Metoder for Modulation og analyse av NF-κB-avhengig Adult Neurogenesis

Summary

Fremgangsmåter for manipulering og analyse av NF-κB avhengig voksen hippocampus neurogenesis er beskrevet. En detaljert protokoll er presentert for en dentate gyrus avhengig atferds test (kalt den romlige mønster separasjon-Barnes labyrint) for undersøkelse av kognitiv utfallet i mus. Denne teknikken bør også bidra til at undersøkelser i andre eksperimentelle innstillinger.

Abstract

Hippocampus spiller en sentral rolle i dannelsen og konsolidering av episodiske minner, og i romlig orientering. Historisk har den voksne hippocampus blitt sett på som en svært statisk anatomisk region av hjernen hos pattedyr. Imidlertid har nyere funn viser at dentate gyrus av hippocampus er et område med enorm plastisitet hos voksne, som involverer ikke bare modifikasjoner av eksisterende nevrale kretser, men også voksen neurogenesis. Denne plastisitet er regulert av komplekse transkripsjonelle nett, hvor transkripsjonsfaktor NF-κB spiller en fremtredende rolle. For å studere og manipulere voksen neurogenesis, en transgen musemodell for forhjerne-spesifikke nevronale hemming av NF-κB aktivitet kan anvendes.

I denne studien, er metoder som er beskrevet for analyse av NF-κB-avhengig neurogenesis, herunder dets strukturelle aspekter, nevronale apoptose og stamfar spredning, og kognitiv betydning, hh ble spesielt vurdert via en dentate gyrus (DG) avhengig atferds test, den romlige mønster separasjon-Barnes labyrint (SPS-BM). SPS-BM-protokollen kan være ganske enkelt tilpasses for bruk med andre transgene dyremodeller er utformet for å bedømme innflytelsen av bestemte gener i voksen hippocampus neurogenesis. Videre kan SPS-BM brukes i andre eksperimentelle innstillinger for å undersøke og manipulere DG avhengig læring, for eksempel ved hjelp av farmakologiske midler.

Introduction

Ontologisk er hippocampus en av de eldste anatomiske strukturer i hjernen kjent. Det er ansvarlig for ulike komplekse oppgaver, som for eksempel sentrale funksjoner i reguleringen av langtidshukommelsen, romlig orientering, og dannelse og konsolidering av de respektive minne. Anatomisk, består hippocampus av pyramidale cellelag (stratum Pyramide) inkludert Cornu Ammonis (CA1, CA2, CA3, og CA4) regioner og dentate gyrus (gyrus dentatus), som inneholder granule celler og noen nevrale stamceller innenfor sitt subgranular sone . Den granule celler projisere mot CA3 regionen via de såkalte mosegrodde fibre (axons av granule celler).

Frem til slutten av forrige århundre, ble den voksne hjernen hos pattedyr antas å være en statisk organ mangler mobilnettet plastisitet og neurogenesis. Men i løpet av de siste to tiårene har en økende mengde bevis viser tydelig voksen neurogenesis finner sted i minstto områder av hjernen, subventricular sone (SVZ) og subgranular sonen av hippocampus.

Våre tidligere studier, og de ​​av andre grupper, har vist at transkripsjonsfaktoren NF-κB er en av de avgjørende molekylære regulatorer av voksen neurogenesis, og at dens de-reguleringen medfører alvorlige strukturelle hippocampus defekter og kognitive svekkelser ^1-6. NF-κB er det generiske navn for en induserbar transkripsjonsfaktor sammensatt av forskjellige dimere kombinasjoner av fem DNA-bindende subenheter: P50, P52, c-Rel, relB og P65 (forhold), idet sistnevnte tre av disse har transactivation domener. I hjernen, den mest vanlige formen som finnes i cytoplasma er en heterodimer av p50 og p65, som er holdt i en inaktiv form av inhibitor av kappa B (IκB)-proteiner.

Å studere og direkte manipulere NF-κB-drevet neurogenesis, bruker vi transgene musemodeller for å gi deg enkel hemming av alt av NF-κB subunsin, spesielt i forhjernen ⁷ (se figur 1). For dette formålet, vi krysser-avlet følgende transgene mus linjer, IκB / - og -/tTA. Den transgene IκB / - linjen ble generert ved hjelp av en trans-dominant negative mutant av NF-κB-hemmer IκBa (super-repressor IκBa-AA1) ^8. I motsetning til villtype IκBα, har IκBα-AA1 to serin-rester mutert til alanines (V32 og V36), som hemmer fosforylering og etterfølgende proteasomal nedbrytning av inhibitor. For forhjernen neuron-spesifikk ekspresjon av IκBa-AA1-transgenet, IκB / - mus ble kryss avlet med mus som inneholder et kalsium-calmodulin-avhengig kinase IIα (CAMKIIα)-promoter som kan bli drevet av tetracyklin trans-aktivator (TTA) ^9.

P65 knock-out mus har en embryonale dødelig fenotype, på grunn av massive lever apoptose ^10, så tilnærmingen vist her gir en elegant metodefor å undersøke rollen av NF-κB i postnatal og voksen neurogenesis.

