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Neuroscience

NF-κB निर्भर वयस्क neurogenesis के मॉड्यूलेशन और विश्लेषण के लिए तरीके

Published: February 13, 2014 doi: 10.3791/50870
Automatic Translation
1, 2, 2, 1, 1, 2
1Cell Biology, University of Bielefeld, 2Molecular Neurobiology, University of Bielefeld

Summary

NF-κB निर्भर वयस्क हिप्पोकैम्पस neurogenesis के हेरफेर और विश्लेषण के लिए तरीके से वर्णित हैं. एक विस्तृत प्रोटोकॉल चूहों में संज्ञानात्मक परिणाम की जांच के लिए एक दांतेदार गाइरस निर्भर व्यवहार परीक्षण (स्थानिक पैटर्न जुदाई बार्न्स उलझन कहा जाता है) के लिए प्रस्तुत किया है. इस तकनीक को भी अन्य प्रयोगात्मक सेटिंग में जांच के लिए सक्षम मदद करनी चाहिए.

Abstract

हिप्पोकैम्पस प्रासंगिक यादों के गठन और समेकन में एक निर्णायक भूमिका निभाता है, और स्थानिक उन्मुखीकरण में. ऐतिहासिक, वयस्क हिप्पोकैम्पस स्तनधारी मस्तिष्क का एक बहुत स्थिर संरचनात्मक क्षेत्र के रूप में देखा गया है. हालांकि, हाल के निष्कर्षों हिप्पोकैम्पस की दांतेदार गाइरस मौजूदा neuronal सर्किट के संशोधनों, लेकिन यह भी वयस्क neurogenesis न केवल शामिल है, वयस्कों में जबरदस्त plasticity के एक क्षेत्र है कि प्रदर्शन किया है. इस plasticity प्रतिलेखन कारक NF-κB एक प्रमुख भूमिका निभाता है, जटिल transcriptional नेटवर्क के द्वारा नियंत्रित किया जाता है. वयस्क neurogenesis NF-κB गतिविधि के अग्रमस्तिष्क विशिष्ट neuronal निषेध के लिए एक ट्रांसजेनिक माउस मॉडल का उपयोग किया जा सकता है अध्ययन और हेरफेर.

इस अध्ययन में, तरीकों इसके संरचनात्मक पहलुओं, neuronal apoptosis और पूर्वज प्रसार, और संज्ञानात्मक महत्व है, जो सहित NF-κB निर्भर neurogenesis के विश्लेषण के लिए वर्णित हैंज विशेष रूप से एक दांतेदार गाइरस (डीजी) पर निर्भर व्यवहार परीक्षण, स्थानिक पैटर्न जुदाई बार्न्स भूलभुलैया (एसपीएस-बी एम) के माध्यम से मूल्यांकन किया गया था. एसपीएस-बी.एम. प्रोटोकॉल बस वयस्क हिप्पोकैम्पस न्यूरोजेनेसिस पर विशेष जीनों के प्रभाव का आकलन करने के लिए डिजाइन अन्य ट्रांसजेनिक पशु मॉडल के साथ प्रयोग के लिए अनुकूलित किया जा सकता है. इसके अलावा, एसपीएस-बी.एम. औषधीय एजेंटों का उपयोग कर, उदाहरण के लिए, डीजी निर्भर सीखने की जांच और जोड़ तोड़ करने के उद्देश्य से अन्य प्रयोगात्मक सेटिंग में इस्तेमाल किया जा सकता है.

Introduction

Ontologically, हिप्पोकैम्पस सबसे पुराना ज्ञात संरचनात्मक मस्तिष्क संरचनाओं में से एक है. यह इस तरह के दीर्घकालिक स्मृति, स्थानिक उन्मुखीकरण, और संबंधित स्मृति के गठन और समेकन के नियमन में निर्णायक कार्यों के रूप में विविध जटिल कार्यों के लिए जिम्मेदार है. Anatomically, हिप्पोकैम्पस अपने subgranular क्षेत्र के भीतर ग्रेन्युल कोशिकाओं और कुछ neuronal progenitors होता है जो श्रृंग एम्मोनिस (सीए 1, CA2, सीए 3, और CA4) क्षेत्रों और दांतेदार गाइरस (गाइरस dentatus), सहित पिरामिड सेल परतों (परत pyramidale) के होते हैं . ग्रेन्युल कोशिकाओं तथाकथित दलदल का फाइबर (ग्रेन्युल कोशिकाओं के axons) के माध्यम से सीए 3 क्षेत्र की ओर परियोजना.

पिछली सदी के अंत तक, वयस्क स्तनधारी मस्तिष्क सेलुलर plasticity और neurogenesis कमी एक स्थिर अंग माना जा रहा था. हालांकि, पिछले दो दशकों के दौरान, सबूत के एक बढ़ती हुई राशि को स्पष्ट रूप में जगह लेने वयस्क neurogenesis दर्शाता है कम से कमदो मस्तिष्क क्षेत्रों, subventricular क्षेत्र (SVZ) और हिप्पोकैम्पस के subgranular क्षेत्र.

हमारे पिछले अध्ययनों, और अन्य समूहों के उन, प्रतिलेखन कारक NF-κB वयस्क neurogenesis की महत्वपूर्ण आणविक नियामकों में से एक है, और गंभीर संरचनात्मक हिप्पोकैम्पस दोषों और संज्ञानात्मक 1-6 में अपनी de-विनियमन परिणाम है कि पता चला है कि. NF-κB पांच डीएनए बाध्यकारी सब यूनिटों के विभिन्न dimeric संयोजन से बना एक inducible प्रतिलेखन कारक के जेनेरिक नाम है: P50, P52, C-रिलायंस, RelB, और p65 (असली), जिनमें से बाद के तीन transactivation डोमेन है. मस्तिष्क के भीतर, कोशिका द्रव्य में पाया सबसे प्रचुर रूप P50 और रूई बी (IκB) प्रोटीन का अवरोध करनेवाला द्वारा एक निष्क्रिय फार्म में रखा जाता है जो p65, के एक heterodimer है.

NF-κB संचालित न्यूरोजेनेसिस अध्ययन और सीधे हेरफेर करने के लिए, हम NF-κB subun का सब से सरल निषेध सक्षम करने के लिए ट्रांसजेनिक माउस मॉडल का उपयोगअपनी, विशेष रूप से अग्रमस्तिष्क 7 (1 चित्र देखें). और -/tTA - इस प्रयोजन के लिए, हम निम्नलिखित ट्रांसजेनिक माउस लाइनों, IκB / पार से पैदा की. ट्रांसजेनिक IκB / - लाइन NF-κB अवरोध करनेवाला IκBa (सुपर repressor IκBa-AA1) के एक पार प्रमुख नकारात्मक उत्परिवर्ती का उपयोग कर उत्पन्न किया गया था 8. जंगली प्रकार IκBα के विपरीत, IκBα-AA1 अवरोध करनेवाला की phosphorylation और बाद proteasomal गिरावट में बाधा जो alanines (V32 और V36), उत्परिवर्तित दो सेरीन अवशेष है. IκBa-AA1-transgene की अग्रमस्तिष्क न्यूरॉन विशेष अभिव्यक्ति के लिए, IκB / - चूहों चूहों एक कैल्शियम calmodulin निर्भर kinase को शरण देने के साथ पार नस्ल थे IIα टेट्रासाइक्लिन पार उत्प्रेरक (TTA) द्वारा संचालित किया जा सकता है कि (CAMKIIα) प्रमोटर 9.

p65 नाक आउट चूहों की वजह से बड़े पैमाने पर जिगर apoptosis 10, एक भ्रूण घातक phenotype है, तो यहाँ दिखाया दृष्टिकोण एक सुंदर तरीका प्रदान करता हैप्रसव के बाद और वयस्क neurogenesis में NF-κB की भूमिका की जांच के लिए.

