmung von NF-kappaB-Aktivität verwendet werden.

In dieser Studie werden Verfahren zur Analyse von NF-&kgr; B-abhängigen Neurogenese, einschließlich der strukturellen Aspekte, die neuronale Apoptose und Proliferation Vorläufer und kognitive Bedeutung whic beschriebenh wurde speziell über eine Gyrus dentatus (DG)-abhängigen Verhaltenstest, das räumliche Muster Trennung Barnes-Labyrinth (SPS-BM) bewertet. Die SPS-BM-Protokoll könnte einfach für die Verwendung mit anderen transgenen Tiermodellen, den Einfluss bestimmter Gene auf erwachsene Neurogenese beurteilen angepasst werden. Ferner könnte SPS-BM in anderen experimentellen Einstellungen auf die Untersuchung und Manipulation DG abhängigen Lern, beispielsweise mit pharmakologischen Mitteln gerichtet werden.

Introduction

Ontologisch ist der Hippocampus eine der ältesten bekannten anatomischen Hirnstrukturen. Es ist für verschiedene komplexe Aufgaben, wie z. B. Schwenk Funktionen bei der Regulation des Langzeitgedächtnisses, die räumliche Orientierung und die Bildung und Verfestigung des jeweiligen Speicher. Anatomisch, der Hippocampus besteht aus Pyramidenzellschichten (Stratum pyramidale), einschließlich der Ammonshorn (CA1, CA2, CA3 und CA4) Regionen und Gyrus dentatus (Gyrus dentatus), die Körnerzellen und neuronalen Vorläuferzellen ein paar in seinem Subgranularzone enthält . Die Körnerzellen ragen in Richtung der CA3-Region über den so genannten Moosfasern (Axone der Körnerzellen).

Bis zum Ende des letzten Jahrhunderts wurde die erwachsenen Gehirn von Säugetieren angenommen, dass ein statisches Organ fehlt zellulären Plastizität und Neurogenese sein. Doch in den letzten zwei Jahrzehnten eine wachsende Anzahl von Beweisen zeigt deutlich, adulte Neurogenese, die sich in mindestenszwei Gehirnregionen, die Subventrikularzone (SVZ) und der Subgranularzone des Hippocampus.

Unsere früheren Untersuchungen, und die der anderen Gruppen haben gezeigt, dass der Transkriptionsfaktor NF-&kgr; B ist eine der wichtigsten Regulatoren des Molekularneurogenese und daß seine Deregulierung führt zu schweren strukturellen Mängel hippocampalen und kognitiven Beeinträchtigungen ^1-6. NF-&kgr; B ist der generische Name eines induzierbaren Transkriptionsfaktor verschiedener dimerer Kombinationen von fünf DNA-bindenden Untereinheiten zusammengesetzt: p50, p52, c-Rel, RelB und p65 (RelA), letztere drei davon mit Transaktivierungsdomänen. Im Gehirn ist die häufigste Form im Zytoplasma ein Heterodimer von p50 und p65, die in einer inaktiven Form von Inhibitor-kappa-B (IkB)-Proteine ​​gehalten wird.

Um zu studieren und direkt manipulieren NF-kB-driven Neurogenese, verwenden wir transgene Mausmodelle, um einfache Hemmung der alle der NF-kB subun ermöglichenseine, insbesondere im Vorderhirn ⁷ (siehe Fig. 1). Zu diesem Zweck haben wir rassige überqueren die folgenden transgenen Mauslinien, IKB / - und -/tTA. Die transgene IKB / - Linie wurde mit einem trans-dominant negative Mutante von NF-kB-Hemmer IκBa (Super-Repressor-IκBa-AA1) erzeugt ^8. Im Gegensatz zu den Wildtyp-I &kgr; B, hat I &kgr; B-AA1 zwei Serin-Reste zu Alaninen (V32 und V36), das die Phosphorylierung und anschließenden proteasomalen Abbau des Inhibitors behindern mutiert. Für Vorderhirn Neuronen-spezifische Expression des IκBa-AA1-Transgen, IKB / - Mäuse mit Mäusen beherbergen eine Kalzium-Calmodulin-abhängige Kinase II &agr; gekreuzt (CAMKIIα)-Promotor, der durch Tetracyclin trans-Aktivator (tTA) angesteuert werden können ^9.

p65-Knock-out-Mäuse haben einen embryonalen letalen Phänotyp, wegen der massiven Leber Apoptose ^10, so dass die hier gezeigten Ansatz bietet eine elegante Methodefür die Untersuchung der Rolle von NF-kB in der postnatalen und adulten Neurogenese.

Die klassische Verhaltenstest, um räumliche Lern-und Gedächtnis Studie wurde in den 1980er Jahren von Richard Morris, einem Test, wie der Morris-Wasserlabyrinth (MWM) ¹¹ bekannt beschrieben. In diesem offenen Bereich Wasser-Labyrinth, Tiere lernen, von undurchsichtigen Wasser auf einer versteckten Plattform auf Basis von Orientierung und Extra-Labyrinth Hinweise zu entkommen. Eine trockene Variante MWM ist die sogenannte Barnes Labyrinth (BM) ^12. Dieser Test nutzt eine kreisförmige Platte mit 20 an der Grenze einer Platte angeordneten kreisrunde Löcher, mit einem Loch definiert als Flucht-Box, und visuelle Extra-Labyrinth Hinweise zur Orientierung. Beide experimentellen Paradigmen beruhen auf der Flugverhalten von einem Nagetier `s Abneigung gegen Wasser, oder offen, hell beleuchteten Räumen induziert. Beide Tests erlauben eine Untersuchung der räumlichen Orientierung, und die damit verbundene Gedächtnisleistung. Obwohl der Hippocampus spielt eine allgemeine und wesentliche Rolle in der räumlichen Gedächtnisbildung, die Hippocampus-regionen beteiligt unterscheiden sich je nach Test angewendet. Der Speicher BM getestet entsteht aus neuronalen Aktivität zwischen enthorinal Cortex (EC) und der Pyramidenzellen in der CA1-Region des Hippocampus angeordnet, ohne einen Beitrag der GD ^13-16. Insbesondere die klassischen BM stützt sich hauptsächlich auf die Navigation über die monosynaptischen temporo-Ammonium-Weg von EG III der CA1 EG V. Wichtig ist, dass die DG entscheidend an der sogenannten räumlichen Mustererkennung ^17, die nicht nur die Verarbeitung impliziert beteiligt visuelle und räumliche Informationen, sondern auch die Umwandlung von ähnlichen Vorstellungen oder Erinnerungen in unterschiedlichen, nicht überlappenden Darstellungen. Diese Aufgabe erfordert eine funktionale Tri-Synapsenschaltung von EC II DG CA3 zu CA1-und EC-VI, die nicht in der BM ¹⁵ getestet werden können.