Den klassiske atferds test for å studere romlig læring og hukommelse ble beskrevet i 1980 av Richard Morris, en test kjent som Morris vann-labyrint (MWM) ^11. I denne åpne-feltet vann-labyrint, dyr lærer å flykte fra ugjennomsiktig vann på en skjult plattform basert på orientering og ekstra-labyrint pekepinner. En tørr variant av MWM er den såkalte Barnes labyrint (BM) ^12. Denne testen benytter en sirkulær plate med 20 runde hull arrangert på grensen av en plate, med en definert hull som en flukt-boksen, og visuelle ekstra-labyrint pekepinner for orientering. Begge eksperimentelle paradigmer stole på fluktadferd indusert av en gnager `s aversjon mot vann, eller åpne, lyst opplyste områder. Begge testene tillate en undersøkelse av romlig orientering, og den relaterte minneytelse. Selv hippocampus spiller en generell og essensiell rolle i romlig hukommelse formasjonen, hippocampus regions involvert variere avhengig av testen anvendt. Minnet testet i BM oppstår fra nerve-aktivitet mellom enthorinal cortex (EF) og pyramidale nevroner ligger i CA1-regionen i hippocampus uten bidraget fra DG ^13-16. Spesielt den klassiske BM hovedsakelig er avhengig av navigasjons via monosynaptisk temporo-ammonic sti fra EF III til CA1 EC V. Viktigere er DG avgjørende involvert i den såkalte romlig mønstergjenkjenning ^17, noe som innebærer ikke bare behandling av visuell og romlig informasjon, men også transformasjonen av lignende fremstillinger eller minner inn i ulike, nonoverlapping representasjoner. Denne oppgaven krever en funksjonell tri-synaptiske krets fra EF II til DG til CA3 til CA1 og EC VI, som ikke kan testes i BM ^15.

For å møte disse utfordringene, har vi utviklet SPS-BM som et atferdsmessig test for å teste dentate gyrus avhengige kognitive prestasjoner i co spesifiktntrol dyr, og i IκB / TTA super-repressor-modellen etter NF-κB hemming. Viktigere, i motsetning til den MWM eller BM kan SPS-BM avsløre subtile adferdsmessige mangler som følge av svekkelse av neurogenesis. Siden romlig-mønster-separasjon er strengt avhengig av en funksjonell krets mellom EF II og DG og CA3 og CA1 og EC VI, er svært følsom for potensielle endringer i neurogenesis, modifikasjoner av mosegrodd fiberbanevei eller endringer av vev homeostase innenfor denne testen DG.

Teknisk sett er det oppsett av vår test basert på studier av Clelland et al., Der romlig separasjon mønsteret ble testet ved hjelp av en tre åtte-arm radial arm labyrint (RAM) ^19. I vår endret set-up, ble de åtte armene erstattet av syv identiske gule mat hus. Oppsummert metodene vist her, inkludert analyse av doublecortin-uttrykk (DCX +) celler i hippocampus, den mosefiberfremspring, neuronal celle death og spesielt SPS-BM presenteres her, kan brukes til undersøkelser av andre musemodeller som omfatter transgener som har en innvirkning på voksen neurogenesis. Andre applikasjoner kan omfatte studier av farmakologiske midler og måle deres innvirkning på DG og romlig mønster separasjon.

Protocol

Etikk uttalelse

Denne studien ble gjennomført i henhold til reglene i den statlige dyre-og omsorg bruk komiteen, LANUV av staten Nordrhein-Westfalen, (Düsseldorf, Tyskland). Alle dyreforsøk ble godkjent av LANUV, Düsseldorf under lisensnummer 8.87-51.04.20.09.317 (LANUV, NRW). Alle forsøk ble gjort for å minimalisere ubehag og antall dyr er nødvendig for undersøkelsen.

En. Animal Care and Housing

1. Alle dyr som brukes i protokollene som er beskrevet her bør holdes under spesifikke patogen-frie forhold, slik det er definert av Federation European Laboratory Animal Science Association (FELASA).
2. Mus bør holdes i standard bur i en temperatur-og fuktighetskontrollert (22 ° C) rom under dagaktive forhold (12 timers lys / mørke syklus) med HEPA filtrert luft.
3. Standardisert mat og vann bør gis ad libitum. </ Li>
4. Hvis IκB / TTA og IκB / - kontroll mus blir brukt, bør PCR-basert genotyping utføres for hvert dyr, som beskrevet i ^{7, 18.}
5. Hannhunder med en alder forskjell på mindre enn fire dager bør bli benyttet for å redusere individuell variabilitet.
6. (Valgfritt): For NF-κB reaktive eksperimenter, doksycyklin må administreres i drikkevann (2 mg / ml med 2,5% sukrose) i minst 14 dager.