स्थानिक सीखने और स्मृति अध्ययन करने के लिए क्लासिक व्यवहार परीक्षण रिचर्ड मॉरिस, मॉरिस पानी भूलभुलैया (MWM) 11 के रूप में जाना एक परीक्षण द्वारा 1980 के दशक में वर्णित किया गया था. इस खुले मैदान पानी भूलभुलैया में, जानवरों अभिविन्यास और अतिरिक्त भूलभुलैया cues पर आधारित एक छिपा मंच पर अपारदर्शी पानी से बचने के लिए सीख लो. MWM की एक सूखी संस्करण तथाकथित बार्न्स भूलभुलैया (बीएम) 12 है. इस परीक्षा में एक एक से बचने बॉक्स के रूप में परिभाषित किया छेद, और उन्मुखीकरण के लिए दृश्य अतिरिक्त भूलभुलैया cues के साथ, एक प्लेट की सीमा पर व्यवस्था 20 परिपत्र छेद के साथ एक परिपत्र प्लेट का इस्तेमाल करता. दोनों प्रयोगात्मक मानदंड एक कृंतक `के पानी के लिए घृणा, या खुला, चमकीले प्रबुद्ध रिक्त स्थान से प्रेरित उड़ान व्यवहार पर निर्भर हैं. दोनों परीक्षण स्थानिक उन्मुखीकरण की एक जांच, और संबंधित स्मृति प्रदर्शन की अनुमति. हिप्पोकैम्पस स्थानिक स्मृति गठन में एक सामान्य और आवश्यक भूमिका निभाता है, हिप्पोकैम्पस Rशामिल egions लागू परीक्षण के आधार पर अलग. बी.एम. में परीक्षण स्मृति enthorinal प्रांतस्था (ईसी) और डीजी 13-16 के योगदान के बिना हिप्पोकैम्पस के सीए 1 क्षेत्र में स्थित पिरामिड न्यूरॉन्स के बीच neuronal गतिविधि से उत्पन्न होती है. विशेष रूप से, क्लासिक बी.एम. मुख्य रूप से महत्वपूर्ण बात है, महानिदेशक महत्वपूर्ण प्रसंस्करण की न केवल तात्पर्य जो तथाकथित स्थानिक पैटर्न मान्यता 17, में शामिल है चुनाव आयोग वी. सीए 1 के लिए चुनाव आयोग III से monosynaptic temporo-ammonic मार्ग के माध्यम से नेविगेशन पर निर्भर करता है दृश्य और स्थानिक जानकारी है, लेकिन यह भी भिन्न, nonoverlapping अभ्यावेदन में समान प्रतिनिधित्व या यादों के परिवर्तन. इस कार्य सीए 1 और बी एम 15 में परीक्षण नहीं किया जा सकता है, जो चुनाव आयोग छठी, करने के लिए सीए 3 के लिए डीजी को चुनाव आयोग द्वितीय से एक कार्यात्मक त्रिकोणीय synaptic सर्किट की आवश्यकता है.

इन चुनौतियों का सामना करने के लिए, हम विशेष रूप से सह में दांतेदार गाइरस निर्भर संज्ञानात्मक प्रदर्शन का परीक्षण करने के लिए एक व्यवहार परीक्षण के रूप में एसपीएस-बी.एम. तैयार कर लिया हैntrol जानवरों, और NF-κB निषेध निम्नलिखित IκB / TTA सुपर repressor मॉडल में. महत्वपूर्ण बात है, MWM या बी.एम. के विपरीत, एसपीएस-बी.एम. neurogenesis की हानि से उत्पन्न सूक्ष्म व्यवहार घाटे प्रकट कर सकते हैं. स्थानिक पैटर्न जुदाई चुनाव आयोग द्वितीय और महानिदेशक और सीए 3 और सीए 1 और चुनाव आयोग छठी के बीच एक कार्यात्मक सर्किट पर सख्ती से निर्भर है, इस परीक्षण के भीतर संभावित neurogenesis में बदलाव, काई से भरा फाइबर मार्ग का संशोधन या ऊतक homeostasis के परिवर्तन के लिए बेहद संवेदनशील है महानिदेशक.

तकनीकी तौर पर, हमारे परीक्षण के सेट अप Clelland एट अल द्वारा अध्ययन पर आधारित है., स्थानिक जुदाई पैटर्न एक लकड़ी के 8 हाथ रेडियल भुजा भूलभुलैया (रैम) 19 का उपयोग कर परीक्षण किया गया था जिसमें. हमारे संशोधित सेट अप में, आठ हथियार सात समान पीला भोजन मकानों की जगह थी. संक्षेप में, तरीकों हिप्पोकैम्पस, काई से भरा फाइबर अनुमानों, neuronal सेल डे भीतर doublecortin व्यक्त (DCX +) कोशिकाओं का विश्लेषण सहित, यहाँ दिखाया गया हैएथलीट और विशेष रूप से एसपीएस-बी.एम. यहाँ प्रस्तुत, वयस्क neurogenesis पर प्रभाव पड़ता है कि transgenes शामिल अन्य माउस मॉडल की जांच करने के लिए लागू किया जा सकता है. इसके अलावा आवेदन औषधीय एजेंटों के अध्ययन और महानिदेशक और स्थानिक पैटर्न जुदाई पर उनके प्रभाव को मापने शामिल हो सकते हैं.

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Protocol

आचार बयान

इस अध्ययन के सरकारी पशु और देखभाल उपयोग समिति, राज्य नॉर्थ राइन वेस्टफेलिया, (डसेलडोर्फ, जर्मनी) के LANUV के नियमों के साथ सख्त अनुसार किया गया था. सभी पशु प्रयोगों लाइसेंस नंबर 8.87-51.04.20.09.317 (LANUV, NRW) के तहत LANUV, डसेलडोर्फ द्वारा अनुमोदित किया गया. सभी प्रयासों संकट और अध्ययन के लिए आवश्यक जानवरों की संख्या कम करने के लिए किए गए थे.

1. पशु की देखभाल और आवास

  1. फेडरेशन यूरोपीय प्रयोगशाला पशु विज्ञान एसोसिएशन (FELASA) द्वारा परिभाषित के रूप में यहाँ बताया प्रोटोकॉल में इस्तेमाल सभी जानवरों, विशिष्ट रोगज़नक़ मुक्त शर्तों के तहत रखा जाना चाहिए.
  2. HEPA हवा फ़िल्टर के साथ चूहे प्रतिदिन शर्तों (12 घंटा / प्रकाश अंधेरे चक्र) के तहत एक तापमान और आर्द्रता नियंत्रित (22 डिग्री सेल्सियस) कमरे में मानक पिंजरों में रखा जाना चाहिए.
  3. मानकीकृत भोजन और पानी यथेच्छ प्रदान की जानी चाहिए. </ ली>
  4. IκB / TTA और IκB / - अगर नियंत्रण चूहों का इस्तेमाल कर रहे हैं 7, 18 में वर्णित है, जीनोटाइपिंग पीसीआर आधारित, प्रत्येक जानवर के लिए किया जाना चाहिए.
  5. कम से कम चार दिन की उम्र का अंतर के साथ पुरुष जानवरों व्यक्तिगत परिवर्तनशीलता को कम करने के लिए इस्तेमाल किया जाएगा चाहिए.
  6. (वैकल्पिक): एनएफ-κB पुनर्सक्रियन प्रयोगों के लिए, डॉक्सीसाइक्लिन कम से कम 14 दिनों के लिए (2.5% sucrose के साथ 2 मिलीग्राम / एमएल) पीने के पानी में प्रशासित किया जाना चाहिए.