Um diese Herausforderungen anzugehen, haben wir SPS-BM als Verhaltenstest entwickelt, um speziell zu testen Gyrus dentatus abhängige kognitive Leistung in Zusammenarbeitntrol Tiere, und in der IKB / tTA Super-Repressor-Modell folgende NF-KB-Hemmung. Wichtig ist, dass im Gegensatz zu der MWM oder der BM, die SPS-BM können subtile Verhaltensdefizite aus Wertminderungen der Neurogenese resultierenden offenbaren. Seit räumlich-Muster-Trennung ist strikt von einer Funktionsschaltung zwischen der EG und DG II und CA3 und CA1-und EC-VI, dieser Test ist sehr empfindlich auf mögliche Veränderungen in der Neurogenese, Modifikationen der Moosfaser-Weg oder Veränderungen der Gewebe-Homöostase innerhalb der DG.

Technisch gesehen ist der Aufbau der Test auf die Studie von Clelland et al., Wobei die räumliche Trennung Muster wurde unter Verwendung eines Holz 8-Arm-Radiallabyrinth (RAM) ¹⁹ geprüft. In unserer modifizierten Set-up wurden die acht Arme von sieben identische gelbe Lebensmittelhäuser ersetzt. Zusammenfassend hier gezeigten Methoden, einschließlich der Analyse der Double-exprimierenden (DCX +) Zellen im Hippocampus, die Moosfaser-Projektionen, neuronale Zell death und insbesondere die SPS-BM hier vorgestellten, können die Untersuchungen auf andere Modelle mit Transgene Maus, die einen Einfluss auf die adulte Neurogenese haben, angewendet werden. Weitere Anwendungen können die Studie von pharmakologischen Mitteln und die Messung ihrer Auswirkungen auf DG und räumliche Muster Trennung gehören.

Protocol

Ethik-Erklärung

Diese Studie wurde in strikter Übereinstimmung mit den Vorschriften der staatlichen Tierpflege und Verwendung Ausschuss LANUV des Landes Nordrhein-Westfalen, (Düsseldorf, Deutschland) durchgeführt. Alle Tierversuche wurden von LANUV, Düsseldorf unter der Lizenznummer 8.87-51.04.20.09.317 (LANUV NRW) zugelassen. Alle Anstrengungen wurden unternommen, um Not und die Anzahl der Tiere für die Studie zu minimieren.

1. Tierpflege-und Wohnungswesen

1. Alle Tiere, die in den hier beschriebenen Protokolle verwendet werden, sollten unter bestimmten erregerfreien Bedingungen gehalten werden, wie von der Europäischen Föderation für Versuchstierkunde (FELASA) definiert.
2. Mäuse sollten in Standardkäfigen in einer Temperatur-und Feuchte-kontrollierten (22 ° C) Zimmer unter Tagesbedingungen (12 Stunden Licht / Dunkel-Zyklus) gehalten werden, mit HEPA-gefilterte Luft.
3. Standardisierte Nahrung und Wasser zur Verfügung gestellt werden sollte ad libitum. </ Li>
4. Wenn IKB / tTA und IKB / - Kontroll-Mäusen verwendet werden, sollten PCR-basierte Genotypisierung für jedes Tier durchgeführt werden, wie in ^{7, 18} beschrieben.
5. Männliche Tiere mit einem Altersunterschied von weniger als vier Tage sollte verwendet werden, um individuelle Unterschiede zu verringern.
6. (Optional): Für die NF-kB-Reaktivierung Experimente, Doxycyclin muss im Trinkwasser (mit 2,5% Saccharose 2 mg / ml) für mindestens 14 Tage verabreicht werden.