2. Spatial Pattern Separation-Barnes Maze (SPS-BM)

1. All atferds testing skal utføres i henhold til internasjonale og lokale retningslinjer.
2. VIKTIG! Bruk kun mannlige mus med en alder på seks måneder eller eldre. Alderen forskjell mellom dyr av en testserie bør være mindre enn fire dager. Prøvingen skal utføres av samme operatør for hver serie. Musene skal motta en standard diett før testing for å ytterligere øke motivasjonen delvis drevet av såweet mat belønning.
3. Sett opp en hvit sirkulær plate laget av hard plast (diameter 120 cm, se figur 5A) på en fuktighet-og temperaturkontrollert rom (22 ° C), belyst med minst 4 x 80 W, og 3 x 215 W neon lysrør . VIKTIG! Sørg for riktig belysning er brukt, så motivasjonen for musene å angi mat hus er delvis drevet av sin aversjon mot lyse, utsatte steder.
4. Sett opp video-sporingssystem. Kameraet bør plasseres 115 cm over sentrum av platen (se figur 5A).
5. Fest flerfarget ekstra-labyrint signaler (EMC) til en hvit-farget tøy i posisjoner lett synlige for dyrene, ca 100 cm fra grensen av platen (se figur 5A).
6. Rengjøre platen forsiktig med en rask desinfeksjonsmiddel som kan fjerne lukt fra den eksperimentelle oppsettet.
7. Plasser syv identiske gule mat hus (12 cm x 7 cm x 8 cm, se figur 5A figur 5A).
8. Plasser søt mat pellets belønninger (en fjerdedel av en Kellogs `s Froot Loop / mat huset) på innsiden av alle mat hus på definerte posisjoner (se figur 5A) med bare én definert mat huset være fritt tilgjengelig for dyret (plassering F, se figur 5A ). Lukk targetnukleinsyre mat hus med gjennomsiktig folie.
9. Før testen, utføre tilvenning (en dag før du starter oppgaven). Gjør alle mat hus fritt tilgjengelig og lar musene å utforske labyrinten fritt og til å hente en mat pellet belønning (10 min / dyr).
10. Slå av datamaskinen og kameraet på og starte video-tracking system software.
11. Starte opptaket.
12. Plasser dyret ved definert startpunkt på den sirkulære plate (figur 5A, S: start-stilling), og at musene for å søke etter målet mat huset i 10 min.
13. Stop video-sporing.
14. VIKTIG! Rengjør sirkulær plate og mat hus etter hvert forsøk med rask desinfeksjonsmiddel.
15. Gjenta testen daglig i sju sammenhengende dager (for hvert dyr).
16. Analysere resultatene (latency, distanse og feil) ved hjelp av egnede statistikk programvare. Definer feil som nærmer feil mat huset og / eller kontakt med riktig boks uten å gå inn og hente maten pellet belønning. For gruppert analyse bruker to-veis ANOVA med Bonferroni post hoc-test.
17. (VALGFRITT) Sacrifice mus og analysere hippocampi som beskrevet nedenfor.

Tre. BrdU Merking

1. Injisere intraperitonealt 50 mg / kg ip BrdU gang daglig i 3 dager (analyse av differensiering og integrering) eller 200 mg / kg ip for en enkelt injeksjon (analyse av spredning).
2. Ofre dyrene, dissekere hippocampus og forberede 40 mikrometer seksjoner som beskrevet nedenfor.
3. Denaturate denseksjoner med 2 M HCl i 10 minutter og inkuberes i 0,1 M boratbuffer i 10 min.
4. Merk et en-i-tolv serie på 40 mikrometer seksjoner (240 mikrometer fra hverandre) fra hvert dyr immunohistochemically, som beskrevet nedenfor, ved bruk av antistoffer rettet mot BrdU.
5. Tall de merkede celler ved konfokal mikroskopi-analyse gjennom rostrocaudal omfanget av granulen cellelaget og subgranular sonen. Multipliser de resulterende tall på 12 for å oppnå den beregnede totale antall BrdU-merkede celler pr hippocampus og dividerer med to for å få det totale antall merkede celler pr DG.

4. Fjerning av Brains og klargjøring av Cryosections fra Nonperfused Dyr

1. Observer lokalt godkjente prosedyrer for euthanizing dyr. Mus kan være direkte avlives ved halshugging.
2. (Valgfritt) Dyr kan bli bedøvet før euthanization i henhold til lokale og internasjonale retningslinjer, for eksempel ved intraperitoneal injeDette skjer på 0,8 ml Avertin for en 33 g mus (nylaget ved å blande 150 ml stamløsning fremstilt av 2,2 mg 2,2,2-tribromoethanol i 1 ml isoamyl etanol med 1,85 ml av saltløsning eller fysiologisk buffer).
3. Steril hodet med Betadine (10% povidonjodid)-gjennomvåt gasbind og vattpinne senere med gasbind dynket i 70% etanol.
4. Halshogge dyret ved hjelp av egnede kirurgiske saks og dra huden til side.
5. (Valgfritt) fixators kan brukes til å unngå folding iden av utviklingshemmede huden.
6. Lag en midtlinjen snitt i hodeskallen og trekk skallen fragmenter nøye til side.
7. Fjerne hele hjernen nøye ved hjelp av et egnet kirurgisk instrument (f.eks Moria Spoon).
8. Precool 25 ml 2-metylbutan i et 50 ml begerglass (f.eks Schott Duran) til -30 til -40 ° C i tørris.
   Merk: For frittflytende farging av "tykke" seksjoner som er ideell for konfokal laser scanning mikroskopi, fjerne hjernen, vaske 3ganger i buffer og oppbevares ved 4 ° C i fosfat-bufret 30% sukrose-løsning i 50 ml rør inntil hjernen har sunket ned til bunnen (vanligvis over natten).
9. Nøye hjernen på et stykke Nescofilm (Parafilm) og dekk med rikelig mengde TissueTek oktober sammensatte, fryse på Nescofilm i 2-methylbutane, lagre ved -80 ° C inntil bruk.
   NB: For lang tids lagring ved -20 ° C store i 9% sukrose, 7 mM MgCl _2, 50 mM fosfatbuffer, 44% glycerol.
10. Skjær hjernen til 10-12 mikrometer tykke seksjoner på passende cryomicrotome.
    Merk: For tykke, frittflytende seksjoner, fryse hjernen på cryotome stadium av passende cryotome (f.eks Reichert Jung, Frigomobil.) Og kutte 40 mikrometer horisontale seksjonene ved -20 ° til - 25 ° C. Samle seksjoner fra kniv med fin pensel og samle i buffer eller holde lagringsløsning (trinn 4,9) ved -20 ° C for langtidsoppbevaring.
11. Nøye montere to skiver på enkeltobjektglass. Den osse av Superfrost UltraPlus lysbilder er sterkt anbefalt å maksimere vedheft av seksjonene.
12. Tørk skinnene i 5 min ved romtemperatur. Lysbilder kan oppbevares ved -80 ° C inntil bruk.