2. स्थानिक पैटर्न जुदाई बार्न्स भूलभुलैया (एसपीएस-बी एम)

  1. सभी व्यवहार परीक्षण अंतरराष्ट्रीय और स्थानीय दिशा निर्देशों के अनुसार किया जाना चाहिए.
  2. महत्वपूर्ण! छह महीने या उससे अधिक उम्र के इस दौर के साथ ही नर चूहों का प्रयोग करें. एक टेस्ट श्रृंखला के जानवरों के बीच उम्र का अंतर कम से कम चार दिन किया जाना चाहिए. परीक्षण के प्रत्येक श्रृंखला के लिए एक ही ऑपरेटर द्वारा किया जाना चाहिए. चूहों आगे आंशिक रूप से प्रेरित प्रेरणा को बढ़ाने के लिए पहले परीक्षण के लिए एक मानक आहार प्राप्त करना चाहिएweet खाद्य इनाम.
  3. मुश्किल प्लास्टिक से बने एक सफेद परिपत्र थाली सेट अप कम से कम 4 एक्स 80 डब्ल्यू और 3 एक्स 215 डब्ल्यू नियॉन फ्लोरोसेंट लैंप के साथ प्रकाशित एक नमी और तापमान नियंत्रित कक्ष (22 डिग्री सेल्सियस), में (व्यास 120 सेमी, चित्रा 5A देखें) . महत्वपूर्ण! चूहों की प्रेरणा आंशिक रूप से उज्ज्वल, उजागर स्थानों के लिए उनकी घृणा से प्रेरित है खाद्य घरों में प्रवेश करने के लिए, के रूप में सही रोशनी प्रयोग किया जाता है सुनिश्चित करें.
  4. वीडियो ट्रैकिंग प्रणाली की स्थापना की. कैमरा 115 सेमी प्लेट के केंद्र (चित्रा 5A देखें) से ऊपर रखा जाना चाहिए.
  5. जानवरों, प्लेट की सीमा से लगभग 100 सेमी (चित्रा 5A देखें) के लिए आसानी से दिखाई पदों में एक सफेद रंग का कपड़ा करने के बहुरंगी अतिरिक्त भूलभुलैया cues (EMC) संलग्न करें.
  6. ध्यान से प्रयोगात्मक सेट अप से किसी भी गंध को दूर कर सकते हैं कि एक तेजी से कीटाणुनाशक के साथ थाली साफ.
  7. सात समान पीला भोजन घरों (12 सेमी x 7 सेमी x 8 सेमी, देख चित्रा 5A रखें (चित्रा 5A देखें) स्पष्ट रूप से चिह्नित किया जाना चाहिए.
  8. चित्रा 5 ए, केवल एक परिभाषित भोजन घर पशु (स्थान एफ के लिए आसानी से सुलभ होने के साथ (चित्रा 5A देखें) परिभाषित पदों पर सभी खाद्य घरों के अंदर मीठा भोजन गोली पुरस्कार (एक Kellogs `s Froot लूप / खाद्य घर के एक चौथाई) देखें रखें ). पारदर्शी पन्नी के साथ nontarget भोजन घरों को बंद करें.
  9. परीक्षण करने से पहले, आदी (कार्य शुरू करने से पहले एक दिन) करते हैं. सभी खाद्य घरों आज़ादी से सुलभ बनाने और चूहों आज़ादी भूलभुलैया का पता लगाने के लिए और एक भोजन गोली इनाम (10 मिनट / पशु) को पुनः प्राप्त करने के लिए अनुमति देते हैं.
  10. पर कंप्यूटर और कैमरा स्विच और वीडियो ट्रैकिंग सिस्टम सॉफ्टवेयर शुरू करते हैं.
  11. रिकॉर्डिंग शुरू.
  12. परिपत्र प्लेट पर परिभाषित प्रारंभ बिंदु (चित्रा 5 ए, एस: स्थिति शुरू) पर पशु रखें और चूहों 10 मिनट के लिए लक्ष्य खाद्य घर के लिए खोज करने के लिए अनुमति देते हैं.
  13. एसटूपी वीडियो ट्रैकिंग.
  14. महत्वपूर्ण! तेजी कीटाणुनाशक के साथ प्रत्येक परीक्षण के बाद परिपत्र प्लेट और भोजन घरों को साफ करें.
  15. (प्रत्येक जानवर के लिए) लगातार सात दिनों के लिए दैनिक परीक्षण दोहराएँ.
  16. उचित आँकड़े सॉफ्टवेयर का उपयोग कर परिणाम (विलंबता, दूरी तय की और त्रुटियों) का विश्लेषण. गलत भोजन घर और / या प्रवेश करने और भोजन गोली इनाम पुन: प्राप्त करने के बिना उचित बॉक्स के साथ संपर्क के करीब पहुंच के रूप में त्रुटियों को परिभाषित करें. समूहीकृत विश्लेषण के लिए Bonferroni बाद अस्थायी परीक्षण के साथ दो तरह से एनोवा का उपयोग करें.
  17. (वैकल्पिक) चूहों बलिदान और नीचे के रूप में वर्णित हिप्पोकाम्पी का विश्लेषण.

3. BrdU लेबलिंग

  1. 3 दिन (भेदभाव और एकीकरण का विश्लेषण) या एक इंजेक्शन (प्रसार का विश्लेषण) के लिए 200 मिलीग्राम / किग्रा आईपी के लिए एक बार दैनिक intraperitoneally 50 मिलीग्राम / किग्रा आईपी BrdU इंजेक्षन.
  2. , जानवरों बलिदान हिप्पोकैम्पस काटना और नीचे वर्णित के रूप में 40 माइक्रोन वर्गों तैयार करते हैं.
  3. Denaturate10 मिनट के लिए 2 एम एचसीएल के साथ वर्गों और 10 मिनट के लिए 0.1 एम borate बफर में सेते हैं.
  4. BrdU के खिलाफ एंटीबॉडी का उपयोग कर नीचे वर्णित के रूप में, immunohistochemically प्रत्येक जानवर से 40 माइक्रोन वर्गों (अलावा 240 मीटर) के एक एक में बारह श्रृंखला लेबल.
  5. दाना सेल परत और subgranular क्षेत्र के rostrocaudal हद भर confocal माइक्रोस्कोपी विश्लेषण द्वारा लेबल कोशिकाओं यों. डीजी प्रति लेबल कोशिकाओं की कुल संख्या प्राप्त करने के लिए दो से हिप्पोकैम्पस और विभाजन प्रति BrdU लेबल की कोशिकाओं की अनुमानित कुल संख्या प्राप्त करने के लिए 12 से परिणामस्वरूप संख्या गुणा.