2. Räumliche Muster-Trennung Barnes Maze (SPS-BM)

1. Alle Verhaltenstests sollte nach den internationalen und lokalen Richtlinien durchgeführt werden.
2. WICHTIG! Verwenden Sie nur männliche Mäuse mit einem Alter von sechs Monaten oder älter. Der Altersunterschied zwischen den Tieren einer Versuchsreihe sollte weniger als vier Tage. Die Prüfung muss vom selben Betreiber für jede Reihe durchgeführt werden. Die Mäuse sollten eine Standard-Diät vor der Tests, die Motivation teilweise als angetriebene weiter steigernweet Futterbelohnung.
3. Eine weiße, runde Platte aus hartem Kunststoff Set (Durchmesser 120 cm, siehe Abbildung 5A) in einer feuchten und temperierten Raum (22 ° C), mit mindestens 4 x 80 W und 3 x 215 W Neon-Leuchtstofflampen beleuchtet . WICHTIG! Achten Sie darauf, die richtige Beleuchtung verwendet, wie die Motivation der Mäuse, die Lebensmittel Häuser geben wird teilweise durch ihre Abneigung gegen helle, exponierten Stellen angetrieben.
4. Stellen Sie den Video-Tracking-System. Die Kamera sollte 115 cm über dem Zentrum der Platte (siehe Fig. 5A) gespeichert.
5. Bringen bunten Extra-Labyrinth Cues (EMV) zu einem weiß-farbigen Tuch in den Positionen für die Tiere, ca. 100 cm von der Grenze der Platte (siehe Abbildung 5A) gut sichtbar.
6. Die Platte sorgfältig reinigen mit einem Schnelldesinfektionsmittel, die jeden Geruch aus dem Versuchsaufbau entfernen können.
7. Zeigen sieben identische gelbe Lebensmittelhäuser (12 cm x 7 cm x 8 cm, siehe Abbildung 5A Abbildung 5A).
8. Zeigen süße Speisen Pellet Belohnungen (ein Viertel Kellogs `s Froot Loop / Essen Haus) in allen Lebensmittelhäuser auf definierten Positionen (siehe Abbildung 5A) mit nur einem definierten Lebensmittel Haus frei zugänglich für das Tier (Standort F, siehe Abbildung 5A ). Schließen Sie die Nicht-Ziel-Lebensmittel Häuser mit transparenter Folie.
9. Vor dem Test, führen Gewöhnung (ein Tag vor dem Start der Aufgabe). Machen alle Lebensmittel Häuser frei zugänglich und ermöglichen die Mäuse, um das Labyrinth zu erkunden und frei, um eine Futterpellet Belohnung (10 min / Tier) abzurufen.
10. Schalten Sie den Computer und die Kamera ein und starten Sie das Video-Tracking-System-Software.
11. Starten Sie die Aufnahme.
12. Legen Sie das Tier an der definierten Startpunkt auf der kreisförmigen Platte (Abbildung 5A, S: Startposition) und lassen die Mäuse für die Ziellebensmittelhaus für 10 min suchen.
13. Stop das Video-Tracking-Systems.
14. WICHTIG! Reinigen Sie den kreisförmigen Platte und die Lebensmittel Häuser nach jedem Versuch mit Schnelldesinfektionsmittel.
15. Wiederholen Sie den Test täglich für sieben aufeinander folgende Tage (pro Tier).
16. Analysieren Sie die Ergebnisse (überdachte Wartezeit, Entfernung und Fehler) mit geeigneten Statistik-Software. Fehler definieren als Annäherung an die falsche Nahrung Haus und / oder Kontakt mit der richtigen Box ohne Eingabe und Abruf der Futterpellet Belohnung. Für gruppiert Analyse zu verwenden Zwei-Wege-ANOVA mit Bonferroni Post-hoc-Test.
17. (OPTION) opfere die Mäuse und analysieren die hippocampi wie unten beschrieben.

3. BrdU-Labeling

1. Injizieren intraperitoneal 50 mg / kg ip BrdU einmal täglich über 3 Tage (Analyse der Differenzierung und Integration) oder 200 mg / kg ip eine einzige Injektion (Analyse der Proliferation).
2. Opfere die Tiere sezieren den Hippocampus und bereiten 40 um Abschnitte wie unten beschrieben.
3. Denaturieren dieAbschnitte mit 2 M HCl für 10 min inkubieren in 0,1 M Borat-Puffer für 10 min.
4. Label eine eins zu zwölf Reihen von 40 &mgr; m-Schnitte (240 &mgr; m Abstand) von jedem Tier immunhistochemisch, wie nachstehend unter Verwendung von Antikörpern gegen BrdU gerichtet beschrieben.
5. Quantifizierung der markierten Zellen durch konfokale Mikroskopie Analyse der gesamten rostrokaudalen Ausmaß der Körnerzellschicht und Subgranularzone. Multiplizieren Sie die daraus resultierenden Zahlen durch 12, um die geschätzte Gesamtzahl der BrdU-markierten Zellen pro Hippocampus und durch zwei teilen zu erhalten, um die Gesamtzahl der markierten Zellen pro DG erhalten.

4. Die Entfernung der Gehirne und Herstellung von Gefrierschnitte von nicht-perfundierte Tiere

1. Beachten lokal zugelassene Verfahren für euthanizing Tiere. Mäuse können direkt durch zervikale Dislokation getötet werden.
2. (OPTION) Die Tiere können vor euthanization nach lokalen und internationalen Richtlinien betäubt werden, zB durch intraperitoneale injektion von 0,8 ml Avertin für eine 33 g-Maus (frisch durch Mischen von 150 ml Stammlösung von 2,2 mg 2,2,2-Tribromethanol in 1 ml Isoamylalkohol Ethanol mit 1,85 ml Kochsalzlösung oder physiologische Puffer gemacht).
3. Sterilisieren Sie den Kopf mit Betadine (10% PVP-Jod)-getränkten Gaze und anschließend mit Gaze-Tupfer in 70% Ethanol getränkt.
4. Enthaupten, das Tier mit Hilfe geeigneter chirurgische Scheren und ziehen Sie die Haut beiseite.
5. (OPTION) Fixateure kann angewendet werden, um zu vermeiden, Zurückklappen der Haut verzögert.
6. Machen Sie eine Mittellinienschnitt in den Schädel und die Schädelfragmente vorsichtig beiseite zu ziehen.
7. Entfernen Sie vorsichtig das gesamte Gehirn mit einem entsprechenden chirurgischen Instrument (zB Moria Löffel).
8. Vorkühlen 25 ml 2-Methyl in einem 50 ml-Becherglas (z. B. Schott Duran) auf -30 bis -40 ° C auf Trockeneis.
   Hinweis: Für die frei schwimmende Färbung der "dicke" Abschnitte, die sich ideal für die konfokale Laserscanning-Mikroskopie geeignet sind, entfernen Gehirn, waschen 3Mal in Puffer und bei 4 ° C in phosphatgepufferter 30% Saccharose-Lösung in 50-ml-Tube, bis Gehirn hat sich nach unten (in der Regel über Nacht) versenkt.
9. Vorsichtig Gehirn auf ein Stück Nescofilm (Parafilm) und decken mit reichliche Menge an TissueTek OCT-Verbindung, gefrier auf Nescofilm in 2-Methyl, Lagerung bei -80 ° C bis zur Verwendung.
   Hinweis: Für die Langzeitlagerung bei -20 ° C lagern in 9% Saccharose, 7 mM MgCl _2, 50 mM Phosphat-Puffer, 44% Glycerin.
10. Schneiden Sie das Gehirn in 10-12 um dicke Schnitte auf geeigneten Kryomikrotom.
    Hinweis: Für dicke, frei schwebenden Abschnitte, gefrier Gehirn auf Kryotom Stufe der entsprechenden Kryotom (z. B. Reichert Jung, Frigomobil.) Und schneiden 40 um horizontale Schnitte bei -20 ° bis - 25 ° C. Sammeln Schnitte von Messer mit feinem Pinsel und sammeln sich in Puffer oder halten Sie im Storage-Lösung (Schritt 4.9) bei -20 ° C für Langzeit-Lagerung.
11. Vorsichtig aufsetzen zwei Scheiben auf Einzelobjektträger. Die unse von Superfrost Objektträger Ultraplus ist sehr zu empfehlen, um die Haftung der Abschnitte zu maximieren.
12. Trocknen der Objektträger für 5 min bei Raumtemperatur. Objektträger können bei -80 ° C bis zur Verwendung gelagert werden.