5. Utarbeidelse av Seksjoner fra perfundert Dyr

1. Bedøve dyrene som beskrevet ovenfor (trinn 4.2).
2. Perfuse forsiktig dyret transcardially med fosfatbufret saltvann (PBS) inneholdende heparin (0,025 g/100 ml PBS) og prokain (0,5 g/100 ml PBS) i 2-4 min, etterfulgt av 4% paraformaldehyd i PBS i 10-15 min . Perfusjon er optimalt utført ved perfusjon via den venstre ventrikkel, og åpningen av den høyre atrium ved hjelp av et hydrostatisk trykk på omtrent 1,2 til 1,4 m, eller anvendelse av en peristaltisk pumpe som angitt til omtrent 15 ml / min. Optimale perfusjon resulterer i et blekt hvitt hjerne uten røde blodårer blir synlig.
3. Skjær-og post-løse hjernene i 4% paraformaldehyd ved 4 ° C i 24 timer.
4. Cryobeskytte hjernene i 30% sukrose i PBS ved 4 ° C i minst 24 timer.
5. Frys hjernen på cryotome scenen.
6. Forbered 40 mikrometer horisontale seksjoner fra hele forebrains hjelp av et egnet cryotome.
7. Skinnene kan lagres i kryobeskyttende oppløsning (0,1 M fosfatbuffer, 50% glycerol, 0,14% _MgCl2, 8,6% sukrose) ved -20 ° C inntil bruk.

6. Immunhistokjemi av Brain Deler av Nonperfused Dyr

1. Post-fikse cryosections, fremstilt som beskrevet ovenfor, ved bruk av -20 ° C kald metanol i 10 min.
2. Blokker med 5% normalt serum inneholdende 0,3% Triton-X (fra de arter som ble benyttet for å heve det sekundære antistoff) over natten ved 4 ° C.
3. Skyll 3x med 1x PBS og inkuber med primære antistoffer natten ved 4 ° C.
4. Vask 3 ganger med 1 x PBS og inkuberes med sekundære antistoffer ved romtemperatur i én time.
5. Skyll 3x med 1x PBS
6. Counterstain seksjonen for DNA ved hjelp SYTOX grønn, eller DAPI (eller en alternativ DNA fargestoff).
7. Skyll 3x med 1x PBS
8. Legge delene i en vandig embedding medium.
9. La innebygging medium polymerisere i minst 48 timer.

7. Immunhistokjemi av Brain Deler av perfundert Dyr

1. Blokker som beskrevet i trinn 6.2, og deretter inkuberes de faste hjerneseksjoner i primær antistoffløsning fortynnet i PBS inneholdende 0,3% Triton-X (frittflytende) over natten ved 4 ° C.
2. Vask tre ganger med 1 x PBS og inkuberes i sekundær antistoffløsningen fortynnet i PBS inneholdende 0,3% Triton-X (frittflytende) ved romtemperatur i 3 timer.
3. Skyll 3x med 1x PBS
4. Counterstain seksjon for DNA ved hjelp SYTOX grønn eller DAPI (eller en alternativ DNA fargestoff).
5. Skyll tre ganger med 1x PBS
6. Legge delene i en vandig embedding medium.
7. La den innebygging medium polymer for ent minst 48 hr.

8. Gransking av Mossy Fiber Anslag

1. Ofre dyrene, forberede 40 mikrometer koronale seksjoner som er beskrevet ovenfor og beis hippocampus seksjonen ved bruk av antistoff for neurofilament M.
2. Scan seksjonene ved passende bølgelengde ved hjelp av en konfokal laser scanning mikroskop for å visualisere mose fibre og kjerner. Start skanningen ved lav forstørrelse.
3. Bruk lav forstørrelse bilder for orientering og målrette hippocampus med mosegrodd fiber anslag.
4. Skanne seksjoner (z-snitt) med høy oppløsning og høy forstørrelse.
5. Analyser den morfologiske utseende og tilkobling av de mosegrodde fibre visualisert via farging for NF-M.
6. (VALGFRITT) Analyser størrelse og volum av hippocampus bladene. Bruk DNA-signalet for målingene.