4. Nonperfused पशु से दिमाग और cryosections की तैयारी को हटाया

  1. पशुओं euthanizing के लिए स्थानीय स्तर पर अनुमोदित प्रक्रियाओं का पालन. चूहे सीधे गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था से euthanized किया जा सकता है.
  2. (वैकल्पिक) पशु intraperitoneal inje द्वारा जैसे, स्थानीय और अंतरराष्ट्रीय दिशा निर्देशों के अनुसार euthanization से पहले anesthetized किया जा सकता है(हौसले से खारा या शारीरिक बफर के 1.85 मिलीलीटर के साथ 2.2 मिलीग्राम 2,2,2-tribromoethanol isoamyl इथेनॉल एमएल 1 में से बने 150 मिलीलीटर शेयर समाधान के मिश्रण से बना) एक 33 ग्राम माउस के लिए 0.8 मिलीलीटर Avertin की ction.
  3. Betadine (10% povidone आयोडीन) से लथपथ 70% इथेनॉल में भिगो धुंध के साथ बाद में धुंध और झाड़ू के साथ सिर जीवाणुरहित.
  4. उपयुक्त शल्य कैंची का उपयोग पशु सिर काटना और अलग त्वचा खींच.
  5. (वैकल्पिक) fixators वापस मंद त्वचा की तह से बचने के लिए लागू किया जा सकता है.
  6. खोपड़ी में एक midline चीरा और ध्यान से अलग खोपड़ी के टुकड़े खींच.
  7. ध्यान से एक उपयुक्त शल्य चिकित्सा उपकरण (जैसे मोरिया चम्मच) का उपयोग करते हुए पूरे मस्तिष्क को हटा दें.
  8. सूखी बर्फ पर -30 -40 डिग्री सेल्सियस के लिए एक 50 मिलीलीटर बीकर (जैसे Schott डुरान) में 2 methylbutane की Precool 25 मिलीलीटर.
    नोट: आदर्श लेजर confocal माइक्रोस्कोपी स्कैनिंग के लिए उपयुक्त हैं जो "मोटी" वर्गों के मुक्त अस्थायी धुंधला के लिए, मस्तिष्क को हटाने, 3 धोनेमस्तिष्क (आमतौर पर रातोंरात) नीचे करने के लिए नीचे डूब गया है जब तक फॉस्फेट में 4 डिग्री सेल्सियस पर बफर और दुकान में बार 50 मिलीलीटर ट्यूब में 30% sucrose के समाधान बफर.
  9. ध्यान Nescofilm (Parafilm) के एक टुकड़े पर मस्तिष्क जगह और TissueTek अक्टूबर यौगिक की पर्याप्त राशि के साथ कवर, -80 डिग्री सेल्सियस उपयोग करें जब तक पर 2 methylbutane, दुकान में Nescofilm पर रोक.
    नोट: 9% सुक्रोज, 7 मिमी 2 MgCl, 50 मिमी फॉस्फेट बफर, 44% ग्लिसरॉल में -20 डिग्री सेल्सियस की दुकान पर लंबे समय भंडारण के लिए.
  10. उचित cryomicrotome पर 10-12 माइक्रोन मोटी वर्गों में मस्तिष्क कट.
    नोट: मोटी, मुक्त अस्थायी वर्गों के लिए, (उदाहरण के रीचर्ट जंग, Frigomobil.) और -20 डिग्री पर 40 माइक्रोन क्षैतिज वर्गों में कटौती उचित cryotome की cryotome मंच पर मस्तिष्क फ्रीज - 25 डिग्री सेल्सियस ठीक ब्रश के साथ चाकू से वर्गों लीजिए और बफर में इकट्ठा या लंबे समय के भंडारण के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर (4.9 कदम) भंडारण समाधान में रहते हैं.
  11. ध्यान से एक खुर्दबीन स्लाइड पर दो स्लाइस माउंट. हमेंSuperfrost UltraPlus स्लाइड्स के ई अत्यधिक वर्गों के आसंजन को अधिकतम करने की सिफारिश की है.
  12. कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए स्लाइड सूखी. स्लाइड्स का उपयोग जब तक -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है.

5. Perfused पशु से वर्गों की तैयारी

  1. (4.2 कदम) ऊपर वर्णित के रूप में पशुओं anesthetize.
  2. ध्यान से 10-15 मिनट के लिए पीबीएस में 4% paraformaldehyde द्वारा पीछा 2-4 मिनट के लिए बफर फॉस्फेट हेपरिन युक्त खारा (पीबीएस) (0.025 g/100 मिलीलीटर पीबीएस) और प्रोकेन (0.5 g/100 मिलीलीटर पीबीएस), के साथ transcardially पशु छिड़कना . छिड़काव बेहतर लगभग 1.2-1.4 मीटर या लगभग 15 मिलीग्राम / मिनट के लिए सेट एक क्रमिक वृत्तों में सिकुड़नेवाला पंप के उपयोग की एक हीड्रास्टाटिक दबाव का उपयोग बाएं वेंट्रिकल और सही आलिंद के उद्घाटन के माध्यम से perfusing द्वारा किया जाता है. कोई लाल रक्त वाहिकाओं दिखाई जा रही के साथ एक पीला सफेद मस्तिष्क में इष्टतम छिड़काव का परिणाम है.
  3. काटना और 24 घंटे के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 4% paraformaldehyde में दिमाग के बाद तय कर लो.
  4. क्रायोकम से कम 24 घंटे के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर पीबीएस में 30% sucrose में दिमाग की रक्षा करना.
  5. Cryotome मंच पर दिमाग रुक.
  6. एक उपयुक्त cryotome का उपयोग पूरे forebrains से 40 माइक्रोन क्षैतिज वर्गों को तैयार है.
  7. स्लाइड्स -20 डिग्री सेल्सियस उपयोग करें जब तक पर cryoprotectant समाधान (0.1 एम फॉस्फेट बफर, 50% ग्लिसरॉल, 0.14% 2 MgCl, 8.6% sucrose) में संग्रहीत किया जा सकता है.

6. Nonperfused पशु के मस्तिष्क वर्गों के immunohistochemistry

  1. 10 मिनट के लिए -20 डिग्री सेल्सियस ठंड मेथनॉल का उपयोग, ऊपर वर्णित के रूप में तैयार cryosections, परसर्ग.
  2. 4 डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात (माध्यमिक एंटीबॉडी में बढ़ोतरी के लिए इस्तेमाल किया गया था जो प्रजाति से) 0.3% ट्राइटन-X युक्त 5% सामान्य सीरम के साथ ब्लॉक
  3. 1x पीबीएस के साथ 3x कुल्ला और 4 डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ सेते
  4. 1x पीबीएस के साथ 3x कुल्ला और एक घंटे के लिए कमरे के तापमान पर माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ सेते हैं.
  5. 1x पीबीएस के साथ 3x कुल्ला
  6. CouSytox ग्रीन, या DAPI (या एक वैकल्पिक डीएनए डाई) का उपयोग करते हुए डीएनए के लिए खंड nterstain.
  7. 1x पीबीएस के साथ 3x कुल्ला
  8. एक जलीय embedding मध्यम वर्गों में शामिल करें.
  9. Embedding मध्यम कम से कम 48 घंटे के लिए भाजन करते हैं.

7. Perfused पशु के मस्तिष्क वर्गों के immunohistochemistry

  1. 6.2 कदम में वर्णित है और बाद में 4 डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात 0.3% ट्राइटन-X (मुक्त अस्थायी) से युक्त पीबीएस में पतला प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान में तय मस्तिष्क वर्गों सेते के रूप में ब्लॉक
  2. 1x पीबीएस के साथ तीन बार कुल्ला और 3 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर 0.3% ट्राइटन-X (मुक्त अस्थायी) से युक्त पीबीएस में पतला एंटीबॉडी के समाधान में सेते हैं.
  3. 1x पीबीएस के साथ 3x कुल्ला
  4. Sytox हरे या DAPI (या एक वैकल्पिक डीएनए डाई) का उपयोग करते हुए डीएनए के लिए खंड counterstain.
  5. 1x पीबीएस के साथ तीन बार कुल्ला
  6. एक जलीय embedding मध्यम वर्गों में शामिल करें.
  7. Embedding मध्यम एक के लिए भाजन दो.टी कम से कम 48 घंटे.