5. Vorbereitung der Abschnitte aus perfundierten Tiere

1. Anesthetize die Tiere, wie oben (Schritt 4.2) beschrieben.
2. Das Tier sorgfältig durchströmen transkardial mit phosphatgepufferter Salzlösung (PBS), enthaltend Heparin (0,025 g/100 ml PBS) und Procain (0,5 g/100 ml PBS) für 2-4 Minuten, gefolgt von 4% Paraformaldehyd in PBS für 10-15 min . Die Perfusion wird optimal durch Perfusion über die linke Herzkammer und die Öffnung des rechten Vorhofs mit einem hydrostatischen Druck von ca. 1,2 bis 1,4 m oder Verwendung einer Schlauchpumpe auf ca. 15 ml / min durchgeführt. Optimale Durchblutung führt zu einem blassen weißen Gehirn mit keine roten Blutgefäße sichtbar sind.
3. Präparieren und Post-fix die Gehirne in 4% Paraformaldehyd bei 4 ° C für 24 Stunden.
4. Cryoschützen die Gehirne in 30% Saccharose in PBS bei 4 ° C für mindestens 24 Stunden.
5. Frieren Sie die Gehirne auf der Kryotom Bühne.
6. Bereiten 40 um horizontale Abschnitte von gesamten Vorderhirn mit einem geeigneten Kryotom.
7. Die Folien können in Kälteschutzlösung (0,1 M Phosphat-Puffer, 50% Glycerin, 0,14% MgCl _2, 8,6% Saccharose) bei -20 ° C bis zur Verwendung gelagert werden.

6. Immunhistochemie von Hirnschnitten von nicht-perfundierte Tiere

1. Post-Fixierung der Gefrierschnitte, die wie oben beschrieben, mit -20 ° C kaltem Methanol für 10 min.
2. Blockieren mit 5% normalem Serum, enthaltend 0,3% Triton-X (aus der Art, die zum Anheben der sekundäre Antikörper verwendet wurde) über Nacht bei 4 ° C.
3. 3x Spülen mit 1x PBS und Inkubation mit primären Antikörpern über Nacht bei 4 ° C
4. Spülen 3x mit 1x PBS und Inkubation mit sekundärem Antikörper bei Raumtemperatur für eine Stunde.
5. Mit 1x PBS spülen 3x
6. Counterstain Abschnitt für die DNA mit SYTOX grün oder DAPI (oder eine alternative DNA-Farbstoff).
7. Mit 1x PBS spülen 3x
8. Betten Sie die Abschnitte in einer wässrigen Einbettmedium.
9. Lassen Sie das Einbettungsmedium polymerisiert mindestens 48 Stunden.

7. Immunhistochemie von Hirnschnitten von perfundierten Tiere

1. Sperren, wie in Schritt 6.2 beschrieben und anschließend bebrüten die feste Gehirnschnitte in der Primärantikörperlösung in PBS mit 0,3% Triton-X (frei schwebend) über Nacht bei 4 ° C
2. Dreimal mit 1x PBS spülen und Inkubation in sekundären Antikörperlösung in PBS mit 0,3% Triton-X (frei schwebend) bei Raumtemperatur für 3 h verdünnt.
3. Mit 1x PBS spülen 3x
4. Gegenfärbung der für die DNA-Abschnitt mit SYTOX grün oder DAPI (oder eine alternative DNA-Farbstoff).
5. Dreimal mit 1x PBS spülen
6. Betten Sie die Abschnitte in einer wässrigen Einbettmedium.
7. Lassen Sie den Einbettungsmedium polymerisieren für eint mindestens 48 Stunden.

8. Untersuchung der Moosfaser Projektionen

1. Opfere die Tiere, bereiten 40 um koronalen Abschnitte wie oben beschrieben und Flecken auf der Hippocampus-Abschnitt unter Verwendung von Antikörper für Neurofilament M.
2. Scannen Sie die Abschnitte bei der geeigneten Wellenlänge mit einem konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop Moosfasern und Zellkerne sichtbar zu machen. Starten Sie den Scan bei geringer Vergrößerung.
3. Verwenden Sie die Bilder mit geringer Vergrößerung für die Orientierung und Ziel der Hippocampus mit Moosfaser-Projektionen.
4. Scannen Sie die Abschnitte (z-Schnitte) mit hoher Auflösung und hoher Vergrößerung.
5. Analysieren Sie die morphologische Erscheinungsbild und Konnektivität der über Färbung für NF-M visualisiert Moosfasern.
6. (OPTION) Analysieren Sie die Größe und das Volumen der Hippocampus-Blades. Verwenden Sie die DNA-Signal für die Messungen.