9. Fluor-Jade C-analyse (Neuronal Cell Death)

1. Ofre dyrene, dissekere hippocAmpus, og forberede 12 mikrometer seksjoner som er beskrevet ovenfor.
2. La oss delene tørke i 30 minutter ved romtemperatur.
3. Fiks seksjonene i 4% PFA i 40 min ved romtemperatur.
4. Kort vaske delene 3x med DDH ₂ O.
5. Inkuber seksjoner med 0,06% kaliumpermanganat (KMnO ₄₎ i 10 minutter under kontinuerlig forsiktig risting.
6. Vask delene 3x med DDH ₂ O.
7. Inkuber seksjoner med 0,002% fluor-Jade C-løsning i 20 min ved romtemperatur.
8. (VALGFRITT) For samtidige atom stainings, 0,002% Fluor Jade C-løsning kan bli supplert med 10 mikrogram / ml DAPI.
9. Kort vaske delene 3x med DDH ₂ O.
10. La oss delene tørke i 30 minutter ved romtemperatur.
11. Inkuber seksjoner med Xylen (1 min)
12. Monter delene ved hjelp av en Xylen basert montering medium (DPX).

Representative Results

Cross-avl av IκB / - og TTA transgene mus linjer fører til betinget hemming av NF-κB aktivitet i hippocampus.

For å undersøke ekspresjonen av IκBα-AA1-transgenet i den doble transgene mus (figur 1A), ble hjernene isolert, cryosectioned og farget ved hjelp av et antistoff mot GFP (grønt fluorescerende protein). Konfokal laser-skanning mikroskopi viste høy ekspresjon av transgenet i CA1-CA3 og regioner, og i DG (figur 1B).

Den IκBα-AA1-transgenet er uttrykt i type-2b stamfedre, og er aktiv i mellom umodne stater og i modne granule celler.
For å bestemme den tidligste celletype uttrykker CAMKIIα-drevet IκBα-AA1 i hippocampus nevrogen regionen, ble cryosections av hippocampi fra IκB / TTA dyr farget for doublecortin(DCX) og transgenet (GFP). Confocal analyse avslørte GFP-signaler hos unge DCX-positive granule-celler, noe som viser induksjon av ekspresjonen av transgenet med CAMKIIα-aktivitet (figur 2, piler).

Neuronal NF-κB hemming via IκBα-AA1 reduserer mosegrodde fiber anslag, og tykkelse og volum av DG.

Koronale deler av hippocampus av IκB / TTA og IκB / - muse ble farget for neurofilament M (NF-M) for å visualisere mosegrodde fiber anslag, og avslører komplekse og fascikulær organisasjon (figur 3). I IκB / TTA mus, ble de mosegrodd fiber anslag alvorlig svekket. I tillegg, NF-κB inhibering har ført til en betydelig redusert suprapyramidal bladtykkelse og en mindre DG volum (figur 3B).

Neuronal hemming av NF-κB i IκB / TTA mus fører til forhøyet nevronale Degenbeid, økt neurogenesis, og en forstyrret migrasjon av DCX-uttrykke stamfedre.

For å studere mulige årsaker til den dramatiske strukturelle defekter, friske, ble ufestede hippocampus skiver fra IκB / TTA mus farget med Fluoro-Jade C, noe som gjør at spesifikk påvisning av neuronal celledød (Figur 4A). Her ble det observert en dramatisk økning i antall degenereres neurites i doble transgene dyr, sammenlignet med enkelttransgene kontroller. Dessuten, ble en signifikant økning av spaltede kaspase-3-positive apoptotiske celler påvises i IκB / TTA mus. I motsetning immunhistokjemisk farging mot DCX avslørte betydelig økt mengder DCX + celler i hjernen til IκB / TTA mus. Videre ble DCX + celler i IκB / TTA-hippocampi ikke arrangert utelukkende i subgranular sonen, men ble også funnet i de dypere delene av DG (Figur 4B), mens de DCX +-stamfedre in kontrolldyrene ble lokalisert nesten utelukkende innenfor subgranular sonen. For å teste om den økte mengden av DCX-uttrykkende celler er et resultat av modning av tidligere progenitorer eller direkte på grunn av spredning av DCX +-celler, ble BrdU injisert i hippocampi av IκB / TTA og kontrollmus, som så ble cryosectioned og farget med DCX og BrdU (figur 4). For analyse av proliferasjon ble BrdU injisert en gang (se figur 4B, ordning), etterfulgt av analyse etter 24 timer. For analyse av differensiering, ble tre injeksjoner utføres daglig, fulgt av analyse etter syv dager. Etter en enkelt BrdU-injeksjon, ble ingen signifikante forskjeller i det totale antall BrdU positive celler mellom IκB/tTA- og kontrolldyrene observeres, mens de tre serie injeksjoner-tilnærmingen avslørte en tydelig økt mengde av BrdU / DCX +-celler i DG av IκB / TTA mus. Dette indikerer at forstyrret differensiering eller integrering av DCX-expresserende celler kan ha forårsaket økt antall DCX + celler, og antyder at type tre celler ble involvert.