8. काई से भरा फाइबर अनुमानों की जांच

  1. , जानवरों बलिदान ऊपर वर्णित के रूप में 40 माइक्रोन राज्याभिषेक वर्गों को तैयार करने और neurofilament एम. के लिए एंटीबॉडी का उपयोग हिप्पोकैम्पस अनुभाग दाग
  2. काई से भरा फाइबर और नाभिक कल्पना करने के लिए एक लेजर confocal खुर्दबीन स्कैनिंग का उपयोग उचित तरंगदैर्ध्य वर्गों स्कैन करें. कम बढ़ाई स्कैनिंग शुरू.
  3. उन्मुखीकरण के लिए कम बढ़ाई छवियों का उपयोग करें और काई से भरा फाइबर अनुमानों के साथ हिप्पोकैम्पस लक्ष्य.
  4. उच्च संकल्प और उच्च वृद्धि पर वर्गों (z-सेक्शनिंग) स्कैन.
  5. एनएफ-M के लिए धुंधला हो जाना के माध्यम से कल्पना की दलदल का फाइबर की रूपात्मक उपस्थिति और कनेक्टिविटी का विश्लेषण करें.
  6. (वैकल्पिक) हिप्पोकैम्पस ब्लेड के आकार और मात्रा का विश्लेषण करें. माप के लिए डीएनए संकेत का उपयोग करें.

9. फ्लोरो जेड सी परख (neuronal सेल मौत)

  1. जानवरों के बलिदान, hippoc काटनाampus, और ऊपर वर्णित के रूप में 12 माइक्रोन वर्गों तैयार करते हैं.
  2. वर्गों कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए सूखी.
  3. कमरे के तापमान पर 40 मिनट के लिए 4% पीएफए ​​में वर्गों को ठीक करें.
  4. संक्षेप वर्गों DDH 2 ओ के साथ 3X धोने
  5. निरंतर, कोमल झटकों के तहत 10 मिनट के लिए 0.06% पोटेशियम परमैंगनेट (KMnO 4) के साथ वर्गों सेते हैं.
  6. वर्गों DDH 2 ओ के साथ 3x धोने
  7. कमरे के तापमान पर 20 मिनट के लिए 0.002% फ्लोरो जेड सी समाधान के साथ वर्गों सेते हैं.
  8. (वैकल्पिक) एक साथ परमाणु stainings के लिए, 0.002% फ्लोरो जेड सी समाधान 10 माइक्रोग्राम / एमएल DAPI के साथ पूरक हो सकता है.
  9. संक्षेप वर्गों DDH 2 ओ के साथ 3X धोने
  10. वर्गों कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए सूखी.
  11. Xylene साथ वर्गों सेते (1 मिनट)
  12. एक Xylene आधारित बढ़ते मध्यम (dpx) का उपयोग कर वर्गों माउंट.

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Representative Results

IκB / के संकरण - और TTA ट्रांसजेनिक माउस लाइनों हिप्पोकैम्पस में NF-κB गतिविधि की सशर्त निषेध की ओर जाता है.

डबल ट्रांसजेनिक माउस (चित्रा 1 ए) में IκBα-AA1-transgene की अभिव्यक्ति की जांच, दिमाग, पृथक cryosectioned और GFP (हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन) के खिलाफ एक एंटीबॉडी का उपयोग दाग रहे थे. लेजर confocal माइक्रोस्कोपी स्कैनिंग सीए 1 और सीए 3 क्षेत्रों में transgene की उच्च अभिव्यक्ति का पता चला, और महानिदेशक (चित्रा 1 बी).

IκBα-AA1-transgene प्रकार -2 बी progenitors में व्यक्त किया है, और मध्यवर्ती अपरिपक्व राज्यों में और परिपक्व ग्रेन्युल कोशिकाओं में सक्रिय है.
हिप्पोकैम्पस तंत्रिकाजन्य क्षेत्र में CAMKIIα संचालित IκBα-AA1 व्यक्त जल्द से जल्द सेल प्रकार का निर्धारण करने के लिए, IκB / TTA जानवरों से हिप्पोकाम्पी की cryosections doublecortin के लिए दाग रहे थे(DCX) और transgene (GFP). Confocal विश्लेषण CAMKIIα गतिविधि द्वारा transgene (चित्रा 2, तीर) की अभिव्यक्ति की प्रेरण का संकेत है, युवा DCX पॉजिटिव ग्रेन्युल कोशिकाओं में GFP संकेतों का पता चला.

IκBα-AA1 के माध्यम से neuronal NF-κB निषेध कोईदार फाइबर अनुमानों, और मोटाई और महानिदेशक की मात्रा कम कर देता है.

IκB / TTA और IκB / के हिप्पोकैम्पस के राज्याभिषेक वर्गों - चूहों कोईदार फाइबर अनुमानों कल्पना करने neurofilament एम (एनएफ एम) के लिए दाग, और जटिल और स्तबकीय संगठन (चित्रा 3) प्रकट कर रहे थे. IκB / TTA चूहों में, काई से भरा फाइबर अनुमानों गंभीर रूप से प्रभावित हुए थे. इसके अलावा, NF-κB निषेध एक काफी कम suprapyramidal ब्लेड मोटाई और एक छोटे महानिदेशक मात्रा (3B चित्रा) का नेतृत्व किया.

IκB / TTA चूहों में NF-κB के neuronal निषेध ऊंचा neuronal DEGEN की ओर जाता हैeration, neurogenesis वृद्धि हुई है, और DCX व्यक्त progenitors के एक परेशान प्रवास.

ताजा नाटकीय संरचनात्मक दोषों, के लिए संभावित कारणों का अध्ययन करने के लिए, IκB / TTA चूहों से unfixed hippocampal स्लाइस neuronal सेल मौत की विशिष्ट पहचान (चित्रा -4 ए) की अनुमति देता है जो फ्लोरो जेड सी, के साथ दाग रहे थे. इधर, degenerating neurites की एक नाटकीय रूप से वृद्धि हुई संख्या एक ट्रांसजेनिक नियंत्रण के साथ तुलना, डबल ट्रांसजेनिक जानवरों में मनाया गया. इसके अलावा, cleaved कस्पासे -3 पॉजिटिव apoptotic कोशिकाओं की एक उल्लेखनीय वृद्धि IκB / TTA चूहों में पाया गया था. इसके विपरीत, DCX के खिलाफ immunohistochemical धुंधला IκB / TTA चूहों के दिमाग में DCX + कोशिकाओं की मात्रा में वृद्धि की काफी का पता चला. , इसके अलावा, IκB / टीटी A-हिप्पोकाम्पी में DCX + कोशिकाओं subgranular क्षेत्र में विशेष रूप से व्यवस्थित नहीं किया गया, लेकिन यह भी डीजी (चित्रा 4 बी) की गहरी क्षेत्रों में पाए गए जबकि DCX + progenitors मैंn नियंत्रण जानवरों subgranular क्षेत्र के भीतर लगभग विशेष रूप से स्थानीयकृत थे. DCX व्यक्त कोशिकाओं की वृद्धि की राशि पहले progenitors की परिपक्वता या सीधे कारण DCX + कोशिकाओं के प्रसार के लिए की एक परिणाम है, तो परीक्षण करने के लिए, BrdU तो cryosectioned और DCX के साथ दाग थे जो IκB / TTA और नियंत्रण चूहों के हिप्पोकाम्पी, में इंजेक्ट किया गया था और BrdU (चित्रा 4). प्रसार के विश्लेषण के लिए, BrdU 24 घंटे के बाद विश्लेषण के बाद, (चित्रा 4 बी, स्कीम देखें) एक बार इंजेक्ट किया गया था. भेदभाव के विश्लेषण के लिए, तीन इंजेक्शन सात दिनों के बाद विश्लेषण के बाद, दैनिक प्रदर्शन किया गया. तीन धारावाहिक इंजेक्शन दृष्टिकोण डीजी में BrdU / DCX + कोशिकाओं का एक स्पष्ट रूप से वृद्धि हुई राशि का पता चला है, जबकि एक भी BrdU इंजेक्शन के बाद, IκB/tTA- और नियंत्रण जानवरों के बीच BrdU पॉजिटिव कोशिकाओं की कुल संख्या में कोई महत्वपूर्ण मतभेद, मनाया गया IκB / TTA चूहों की. यह बताता है कि परेशान भेदभाव या DCX-पूर्व के एकीकरणदबाने कोशिकाओं DCX + कोशिकाओं की बढ़ी संख्या के कारण, और टाइप 3 कोशिकाओं शामिल थे पता चलता है कि हो सकता है.