9. Fluoro-Jade-C Gehalt (Neuronal Cell Death)

1. Opfere die Tiere sezieren die hippocampus und bereiten 12 &mgr; m-Schnitte, wie oben beschrieben.
2. Lassen die Abschnitte Trocknen für 30 Minuten bei Raumtemperatur.
3. Beheben die Abschnitte in 4% PFA für 40 min bei Raumtemperatur.
4. Kurz waschen die Schnitte 3x mit ddH ₂ O.
5. 10 min Inkubation der Schnitte mit 0,06% Kaliumpermanganat (KMnO ₄₎ unter ständigem, leichtem Schütteln.
6. Waschen Sie die Schnitte 3x mit ddH ₂ O.
7. Inkubieren der Schnitte mit 0,002% Fluoro-Jade C-Lösung für 20 min bei Raumtemperatur.
8. (Optional) für die gleichzeitige Kernfärbungen, 0,002% Fluoro-Jade-C-Lösung mit 10 ug / ml DAPI ergänzt werden.
9. Kurz waschen die Schnitte 3x mit ddH ₂ O.
10. Lassen die Abschnitte Trocknen für 30 Minuten bei Raumtemperatur.
11. Inkubieren der Schnitte mit Xylol (1 min)
12. Montieren Sie die Teile mit einem Xylol-basierten Montagemedium (DPX).

Representative Results

Kreuzung der I &kgr; B / - und tTA transgene Mauslinien zu bedingte Inhibition von NF-&kgr; B-Aktivität im Hippocampus.

Um die Expression des I &kgr; B &agr;-AA1-Transgens in der transgenen Mausdoppel (1A) zu untersuchen, wurden Gehirn isoliert, kryogeschnitten und gefärbt mit einem Antikörper gegen GFP (green fluorescent protein). Die konfokale Laserscanmikroskopie zeigte eine hohe Expression des Transgens in der CA1-und CA3-Regionen und in der DG (Abbildung 1B).

Die I &kgr; B-AA1-Transgen in Art-2b Vorfahren ausgedrückt und ist in der Zwischen unreifen Staaten und in reifen Körnerzellen aktiv.
Um die ersten Zelltyp die CAMKIIα getriebenen I &kgr; B-AA1 ausdrückt in der Hippocampus-neurogene Region zu bestimmen, wurden Gefrierschnitte von hippocampi von IKB / tTA Tiere für Double gebeizt(DCX) und das Transgen (GFP). Konfokale Analyse ergab GFP-Signale in jungen DCX-positiven Körnerzellen, was die Induktion der Expression des Transgens durch CAMKIIα-Aktivität (Fig. 2 Pfeile).

Neuronale NF-KB-Hemmung über I &kgr; B-AA1 reduziert Moosfaserprojektionen und die Dicke und Volumen der DG.

Koronalen Abschnitte des Hippocampus von IKB / tTA und IKB-/ - Mäuse wurden für Neurofilament M (NF-M) gefärbt, um die Moosfaser-Projektionen visualisieren und zeigen komplexe und faszikulären Organisation (Abbildung 3). In IKB / tTA Mäusen wurden die Moosfaser-Projektionen stark beeinträchtigt. Darüber hinaus führte die NF-&kgr; B-Inhibierung zu einer deutlich reduzierten suprapyramidal Blattdicke und einem kleineren Volumen DG (Fig. 3B).

Neuronale Inhibierung der NF-&kgr; B in I &kgr; B / tTA-Mäusen führt zu erhöhter neuronaler Degenerationmenarbeit erhöhte Neurogenese und eine gestörte Migration der DCX-exprimierenden Vorläuferzellen.

Um die möglichen Gründe für die dramatische strukturelle Defekte, frisch zu untersuchen, wurden nicht fixierten Hippocampus von IKB / tTA Mäusen mit Fluoro-Jade-C, die den spezifischen Nachweis von neuronalen Zelltod (4A) ermöglicht gefärbt. Hier wurden eine dramatisch gestiegene Zahl der degenerierenden Neuriten in doppelt transgenen Tieren beobachtet, verglichen mit einzelnen transgenen Kontrollen. Darüber hinaus wurde eine signifikante Erhöhung der Caspase-3 gespalten positiven apoptotischen Zellen in I &kgr; B / tTA-Mäusen nachgewiesen. Dagegen immunhistochemische Färbung gegen DCX zeigte signifikant erhöhte Mengen DCX +-Zellen in den Gehirnen von I &kgr; B / tTA-Mäusen. Außerdem DCX + Zellen in IKB / tTA-Hippokampi nicht ausschließlich in der Subgranularzone angeordnet, wurden aber auch in den tieferen Regionen der DG (4B) gefunden, während die DCX +-Vorläuferzellen in die Kontrolltiere wurden fast ausschließlich im Subgranularzone lokalisiert. Zu testen, ob der erhöhte Umfang der DCX-exprimierenden Zellen ist ein Ergebnis der Reifung von früheren Vorläufern oder direkt durch Proliferation von DCX + Zellen wurde BrdU in die Hippocampus von I &kgr; B / tTA und Kontrollmäusen, die dann kryogeschnitten und DCX gefärbten injiziert und BrdU (Abbildung 4). Für die Analyse der Proliferation, wurde BrdU einmal injiziert (siehe Abbildung 4B Schema), gefolgt von einer Analyse nach 24 Stunden. Für die Analyse der Differenzierung, drei Injektionen wurden täglich durch die Analyse nach sieben Tagen durchgeführt, gefolgt. Nach einer Einzel BrdU-Injektion wurden keine signifikanten Unterschiede in der Gesamtzahl der BrdU-positiven Zellen zwischen IκB/tTA- und Kontrolltieren beobachtet, während die drei seriellen Injektionen-Ansatz ergab eine deutlich erhöhte Menge an BrdU / DCX + Zellen in der DG von IKB / tTA Mäusen. Dies zeigt, dass gestörte Differenzierung oder Integration von DCX-exDrücken Zellen können die erhöhte Anzahl von DCX + Zellen verursacht haben, und schlägt vor, dass Typ-3-Zellen beteiligt waren.