Neuronal hemming av NF-κB resultater i alvorlige lære defekter, som demonstrert av den Spatial Pattern Separation-Barnes Maze test. Å teste spesielt oppførselen til den doble transgene mus i en DG-avhengige oppgave, brukte vi SPS-BM, hvor dyr må skille mellom steder med små forskjeller (figur 5). I denne atferdstest, den IκB / - kontrolldyrene utforsket mat hus serielt på den første dag av eksperimentet (figur 5). Etter sju dager med trening, var dyrene i stand til å finne den åpne mat huset direkte. Derimot, fortsatte de IκB / TTA dyr å utforske mat hus serielt, selv etter trening (Figur 5B). Observasjonen av betydelige økninger i de avstander dekket, og økte ventetider og ehROR priser i IκB / TTA dyr, sammenlignet med de IκB / - kontroll dyr, tyder på at disse dyrene hadde alvorlige lære defekter (figur 5C).

Figur 1. Generering av en betinget forhjerne spesifikke hemming av NF-κB aktivitet. A. Skjematisk tegning av de transgene modeller som brukes for å studere rollen som NF-κB i voksen hippocampus neurogenesis. Kalsium-calmodulin-avhengig kinase IIα (CAMKIIα) promoter-drevet tetracyklin transactivator (TTA) mus ble brukt til å regulere uttrykk for en trans-dominant negative mutant IκBa (IκBa-AA1 super-repressor i IκB mus) kombinert med en grønn fluorescerende protein tracer (GFP). I IκB / TTA mus, er NF-κB holdt i cytoplasma i sin inaktive state ved degraderbare IκBa-AA1, som kan oppdages via GFP-fluorescens. Hemming kan reverseres ved doksycyklin, som hemmer TTA. B. representant transgene uttrykk i ulike hippocampus regioner i IκB / TTA mus (CA1, CA3 og DG). Cryosections ble forberedt fra isolerte hjernen til IκB / - og IκB / TTA mus, og ble fast og farget med et antistoff mot GFP. Legg merke til at transgenet er sterkt uttrykt i DG. De: dendritter, DG: dentate gyrus, ML: molekylær lag; SL: Stratum lucidum. Klikk her for å se større bilde.

Figur 2. Den IκBa-AA1 transgenet er uttrykt i DCX-positive, type-2b progenit ORS og er aktiv i flere mellomliggende stater og i modne granule celler. A. Cryosectioned hippocampi av IκB / TTA dyr med doublecortin (DCX) beising og GFP uttrykk avsløre uttrykk av transgenet hos unge DCX-positive granule celler (piler). DG: dentate gyrus, ML: molekylær lag B. Skjematisk tegning av transgene uttrykk i ulike utviklingsstadier i løpet granule celle utvikling.. IκBa-AA1-transgene uttrykk ble oppdaget i DCX-positive, type 2b stamfedre, alle mellomliggende umodne stater og i modne granule celler. Derimot, gjorde tidlig type 1 og type-2a stamfedre (mangler DCX-uttrykk) ikke uttrykke transgenet, og ble derfor ikke berørt av NF-κB hemming. Modifisert etter Kempermann et al. ²⁰ Klikk her for å se større bilde.

ays ">
Figur 3. NF-κB hemming fører til svekket mosegrodd fiber anslag og til en redusert DG tykkelse og volum i IκB / TTA mus, sammenlignet med én transgene kontroll (IκB / -). A. Immunostaining av cryosectioned hippocampi for neurofilament M (NF-M) for å visualisere mosegrodde fiber anslag. I kontroll mus (IκB / -), en kompleks og fascikulær organisering av mosegrodde fibre som forbinder granule celler til sine målceller i CA3 er tydelig, som ble nedsatt etter neuronal hemming av NF-κB i IκB / TTA mus. Videre er ekspresjon av super-repressor førte til en signifikant redusert suprapyramidal bladtykkelse (sammenlign pil i venstre og høyre panel), og en redusert DG volum. B. Kvantifisering og statistisk analyse av strukturelle defekter som følge av NF-κB hemming. Uparet t-test, tosidige. Dataene er hentet fra OA-versjonen av Imielski et al. ² Klikk her for å se større bilde.