गंभीर सीखने दोष में NF-κB परिणाम के neuronal निषेध, स्थानिक पैटर्न जुदाई बार्न्स उलझन परीक्षण के द्वारा प्रदर्शन किया. विशेष रूप से एक डीजी निर्भर कार्य में डबल ट्रांसजेनिक चूहों के व्यवहार का परीक्षण करने के लिए, हम एसपीएस-बी.एम. का उपयोग किया था जिससे जानवरों सूक्ष्म अंतर के साथ स्थानों (चित्रा 5) के बीच अंतर करने के लिए है. इस व्यवहार परीक्षण में, IκB / - नियंत्रण जानवरों प्रयोग के पहले दिन (चित्रा 5) पर क्रमानुसार खाद्य घरों का पता लगाया. प्रशिक्षण के सात दिनों के बाद, जानवरों सीधे खुले खाद्य घर मिल पा रहे थे. इसके विपरीत, IκB / TTA जानवरों भी प्रशिक्षण (चित्रा 5 ब) के बाद, क्रमानुसार खाद्य घरों का पता लगाने के लिए जारी रखा. कवर दूरी में काफी बढ़ जाती है, और उच्च सुप्तावस्था और ईआर का अवलोकनIκB / साथ तुलना IκB / TTA पशुओं में आतंक विरोधी दरों, - नियंत्रण जानवरों, इन जानवरों गंभीर सीखने दोष (चित्रा 5C) था कि पता चलता है.

चित्रा 1
चित्रा 1. NF-κB गतिविधि का एक सशर्त अग्रमस्तिष्क विशिष्ट निषेध की पीढ़ी. वयस्क हिप्पोकैम्पस न्यूरोजेनेसिस में NF-κB की भूमिका का अध्ययन के लिए इस्तेमाल किया ट्रांसजेनिक मॉडल की ए योजनाबद्ध ड्राइंग. कैल्शियम calmodulin निर्भर kinase IIα (CAMKIIα) प्रमोटर संचालित टेट्रासाइक्लिन transactivator (TTA) चूहों एक हरे रंग का फ्लोरोसेंट प्रोटीन के साथ संयुक्त एक पार प्रमुख नकारात्मक उत्परिवर्ती IκBa (IκB चूहों में IκBa-AA1 सुपर repressor) की अभिव्यक्ति को विनियमित करने के लिए इस्तेमाल किया गया ट्रेसर (GFP). IκB / TTA चूहों में, NF-κB अपने निष्क्रिय स्टेशन में कोशिका द्रव्य में रखा जाता हैGFP प्रतिदीप्ति के माध्यम से पता लगाया जा सकता है जो nondegradable IκBa-AA1, द्वारा ते. निषेध IκB / TTA चूहों (सीए 1, सीए 3 और डीजी) के विभिन्न हिप्पोकैम्पस क्षेत्रों में TTA. बी प्रतिनिधि transgene अभिव्यक्ति को रोकता है जो डॉक्सीसाइक्लिन, से उलट हो सकता है. Cryosections IκB / के अलग दिमाग से तैयार थे - और IκB / TTA चूहों, और GFP के खिलाफ एक एंटीबॉडी का उपयोग तय की और दाग रहे थे. Transgene अत्यधिक महानिदेशक भीतर व्यक्त किया है कि ध्यान दें. डी: dendrites, डीजी: दांतेदार गाइरस, एमएल: आणविक परत, एसएल: परत Lucidum. बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें.

चित्रा 2
चित्रा 2. IκBa-AA1 transgene में व्यक्त किया है DCX पॉजिटिव, टाइप -2 बी progenit अन्य रैंकों और आगे मध्यवर्ती राज्यों में और परिपक्व ग्रेन्युल कोशिकाओं में सक्रिय है. Doublecortin (DCX) धुंधला और GFP अभिव्यक्ति के साथ IκB / TTA जानवरों की ए Cryosectioned हिप्पोकाम्पी युवा DCX पॉजिटिव ग्रेन्युल कोशिकाओं (तीर) में transgene की अभिव्यक्ति प्रकट करते हैं. महानिदेशक: दांतेदार गाइरस, एमएल: आणविक परत दाना सेल के विकास के दौरान विभिन्न विकास के चरणों में transgene अभिव्यक्ति की बी योजनाबद्ध ड्राइंग.. IκBa-AA1-transgene अभिव्यक्ति DCX पॉजिटिव, टाइप -2 बी progenitors, सभी मध्यवर्ती अपरिपक्व राज्यों में और परिपक्व ग्रेन्युल कोशिकाओं में पाया गया. इसके विपरीत, (DCX अभिव्यक्ति की कमी) जल्दी टाइप -1 और टाइप -2 ए progenitors transgene व्यक्त नहीं किया था, और इसलिए NF-κB निषेध से प्रभावित नहीं थे. Kempermann एट अल. 20 के बाद संशोधित बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें.

ays "> चित्रा 3
चित्रा 3. NF-κB निषेध एकल ट्रांसजेनिक नियंत्रण (IκB / -) की तुलना में, बिगड़ा कोईदार फाइबर अनुमानों के और एक कम महानिदेशक मोटाई और IκB / TTA चूहों में मात्रा की ओर जाता है. Neurofilament एम (एनएफ एम) के लिए cryosectioned हिप्पोकाम्पी की ए Immunostaining कोईदार फाइबर अनुमानों कल्पना करने के लिए. नियंत्रण चूहों में (IκB / -), सीए 3 में अपने लक्ष्य कोशिकाओं को दाना कोशिकाओं को जोड़ने के दलदल का फाइबर की एक जटिल और स्तबकीय संगठन IκB / TTA चूहों में NF-κB के neuronal निषेध के बाद बिगड़ा हुआ था, जो स्पष्ट है. इसके अलावा, सुपर repressor की अभिव्यक्ति एक काफी कम suprapyramidal ब्लेड मोटाई (बाएं और दाएं पैनल में तीर तुलना) और एक कम महानिदेशक मात्रा. बी मात्रा और NF-κB अवरोध से उत्पन्न संरचनात्मक दोषों का सांख्यिकीय विश्लेषण करने के लिए नेतृत्व. Unpaired टी परीक्षण, दो पूंछ. एट अल Imielski के OA संस्करण से लिया डेटा. 2 बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें.

चित्रा 4
चित्रा 4. IκB / TTA चूहों में NF-κB का निषेध neuronal सेल मौत, बढ़ाया neurogenesis, और DCX व्यक्त कोशिकाओं की एक परेशान प्रवासी पैटर्न वृद्धि की ओर जाता है. नियंत्रण - ए न्यूरॉन विशेष फ्लोरो जेड सी धुंधला और हिप्पोकैम्पस वर्गों में cleaved कस्पासे -3 पॉजिटिव कोशिकाओं की बढ़ी संख्या IκB / में से IκB / TTA चूहों में neuronal सेल मौत का एक उच्च स्तर का पता चलता है. Degenerating neurites तीर से चिह्नित कर रहे हैं, और नाभिक तारों से संकेत कर रहे हैं. सही साइट: cleaved कस्पासे 3 पीओ की मात्रा का ठहरावहिप्पोकाम्पी भीतर sitive कोशिकाओं अत्यधिक डबल ट्रांसजेनिक जानवरों में apoptosis वृद्धि हुई चलता है. DCX के लिए हिप्पोकैम्पस cryosections के बी धुंधला डबल ट्रांसजेनिक जानवरों में DCX व्यक्त कोशिकाओं की संख्या में वृद्धि का पता चलता है. . नियंत्रण सी. - IκB / टीटी A-हिप्पोकाम्पी में DCX + कोशिकाओं subgranular क्षेत्र में विशेष रूप से व्यवस्था की है, लेकिन IκB / में से डीजी में गहरी माइग्रेट नहीं हैं नोट पैनल छोड़ दिया:. प्रसार पर transgene के प्रभाव का परीक्षण करने के लिए, एक भी BrdU इंजेक्शन IκB / TTA और नियंत्रण के बीच BrdU पॉजिटिव कोशिकाओं की संख्या राइट पैनल में कोई महत्वपूर्ण मतभेद में हुई है, जो प्रदर्शन किया था: सांख्यिकीय मूल्यांकन एक महत्वपूर्ण पता चला तीन दैनिक BrdU-इंजेक्शन के बाद IκB / TTA पशुओं में DCX व्यक्त कोशिकाओं में वृद्धि हुई है. विश्लेषण सात दिन पिछले इंजेक्शन (भेदभाव और एकीकरण का परीक्षण) के बाद किया गया था. BrdU / DCX + में एक उल्लेखनीय वृद्धि मैं के डीजी में खोजा गया थाκB / TTA चूहों (n = 3). डाटा आंशिक रूप से Imielski एट अल. 2 के OA संस्करण से लिया बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें.