Neuronale Hemmung von NF-kB führt zu schweren Defekten lernen, wie das räumliche Muster Trennung Barnes Maze-Test gezeigt. Um das Verhalten der doppelt transgenen Mäuse in einer DG-abhängige Aufgabe gezielt zu testen, die SPS-BM, haben wir denen Tiere müssen zwischen Orten mit subtilen Unterschiede (Abbildung 5) zu differenzieren. In diesem Verhaltenstest, die I &kgr; B / - Kontrolltiere untersucht die Lebensmittel Häuser seriell am ersten Tag des Experiments (Abbildung 5). Nach sieben Tagen der Ausbildung, wurden die Tiere in der Lage, die offene Lebensmittel Haus direkt zu finden. Dagegen sind die IKB / tTA Tiere weiterhin die Lebensmittel Häuser seriell zu erkunden, auch nach der Ausbildung (Abbildung 5B). Die Beobachtung von signifikanten Anstieg in den zurückgelegten Strecken und höhere Latenzen und error Raten in den IKB / tTA Tiere, verglichen mit der IKB / - Kontrolltieren, legt nahe, dass diese Tiere hatte schwere Mängel Lernen (Abbildung 5C).

Fig. 1 ist. Erzeugung eines bedingten Vorderhirn-spezifische Inhibierung der NF-&kgr; B-Aktivität. A. Schematische Zeichnung der transgenen Modellen zur Untersuchung der Rolle von NF-&kgr; B in der Erwachsenenneurogenese eingesetzt. Calcium-Calmodulin-abhängigen Kinase II &agr; (CAMKIIα) Promotor getriebene Tetracyclin-Transaktivator (tTA)-Mäuse wurden verwendet, um die Expression des trans-dominant-negative Mutante IκBa (IκBa-AA1 super-Repressor in Mäusen I &kgr; B) in Kombination mit einem grün fluoreszierenden Protein regulieren Tracer (GFP). In I &kgr; B / tTA-Mäusen wird NF-&kgr; B im Zytoplasma in seiner inaktiven Stationen gehaltente von nicht abbaubaren IκBa-AA1, die über GFP-Fluoreszenz nachgewiesen werden können. Die Hemmung kann durch Doxycyclin, die tTA. B. Repräsentative Transgen-Expression in verschiedenen Hippokampus-Regionen der IKB / tTA Mäusen (CA1, CA3 und DG) hemmt umgekehrt werden. Gefrierschnitte wurden aus isolierten Gehirne von IKB / vorbereitet - und IKB / tTA Mäusen und wurden fixiert und gefärbt mit einem Antikörper gegen GFP. Beachten Sie, dass das Transgen stark innerhalb der GD ausgedrückt. De: Dendriten DG: Gyrus dentatus, ML: Molekularschicht; SL: Stratum lucidum. Klicken Sie hier für eine größere Ansicht.

2. Die IκBa-AA1 Transgen ausgedrückt DCX-positiven, Typ-2b progenit ors und ist in weiteren Zwischenzustände und in reifen Körnerzellen aktiv. A. kryogeschnitten hippocampi von IKB / tTA Tiere mit Double (DCX) Färbung und GFP-Expression zeigen Expression des Transgens in jungen DCX-positiven Körnerzellen (Pfeile). DG: Gyrus dentatus, ML: Molekülschicht B. Schematische Darstellung der Transgen-Expression in verschiedenen Entwicklungsstadien während der Körnerzellentwicklung.. IκBa-AA1-Transgen-Expression wurde in den DCX-positiven, Typ-2b-Vorläufer, alle Zwischen unreifen Staaten und in reifen Körnerzellen nachgewiesen. Dagegen hat früh Typ-1-und Typ-2a-Vorläufern (fehlt DCX-Ausdruck) nicht das Transgen exprimieren, und wurden daher nicht von NF-KB-Hemmung betroffen. Modifiziert nach Kempermann et al. ^20. Klicken Sie hier für eine größere Ansicht.

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3. NF-KB-Hemmung führt zu einer Beeinträchtigung der Moosfaser-Projektionen und einer reduzierten DG Dicke und Volumen in IKB / tTA Mäusen, im Vergleich zu einzelnen transgenen Kontrolle (IKB / -). A. Immunfärbung von kryogeschnitten hippocampi für Neurofilament M (NF-M) Moosfaser-Projektionen visualisieren. In Kontrollmäusen (I &kgr; B / -), einen komplexen und faszikuläre Organisation Moosfasern Verbindungskörnerzellen in die Zielzellen in CA3 ist ersichtlich, welche nach neuronaler Inhibierung der NF-&kgr; B in I &kgr; B / tTA-Mäusen beeinträchtigt wurde. Darüber hinaus Ausdruck der Super-Repressor führte zu einem deutlich reduzierten suprapyramidal Blattstärke (vgl. Pfeil in der linken und rechten Bild) und einer verminderten DG Lautstärke. B. Quantifizierung und statistische Analyse von Strukturdefekten von NF-kB-Hemmung. Ungepaarten t-Test, zweiseitig. Daten aus dem OA-Version Imielski et al. ² Klicken Sie hier für eine größere Ansicht.