Figur 4. Hemming av NF-κB i IκB / TTA mus fører til økt nevronal celledød, forbedret neurogenesis, og en forstyrret vandrende mønster av DCX-uttrykker cellene. A. Neuron-spesifikke Fluoro-Jade C farging og økt antall spaltet kaspase-3-positive celler i hippocampus seksjoner viser en høyere grad av neuronal celledød i IκB / TTA mus enn i IκB / - kontroller. Degenereres neurites er merket med piler, og kjerner er merket med en stjerne. Høyre side: kvantifisering av kløyvde caspase-3-pomerksomme celler i hippocampi antyder sterkt økt apoptose i doble transgene dyr. B. Farging av hippocampus cryosections for DCX avslører et økt antall DCX-uttrykker cellene i de doble transgene dyr. Legg merke til at DCX +-celler i IκB / TTA-hippocampi ikke er anordnet utelukkende i subgranular sonen, men migrerte dypere inn i DG enn i IκB / -. Kontroll C. Venstre panel: For å teste påvirkning av transgenet på spredning, ble et enkelt BrdU-injeksjon utføres, noe som resulterte i ingen signifikante forskjeller i antall BrdU-positive celler mellom IκB / TTA og kontroller Høyre panel:. Statistisk vurdering viste en signifikant øke i DCX-uttrykker cellene i IκB / TTA dyr etter tre daglige BrdU-injeksjoner. Analysen ble utført i syv dager etter den siste injeksjon (test av differensiering og integrering). En betydelig økning i BrdU / DCX + ble oppdaget i DG for jegκB / TTA mus (n = 3). Data delvis tatt fra OA-versjonen av Imielski et al. ² Klikk her for å se større bilde.

Figur 5. Oppsett og typiske resultater av romlig mønster separasjon-Barnes labyrint (SPS-BM). A. Venstre: Skjematisk tegning av den eksperimentelle oppsettet. Syv identiske mat hus (samme farge, størrelse og form) ble plassert symmetrisk på definerte flekker av en runde, hjemme-laget plate bygget fra hardt inert plast (diameter 120 cm), med en gratis spot (utgangspunkt, S). Flerfarget ekstra-labyrint signaler (EMC) er festet foran en hvit-farget tøy i posisjoner lett synlig for dyrene, ca 100 cm fra brekkefølgen av platen. For å unngå orientering av lukt, er mat pellets deponert i hvert hus, men bare en mat huset er tilgjengelig (lukking av gjennomsiktig folie). Høyre: Videokamera fokusert på tallerkenen (avstand til plate: 115 cm), og et bilde av oppsettet inkludert ekstra-labyrint pekepinner B. Typisk eksperimentell utfallet av en SPS-BM-test.. Den IκB / - kontroll dyr utforsker mat hus serielt på den første dagen av testen serien, og den åpne mat huset er funnet umiddelbart etter sju dager med trening. I kontrast, IκB / TTA mus avsløre dårligere læring, som demonstrert av serie leting selv etter opplæringsfasen C. Sammenligning av parametre målt i SPS-BM i IκB / -. Og IκB / TTA dyr. Doble transgene mus viser signifikant hukommelsessvikt (n = 9) sammenlignet med kontroller (n = 8) med hensyn til forsinkelser, avstand dekkes og feilrate. to-veis ANOVA evaluering; feilfelt: SEM. Data i BC ble tatt fra OA-versjonen av Imielski et al. ² Klikk her for å se større bilde.

Discussion

Voksen neurogenesis, og muligheten for sin manipulasjon via hemming av NF-κB i nevroner, og dens senere reaktivering via doksycyklin, tilbyr en fascinerende system for etterforskning av nyfødte nerveceller i den voksne hjernen, samt i nevronale de-og re-generasjonen . Det fine med dette systemet er at NF-κB signalveien hemming i nevroner ikke bare resultater i endringer i nevronale celledød, stamfar spredning og migrasjon, og alvorlige strukturelle og anatomiske endringer, men også i åpenbare lærings defekter. Viktigere, kan fenotyper av IκB / TTA dyr bli eksperimentelt reverseres og reddet etter administrasjon av doxycyklin. Denne reversering av fenotypen omfatter strukturelle aspekter, og kan også føre til betydelige forbedringer i DG avhengig lære ^2.

For å sikre en interpretable utfall for de atferdsmessige eksperimenter, er det avgjørende at bare mannlige dyr med en alders difference på mindre enn fire dager benyttes. Videre bør alle forsøksserie utføres av den samme operatør. Med hensyn til testing rom, anbefaler vi på det sterkeste å utføre testen i et lydisolert miljø for å unngå stress og tap av oppmerksomhet som følge av eksterne støykilder. For å hindre orientering basert på lukt deteksjon stedet for ekstra-labyrint pekepinner, bør de lukkede mat hus ikke være tilgjengelig for dyret, og vanlig luft og lukt sirkulasjon bør tillates. I tillegg bør den plate som brukes under prøven bygges av luktnøytralt og vaskemiddel-resistente materiale, og bør være omhyggelig rengjort mellom forsøkene. En ytterligere potensiell kilde til eksperimentell variasjon er rombelysning. Lyskilden skal være sterkt nok til å tillate bilde oppkjøpet, anerkjennelse av de ekstra-labyrint signaler, og å indusere fluktadferd, men bør ikke være av en intensitet for å blinde dyret. Videre, foreslår vi å utføre testene for hvert dyr på samme tidpå dagen for å unngå biologiske variasjoner.