चित्रा 5
चित्रा 5. सेट अप और स्थानिक पैटर्न जुदाई बार्न्स भूलभुलैया (एसपीएस-बी एम) के विशिष्ट परिणाम है. ए वाम: प्रयोगात्मक सेट अप के योजनाबद्ध ड्राइंग. सात समान भोजन घरों (एक ही रंग, आकार और आकृति) एक मुक्त स्थान (प्रारंभिक बिंदु, एस) के साथ, हार्ड निष्क्रिय प्लास्टिक (120 सेमी के व्यास) से निर्मित एक दौर, घर का बना थाली के परिभाषित स्पॉट पर संतुलित रूप से रखे गए थे. बहुरंगी अतिरिक्त भूलभुलैया cues (EMC) बी से पशुओं, लगभग 100 सेमी करने के लिए आसानी से दिखाई पदों में एक सफेद रंग का कपड़ा के सामने से जुड़े होते हैंथाली का आदेश. गंध द्वारा अभिविन्यास से बचने के लिए भोजन छर्रों हर घर में जमा है, लेकिन केवल एक खाद्य घर सुलभ (पारदर्शी पन्नी से बना बंद) कर रहे हैं. अधिकार:, और अतिरिक्त भूलभुलैया cues एक एसपीएस-बी.एम. परीक्षण के बी ठेठ प्रयोगात्मक परिणाम सहित सेट अप की एक तस्वीर.: वीडियो कैमरा प्लेट (115 सेमी की थाली से दूरी) पर ध्यान केंद्रित किया. IκB / - नियंत्रण पशु टेस्ट मैचों की सीरीज के पहले दिन क्रमानुसार खाद्य घरों की पड़ताल, और खुले खाद्य घर तुरंत प्रशिक्षण के सात दिनों के बाद पाया जाता है. और IκB / TTA पशु -. इसके विपरीत, IκB / TTA चूहों भी प्रशिक्षण चरण IκB / में एसपीएस-बी.एम. में मापा मापदंडों के सी. तुलना करने के बाद धारावाहिक की खोज के द्वारा प्रदर्शन के रूप में गरीब सीखने, प्रकट करते हैं. डबल ट्रांसजेनिक चूहों महत्वपूर्ण स्मृति घाटे दिखाएँ (n = 9) नियंत्रण (एन = 8) विलंबता के लिए सम्मान के साथ, दूरी तय की और त्रुटि दर की तुलना में. दो तरह से एनोवा मूल्यांकन, त्रुटि पट्टियाँ: सेम. बी में डाटा औरसी एट अल Imielski के OA संस्करण से लिया गया था. 2 बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें.

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Discussion

वयस्क neurogenesis, और डॉक्सीसाइक्लिन के माध्यम से न्यूरॉन्स में NF-κB का निषेध है, और उसके बाद में पुनः सक्रियण के माध्यम से अपने गड़बड़ी की संभावना, वयस्क मस्तिष्क, साथ ही neuronal डे और पुनः पीढ़ी में में नवजात न्यूरॉन्स की जांच के लिए एक आकर्षक प्रणाली प्रदान करता है . इस प्रणाली की खूबसूरती है कि neuronal सेल मौत, पूर्वज प्रसार और प्रवास, और गंभीर संरचनात्मक और शारीरिक परिवर्तन, लेकिन यह भी स्पष्ट सीखने दोष में में परिवर्तन में न्यूरॉन्स परिणाम ही नहीं में NF-κB संकेतन मार्ग अवरोध. महत्वपूर्ण बात है, IκB / TTA जानवरों के phenotype प्रयोगात्मक उलट और doxycyclin के प्रशासन के बाद बचाया जा सकता है. Phenotype के इस प्रत्यावर्तन संरचनात्मक पहलुओं में शामिल हैं, और भी डीजी निर्भर 2 सीखने में महत्वपूर्ण सुधार हो सकता है.

व्यवहार प्रयोगों के लिए एक व्याख्या परिणाम सुनिश्चित करने के लिए, यह महत्वपूर्ण है कि एक उम्र के विभिन्न साथ ही पुरुष जानवरोंकम से कम चार दिनों के nce इस्तेमाल किया जा. इसके अलावा, सभी टेस्ट मैचों की सीरीज में एक ही ऑपरेटर द्वारा किया जाना चाहिए. परीक्षण के कमरे के संबंध में, हम दृढ़ता से तनाव और बाहरी शोर स्रोतों से उत्पन्न ध्यान के नुकसान से बचने के लिए एक acoustically अछूता वातावरण में परीक्षण प्रदर्शन सलाह देते हैं. बजाय अतिरिक्त भूलभुलैया cues की गंध का पता लगाने के आधार पर उन्मुखीकरण को रोकने के लिए, बंद खाद्य घरों पशु के लिए सुलभ नहीं होना चाहिए, और सामान्य हवा और गंध परिसंचरण की अनुमति दी जानी चाहिए. इसके अलावा, परीक्षण के लिए इस्तेमाल किया प्लेट गंध तटस्थ और डिटर्जेंट के लिए प्रतिरोधी सामग्री का निर्माण किया जाना चाहिए, और ध्यान के प्रयोगों के बीच साफ किया जाना चाहिए. प्रयोगात्मक भिन्नता का एक और संभावित स्रोत कमरा रोशनी है. प्रकाश स्रोत छवि अधिग्रहण, अतिरिक्त भूलभुलैया cues की मान्यता अनुमति देने के लिए काफी उज्ज्वल होना चाहिए, और उड़ान व्यवहार को प्रेरित करने के लिए, लेकिन पशु अंधा करने के लिए एक तीव्रता का नहीं होना चाहिए. इसके अलावा, हम एक ही समय में प्रत्येक जानवर के लिए परीक्षणों प्रदर्शन करने का सुझावदिन के circadian विविधताओं से बचने के लिए.