4. Hemmung von NF-&kgr; B in I &kgr; B / tTA-Mäusen führt zu neuronalem Zelltod, Neurogenese verbessert und eine gestörte Migrationsmuster DCX-exprimierenden Zellen erhöht. A. Neuron-spezifischer Fluoro-Jade C-Färbung und eine erhöhte Anzahl von gespaltenen Caspase-3-positiven Zellen in Hippocampusschnitten zeigt eine höhere Zelltod in I &kgr; B / tTA-Mäusen als in den I &kgr; B / - Kontrollen. Degenerieren Neuriten sind durch Pfeile markiert und Kerne sind durch * gekennzeichnet. Rechts Website: Quantifizierung der gespaltenen Caspase-3-poempfindlichen Zellen im Hippocampus schlägt hoch in doppelt transgenen Tieren erhöhte Apoptose. B. Anfärbung von Gefrierschnitten für hippocampale DCX zeigt eine erhöhte Anzahl von DCX-exprimierenden Zellen in den doppelt transgenen Tieren. Beachten Sie, dass DCX +-Zellen in I &kgr; B / tTA-Hippocampus nicht ausschließlich im Subgranularzone angeordnet, jedoch wanderten tiefer in die GD als in der I &kgr; B / -. Steuer C. Linke Seite: Um den Einfluss des Transgens auf die Proliferation zu testen, wurde ein einziger BrdU-Injektion durchgeführt, die keine signifikanten Unterschiede in der Anzahl der BrdU-positiven Zellen zwischen IKB / tTA und Kontrollen Rechte Tafel geführt:. Statistische Auswertung ergab eine signifikante Erhöhung der DCX-exprimierenden Zellen in IKB / tTA Tiere nach drei täglichen BrdU-Injektionen. Die Analyse wurde sieben Tage nach der letzten Injektion (Prüfung der Differenzierung und Integration) durchgeführt. Ein signifikanter Anstieg der BrdU / DCX + wurde in der DG I erkannt&kgr; B / tTA-Mäusen (n = 3). Daten teilweise von der OA-Version Imielski et al. ² aufgenommen Klicken Sie hier für eine größere Ansicht.

5. Aufbau und typische Ergebnisse der räumlichen Muster Trennung Barnes-Labyrinth (SPS-BM). A. Links: Schematische Darstellung des experimentellen Aufbaus. Sieben identische Lebensmittel Häuser (gleiche Farbe, Größe und Form) wurden symmetrisch auf definierten Spots einer Runde, hausgemachte Platte aus Hart inerten Kunststoff (Durchmesser 120 cm) gebaut wurden, mit einem freien Fleck (Ausgangspunkt, S). Bunte Extra-Labyrinth Cues (EMV) sind vor einem weiß-farbigen Tuch in den Positionen leicht zu den Tieren, ca. 100 cm von der b sichtbar angebrachtUm der Platte. Um die Orientierung durch Geruch zu vermeiden, sind Futterpellets in jedem Haus hinterlegt, aber nur eine Lebensmittelhaus zugänglich ist (Schließung von transparenter Folie). Rechts: Video-Kamera konzentriert sich auf die Platte (Abstand zur Platte: 115 cm) und einem Foto des Set-up inklusive der Extra-Irrgartens B. Typische experimentelle Ergebnis einer SPS-BM-Test.. Die IKB / - Kontrolltier untersucht die Lebensmittel Häuser seriell am ersten Tag der Testreihen und die offene Lebensmittel Haus ist sofort nach sieben Tagen Training gefunden. Im Gegensatz dazu IKB / tTA Mäusen zeigen schlechtere Lernen, wie von Serien Exploration auch nach der Trainingsphase C. Vergleich der Parameter in der SPS-BM in IKB / gemessen gezeigt -. IKB und / tTA Tiere. Doppelt transgenen Mäusen signifikante Gedächtnisstörungen (n = 9) im Vergleich zu den Kontrollen (n = 8) in Bezug auf Latenzzeit, zurückgelegte Strecke und die Fehlerrate. Zwei-Wege-ANOVA Bewertung, Fehlerbalken: SEM. Daten in B undC wurden aus dem OA-Version Imielski et al. ² Klicken Sie hier für eine größere Ansicht.

Discussion

Adulten Neurogenese und die Möglichkeit ihrer Manipulation über die Hemmung von NF-kappaB in Neuronen und ihre spätere Reaktivierung über Doxycyclin, bietet eine faszinierende System für Untersuchungen neugeborenen Nervenzellen im erwachsenen Gehirn, als auch in neuronalen De-und Re-Generation . Der Vorteil bei diesem System ist, dass NF-&kgr; B-Signalwegs in Neuronen, Hemmung führt nicht nur zu Veränderungen in der neuronalen Zelltod Vorläufer Proliferation und Migration und schweren strukturellen und anatomischen Veränderungen, aber auch in der Hand Lernfehler. Wichtiger ist, kann der Phänotyp der I &kgr; B / tTA Tieren experimentell umgekehrt und nach der Verabreichung von Doxycyclin gerettet werden. Diese Umkehrung der Phänotyp beinhaltet strukturelle Aspekte und kann auch zu einer deutlichen Verbesserung in der GD-abhängige Lern ² führen.

Um eine interpretierbare Ergebnis für die Verhaltensexperimente zu gewährleisten, ist es entscheidend, dass nur männliche Tiere mit einem Alter differenz weniger als vier Tage verwendet werden. Darüber hinaus sollten alle Testreihen von demselben Betreiber durchgeführt werden. Im Hinblick auf den Testraum, empfehlen wir die Durchführung der Prüfung in einer akustisch isolierten Umgebung, um Stress und Verlust der Aufmerksamkeit von äußeren Lärmquellen zu vermeiden. Um die Orientierung zu verhindern, dass auf der Basis der Geruchswahrnehmung statt Extra-Labyrinth Cues, sollten die geschlossenen Lebensmittel Häuser nicht zugänglich für das Tier sein, und die normale Luftzirkulation und Geruchs zulässig sein sollte. Zusätzlich sollte das für den Test verwendete Platte geruchsneutral und reinigungsbeständigen Material gebaut werden, und sollten sorgfältig zwischen den Experimenten zu reinigen. Eine weitere mögliche Quelle der experimentellen Variante ist die Raumbeleuchtung. Die Lichtquelle sollte hell genug, um die Bildaufnahme, die Anerkennung der außer Irrgartens zu ermöglichen und um das Flugverhalten zu induzieren, sollte aber nicht von einer Intensität, um das Tier zu blenden sein. Darüber hinaus empfehlen wir die Durchführung der Tests für jedes Tier in der gleichen Zeitvon Tag zu zirkadianen Schwankungen zu vermeiden.