Mus musculus har en ganske god observasjonsevne som er, i naturgitte forhold, blant annet brukes til å oppdage territoriale grenser på visuelt slående trekk (visuelle signaler som trær) (Latham et al., Appl. Animal Behav. Sci. 86 (3-4 ), 261-289, 2004). I et klassisk eksperiment Balkema et al. (J. Neurophysiol. 48 (4), 968-980, 1982) plassert 6, 0, og -7 diopter linser foran muse øyne og observerte ingen vesentlige endringer av mottakelig feltstørrelser i retinal ganglion celle. På grunn av denne enorme dybdeskarphet visuelle stimuli (f.eks ekstra-labyrint Køer) kan plasseres over et stort spekter av avstander foran mus og forbli i fokus. I vår tilnærming, avstanden til ekstra-labyrint pekepinner fra startpunktet var 30 cm fra kanten av platen, som er i samsvar med litteraturen (f.eks 140 cm i Wong et al., Genes Brain Behav. 5 (5), 389-403, 2006)

Gnagere har tendens til å holde seg nær til veggene i et åpent felt. Denne oppførselen er definert som thigmotaxis (Barnett, SH, Rotta: en studie i atferd, Aldline publisering, Chicago, pp 31-32, 1963). En fersk studie av O `Leary et al. (Behav. Brain Res. 216 (2), 531-542, 2011) viste at C57BL/6J mus viste bedre læring i en Barnes Maze sammenlignet med 12 andre muse stammer. 28% av musene testet brukt romlig søk, mens 64% brukt seriell-thigmotactic strategi. Disse data gjelder for små labyrint med en diameter på 69 cm med en 15 cm vegg-området. Men mus testet på en stor labyrint uten vegger eller intramaze signaler, som vår setup (diameter på 120 mikrometer) har sikkert vist bevis for bruk av hovedsakelig ekstra-labyrint visuelle signaler (se for eksempel Bach et al., Cell. 81 for eksempel forårsaket av mikrostrukturforskjeller, platen ble rotert etter hvert forsøk.

Den atferds test kan enkelt tilpasses for å undersøke effekten av andre transkripsjonsfaktorer på voksen hippocampus neurogenesis, ved hjelp av egnede musemodeller. Imidlertid er det først og fremst utviklet for å teste DG-avhengig læring (romlig mønster separasjon), og kan ikke være hensiktsmessig for etterforskningen av neurogenesis eller nevronale degenerasjon i andre områder av hjernen. I denne forbindelse er bruken av SPS-BM ytterligere begrenset av dens DG-spesifisitet (streng avhengighet av en funksjonell krets mellom EC II og DG og CA3 og CA1 og EC VI), og bør derfor ikke brukes for å undersøke oppgaver som involverer den monosynaptisk EC III - CA1 - EC V - krets.

Fremtidige anvendelser av fremgangsmåtene beskrevet her, kan omfatte å undersøke effekten av stamcelletransplantasjoner, farmasøytisktiske behandlinger på voksen hippocampus neurogenesis, og vev homeostase i hippocampus.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Moria MC17 Perforated Spoon	FST	10370-18	removal of the brains
Dissecting microscope	Carl Zeiss	Stemi SV8	removal of the brains
Surgical scissors	FST	14084-08	removal of the brains
Surgical scissors	FST	14381-43	removal of the brains
Dumont #5 forceps	FST	11254-20	removal of the brains
SuperFrost Slides	Carl Roth	1879	slides for immunohistochemistry
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	P6148	fixative
TissueTek OCT compound	Sakura Finetek	1004200018	embedding of the brains
Normal Goat Serum	Jackson Immunolabs	005-000-001	blocking in IHC
Normal Rabbit Serum	Jackson Immunolabs	011-000-001	blocking in IHC
Normal Donkey Serum	Jackson Immunolabs	017-000-001	blocking in IHC
anti-Neurofilament-M antibody	Developmental Studies Hybridoma Bank	2H3	IHC, Dilution 1:200
anti-Doublecortin antibody	sc-8066	Santa Cruz	IHC, Dilution 1:800
anti-GFP antibody	Abcam	ab290	IHC, Dilution 1:2,000
anti-BrdU antibody	OBT0030G	Accurate Chemicals	IHC, Dilution 1:2,000
Fluoro-Jade C	FJ-C	HistoChem	Determination of neuronal cell death
Betadine	Mundipharma	D08AG02	disinfectant
Cryomicrotome	Leica	CM1900	preparation of brain slices
Heparin sodium salt	Sigma-Aldrich	H3393	perfusion
Circular plate made from hard-plastic (diameter 120 cm)	lab made	none	plate for SPS-BM, diameter 120 cm
Buraton rapid disinfectant	Schülke Mayr	113 911	disinfectant
Video-tracking system TSE VideoMot 2 with Software Package VideoMot2	TSE Systems	302050-SW-KIT	tracking and analysis of SPS-BM
Triton X-100	Sigma Aldrich	T8787	permeabilization/IHC
Cryotome	Reichert Jung/Leica	Frigomobil 1206	preparation of 40 µm brain slices
Mowiol 4-88	Carl Roth	Art.-Nr. 0713	embedding of the slides
SYTOX green	Invitrogen	S7020	Nuclear staining
Food pellets (Kellog`s Froot Loops)	Kellog`s		SPS-BM
Prism, Version 3.0	Graph Pad Software, San Diego, USA		Statistical evaluation of SPS-BM
Zen 2008 or Zen 2011 Software	Carl Zeiss		Software (Confocal microscope)
D.P.X	Sigma-Aldrich	317616	mounting medium for Fluoro-Jade C staining