मुसलमानों मस्कुलस नेत्रहीन हड़ताली विशेषताएं (पेड़ की तरह दृश्य cues) (लैथम एट अल., Appl. पशु बिहेव. विज्ञान. 86 (3-4 पर क्षेत्रीय सीमाओं का पता लगाने के लिए इस्तेमाल दूसरों के बीच में, प्राकृतिक परिस्थितियों में, जो एक काफी अच्छी दृष्टि क्षमता है ), 261-289, 2004). एक क्लासिक प्रयोग Balkema एट अल में. (जे Neurophysiol. 48 (4), 968-980, 1982), 0 +6 रखा, और -7 diopter माउस आँखों के सामने लेंस और रेटिना नाड़ीग्रन्थि सेल में ग्रहणशील क्षेत्र आकार की कोई महत्वपूर्ण परिवर्तन मनाया. कारण क्षेत्र दृश्य उत्तेजनाओं (जैसे अतिरिक्त भूलभुलैया cues) के इस विशाल गहराई तक चूहों के सामने दूरी की एक बड़ी रेंज पर रखा जा सकता है और ध्यान केंद्रित करने में रहते हैं. हमारे दृष्टिकोण में, शुरुआती बिंदु से अतिरिक्त भूलभुलैया cues की दूरी साहित्य के अनुसार है जो प्लेट की सीमा, (से 30 सेमी था डब्ल्यू में जैसे 140 सेमीओंग एट अल., जीन मस्तिष्क बिहेव. 5 (5), 389-403, 2006)

कृंतक एक खुले मैदान की दीवारों के करीब रहने की प्रवृत्ति है. यह व्यवहार thigmotaxis के रूप में परिभाषित किया गया है (बार्नेट, एसएच, चूहा: व्यवहार में एक अध्ययन, Aldline प्रकाशन, शिकागो, पीपी 31-32, 1963). हाल ही में एक हे `Leary एट अल द्वारा अध्ययन. (Behav. ब्रेन रिस. 216 (2), 531-542, 2011) C57BL/6J चूहों 12 अन्य चूहों उपभेदों की तुलना में एक बार्न्स भूलभुलैया में बेहतर सीखने से पता चला है कि प्रदर्शन किया. 64% धारावाहिक thigmotactic रणनीति का प्रयोग किया जबकि चूहों के 28%, स्थानिक खोज का इस्तेमाल किया परीक्षण किया गया. इस डेटा एक 15 सेमी दीवार आसपास के साथ 69 सेमी की एक व्यास के साथ छोटे भूलभुलैया के लिए सच है. हालांकि, चूहे दीवारों के बिना एक बड़ी भूलभुलैया पर परीक्षण या cues intramaze, हमारे सेटअप (120 माइक्रोन का व्यास) मज़बूती से मुख्य रूप से अतिरिक्त भूलभुलैया दृश्य cues का उपयोग (देखें उदाहरण बाख एट अल., सेल. 81 के लिए सबूत से पता चला है के रूप में जैसे microstructure मतभेद की वजह से आगे शारीरिक cues से बचने के लिए, थाली प्रत्येक प्रयोग के बाद घुमाया गया था.

व्यवहार परीक्षण बस उपयुक्त माउस मॉडल का उपयोग कर, वयस्क हिप्पोकैम्पस न्यूरोजेनेसिस पर अन्य प्रतिलेखन कारकों के प्रभाव की जांच के लिए अनुकूलित किया जा सकता. हालांकि, यह मुख्य रूप से महानिदेशक निर्भर लर्निंग (स्थानिक पैटर्न जुदाई) का परीक्षण करने के लिए बनाया गया है, और neurogenesis या अन्य मस्तिष्क क्षेत्रों में neuronal अध: पतन की जांच के लिए उपयुक्त नहीं हो सकता है. इस संबंध में, एसपीएस-बी.एम. का उपयोग आगे अपनी डीजी विशिष्टता (ईसी द्वितीय और महानिदेशक और सीए 3 और सीए 1 और चुनाव आयोग छठी के बीच एक कार्यात्मक सर्किट पर सख्त निर्भरता), और इसलिए शामिल है कि कार्यों की जांच के लिए लागू नहीं किया जाना चाहिए द्वारा सीमित है monosynaptic चुनाव आयोग तृतीय - सीए 1 - चुनाव आयोग वी - सर्किट.

इस के साथ साथ वर्णित विधि का भविष्य अनुप्रयोगों स्टेम सेल प्रत्यारोपण, pharmaceu के प्रभाव की जांच शामिल हो सकते हैंहिप्पोकैम्पस के भीतर वयस्क हिप्पोकैम्पस न्यूरोजेनेसिस, और ऊतक homeostasis पर राजनैतिक उपचार.

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Disclosures

लेखकों वे ब्याज की कोई संघर्ष है कि घोषणा.

Acknowledgments

हम उत्कृष्ट तकनीकी सहायता के लिए एंजेला Kralemann-कोहलर धन्यवाद. यहाँ बताया प्रायोगिक कार्य हमारी प्रयोगशाला में प्रदर्शन किया गया था और सी.के. और बीके और बीके करने के लिए अनुसंधान और शिक्षा के जर्मन मंत्रालय (BMBF) का अनुदान के लिए जर्मन अनुसंधान परिषद (DFG) का अनुदान द्वारा समर्थित किया गया.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Moria MC17 Perforated Spoon  FST 10370-18 removal of the brains
Dissecting microscope Carl Zeiss Stemi SV8 removal of the brains
Surgical scissors  FST 14084-08 removal of the brains
Surgical scissors  FST 14381-43 removal of the brains
Dumont #5 forceps FST 11254-20 removal of the brains
SuperFrost Slides Carl Roth 1879 slides for immunohistochemistry
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich P6148 fixative
TissueTek OCT compound Sakura Finetek 1004200018 embedding of the brains
Normal Goat Serum Jackson Immunolabs 005-000-001 blocking in IHC
Normal Rabbit Serum Jackson Immunolabs 011-000-001 blocking in IHC
Normal Donkey Serum Jackson Immunolabs 017-000-001 blocking in IHC
anti-Neurofilament-M antibody Developmental Studies Hybridoma Bank 2H3 IHC, Dilution 1:200
anti-Doublecortin antibody sc-8066 Santa Cruz IHC, Dilution 1:800
anti-GFP antibody Abcam ab290 IHC, Dilution 1:2,000
anti-BrdU antibody OBT0030G Accurate Chemicals IHC, Dilution 1:2,000 
Fluoro-Jade C FJ-C HistoChem Determination of neuronal cell death
Betadine Mundipharma D08AG02 disinfectant
Cryomicrotome Leica CM1900 preparation of brain slices
Heparin sodium salt Sigma-Aldrich H3393 perfusion
Circular plate made from hard-plastic (diameter 120 cm) lab made none plate for SPS-BM, diameter 120 cm
Buraton rapid disinfectant  Schülke Mayr 113 911 disinfectant
Video-tracking system TSE VideoMot 2 with Software Package VideoMot2 TSE Systems 302050-SW-KIT tracking and analysis of SPS-BM
Triton X-100  Sigma Aldrich T8787 permeabilization/IHC
Cryotome Reichert Jung/Leica Frigomobil 1206 preparation of 40 µm brain slices
Mowiol 4-88 Carl Roth Art.-Nr. 0713 embedding of the slides
SYTOX green Invitrogen S7020 Nuclear staining
Food pellets (Kellog`s Froot Loops) Kellog`s SPS-BM
Prism, Version 3.0 Graph Pad Software, San Diego, USA Statistical evaluation of SPS-BM
Zen 2008 or Zen 2011 Software Carl Zeiss Software (Confocal microscope)
D.P.X Sigma-Aldrich 317616 mounting medium for Fluoro-Jade C staining

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References

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तंत्रिका विज्ञान अंक 84 NF-κB हिप्पोकैम्पस वयस्क neurogenesis स्थानिक पैटर्न जुदाई बार्न्स भूलभुलैया दांतेदार गाइरस p65 नाक आउट चूहों
NF-κB निर्भर वयस्क neurogenesis के मॉड्यूलेशन और विश्लेषण के लिए तरीके
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Widera, D., Müller, J., Imielski, Y., Heimann, P., Kaltschmidt, C., Kaltschmidt, B. Methods for the Modulation and Analysis of NF-κB-dependent Adult Neurogenesis. J. Vis. Exp. (84), e50870, doi:10.3791/50870 (2014).

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