Mus musculus hat eine ziemlich gute Sicht, die Fähigkeit, sich in die natürlichen Gegebenheiten, unter anderem verwendet werden, um territoriale Grenzen auf optisch ansprechende Features (visuelle Hinweise wie Bäume) (Latham et al., Appl. Tier Behav. Sci. 86 (3-4 erkennen ), 261-289, 2004). In einem klassischen Experiment Balkema et al. (J. Neurophysiol. 48 (4), 968-980, 1982) platziert 6, 0 und -7 Dioptrien-Gläser vor die Augen und Maus beobachtet keine signifikanten Veränderungen der rezeptiven Feldgrößen in retinalen Ganglienzelle. Aufgrund dieser enormen Schärfentiefe visuelle Reize (z. B. Extra-Labyrinth Cues) über einen großen Entfernungsbereich vor Mäusen platziert werden und bleiben im Fokus. In unserem Ansatz, der Abstand der Extra-Labyrinth Hinweise aus der Ausgangspunkt war 30 cm vom Rand der Platte, die in Übereinstimmung mit der Literatur (z. B. 140 cm in WOng et al., Genes Gehirn Behav. 5 (5), 389-403, 2006)

Nagetiere haben die Tendenz in der Nähe der Wände eines offenen Feldes zu bleiben. Dieses Verhalten wird als Thigmotaxis definiert (Barnett, SH, der Ratte: eine Studie im Verhalten, Aldline Publishing, Chicago, pp 31-32, 1963). Eine aktuelle Studie von O `Leary et al. (Behav. Brain Res.. 216 (2), 531-542, 2011) zeigten, dass die C57BL/6J Mäuse zeigten bessere Lern in einem Barnes Maze im Vergleich zu 12 anderen Mäusestämmen. 28% der getesteten Mäuse verwendet räumliche Suche, wohingegen 64% verwendet serielle thigmotactic-Strategie. Diese Daten gilt für kleine Labyrinth mit einem Durchmesser von 69 cm mit einer 15 cm-Wand umgibt. Allerdings Mäuse auf einem großen Labyrinth getestet, ohne Wände oder intramaze Cues, wie unser Setup (Durchmesser von 120 um) haben gezeigt, zuverlässig Beweise für den Einsatz von überwiegend außer Labyrinth visuelle Hinweise (siehe zB Bach et al., Cell. 81. beispielsweise durch Mikro Unterschiede zu vermeiden, wurde die Platte nach jedem Experiment gedreht.

Der Verhaltenstest kann einfach für die Untersuchung der Auswirkungen von anderen Transkriptionsfaktoren an adulten Neurogenese, mit geeigneten Maus-Modellen angepasst werden. Es ist jedoch im wesentlichen für die DG-abhängigen Lernen (räumliche Muster-Trennung) zu testen und möglicherweise nicht für die Untersuchung von Neurogenese und neuronale Degeneration in anderen Hirnregionen angemessen sein. In dieser Hinsicht ist die Verwendung von SPS-BM durch ihre DG-Spezifität (strikte Abhängigkeit von einer Funktionsschaltung zwischen EG II und DG und CA3 und CA1 und EG VI), und daher nicht für die Untersuchung von Aufgaben, die angewendet werden, beinhalten begrenzt die monosynaptischen EG III - CA1 - EC V - Schaltung.

Zukünftige Anwendungen der hier beschriebenen Verfahren können die Untersuchung der Wirkungen von Stammzelltransplantationen, Pharmasche Behandlungen auf erwachsene Neurogenese und Gewebe-Homöostase innerhalb des Hippocampus.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Moria MC17 Perforated Spoon	FST	10370-18	removal of the brains
Dissecting microscope	Carl Zeiss	Stemi SV8	removal of the brains
Surgical scissors	FST	14084-08	removal of the brains
Surgical scissors	FST	14381-43	removal of the brains
Dumont #5 forceps	FST	11254-20	removal of the brains
SuperFrost Slides	Carl Roth	1879	slides for immunohistochemistry
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	P6148	fixative
TissueTek OCT compound	Sakura Finetek	1004200018	embedding of the brains
Normal Goat Serum	Jackson Immunolabs	005-000-001	blocking in IHC
Normal Rabbit Serum	Jackson Immunolabs	011-000-001	blocking in IHC
Normal Donkey Serum	Jackson Immunolabs	017-000-001	blocking in IHC
anti-Neurofilament-M antibody	Developmental Studies Hybridoma Bank	2H3	IHC, Dilution 1:200
anti-Doublecortin antibody	sc-8066	Santa Cruz	IHC, Dilution 1:800
anti-GFP antibody	Abcam	ab290	IHC, Dilution 1:2,000
anti-BrdU antibody	OBT0030G	Accurate Chemicals	IHC, Dilution 1:2,000
Fluoro-Jade C	FJ-C	HistoChem	Determination of neuronal cell death
Betadine	Mundipharma	D08AG02	disinfectant
Cryomicrotome	Leica	CM1900	preparation of brain slices
Heparin sodium salt	Sigma-Aldrich	H3393	perfusion
Circular plate made from hard-plastic (diameter 120 cm)	lab made	none	plate for SPS-BM, diameter 120 cm
Buraton rapid disinfectant	Schülke Mayr	113 911	disinfectant
Video-tracking system TSE VideoMot 2 with Software Package VideoMot2	TSE Systems	302050-SW-KIT	tracking and analysis of SPS-BM
Triton X-100	Sigma Aldrich	T8787	permeabilization/IHC
Cryotome	Reichert Jung/Leica	Frigomobil 1206	preparation of 40 µm brain slices
Mowiol 4-88	Carl Roth	Art.-Nr. 0713	embedding of the slides
SYTOX green	Invitrogen	S7020	Nuclear staining
Food pellets (Kellog`s Froot Loops)	Kellog`s		SPS-BM
Prism, Version 3.0	Graph Pad Software, San Diego, USA		Statistical evaluation of SPS-BM
Zen 2008 or Zen 2011 Software	Carl Zeiss		Software (Confocal microscope)
D.P.X	Sigma-Aldrich	317616	mounting medium for Fluoro-Jade C staining