Summary
的<em>线虫实验</ em>的是一个有用的模型，以探讨发展和生理学的多不饱和脂肪酸的功能。这个协议描述补充的<em> C的一种有效的方法线虫</ em>的饮食与多不饱和脂肪酸。
Abstract
脂肪酸是必需的许多细胞功能。他们作为高效的储能分子，补膜的疏水核心，并参与各种信号通路。 秀丽隐杆线虫综合了所有必要的酶来生产一系列的ω-6和ω-3脂肪酸。此，结合了简单的解剖学和可遗传工具的范围，使之成为有吸引力的模型来研究脂肪酸功能。为了研究介导的膳食脂肪酸的生理作用的遗传途径，我们已开发出一种方法，以补充C。线虫的饮食与不饱和脂肪酸。补充剂是改变蠕虫的脂肪酸组合物，一种有效的手段，也可用于抢救中脂肪酸的缺失突变体的缺陷。我们的方法用线虫生长培养基琼脂（NGM），补充有脂肪acidsodium盐。在补充板的脂肪酸成为incorpora特德进入细菌的食物来源，然后采取了由C的膜线虫饲料的补充细菌。我们还描述了一种气相色谱协议来监控发生在补充蠕虫中脂肪酸组成的变化。这是为了补充C的大和小群体的饮食的有效方法线虫 ，允许的范围内对本方法的应用。
Introduction
脂肪酸是膜的必要的结构部件，以及有效的能量储存分子。此外，脂肪酸可以从细胞膜裂解通过脂肪酶和酶促修饰以产生信号的效应1。天然存在的多不饱和脂肪酸（PUFA），含有两个或多个顺式双键。 ω-3脂肪酸和ω-6脂肪酸是彼此区分的基础上的双键相对于脂肪酸的甲基端的位置。健康饮食需要两个ω-6和ω-3脂肪酸。然而，西方的饮食是特别丰富的omega-6脂肪酸，差ω-3脂肪酸。高ω-6与ω-3脂肪酸的比例是与心血管和炎性疾病的风险增加，但是，具体的脂肪酸的精确有益和有害功能都不能很好地理解2相关联。蛔虫秀丽隐杆线虫elega因为它综合了所有必要的酶来生产一系列的ω-6和ω-3脂肪酸，包括ω-3去饱和酶的活动，是在缺席的大多数动物3,4纳秒是研究脂肪酸的功能是有用的。突变体缺乏脂肪酸去饱和酶的酶不能产生特定的PUFA，从而导致一系列的发育和神经缺陷4-6。
探讨膳食脂肪酸的生理效应，我们已经开发出一种生化检测与遗传分析兼容同时使用突变和RNAi敲除技术在C线虫 。补充特定的多不饱和脂肪酸是通过将脂肪酸的钠盐溶液的琼脂培养基之前浇注来实现。这将导致在多不饱和脂肪酸的摄取由大肠杆菌大肠杆菌的食物来源，它积聚在细菌膜。C.线虫摄取的含PUFA的细菌，这饮食补充足够的抢救有缺陷的多不饱和脂肪酸缺乏的突变体TS。大多数脂肪酸补充有对野生型动物没有有害的影响，但是，具体的ω-6脂肪酸，尤其是二高-γ-亚麻酸（DGLA，20点03的n-6）引起℃的永久性破坏线虫生殖细胞7,8。
气相色谱法是用于监视补充脂肪酸的细菌食物源（OP50或HT115）以及线虫的吸收。在加入洗涤剂的Tergitol（NP-40）中的媒体的允许通过整个板和的脂肪酸由大肠杆菌更高效摄取均匀分布的脂肪酸大肠杆菌和线虫。我们已经发现，不饱和脂肪酸可以容易地采取了由细菌和C。线虫 ，但是饱和脂肪酸的摄取是非常低效率的。本文将描述一步一步如何与脂肪酸补充琼脂培养基，以及如何监测在日脂肪酸的摄取Ë线虫用气相色谱法。
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Protocol
多不饱和脂肪酸是对热，光和氧敏感。因此，必须制备脂肪酸补充剂板时，应考虑这样的脂肪酸是不暴露在过量的热和光。含有0.1％的Tergitol（NP-40）NGM介质被高压灭菌和部分冷却，之后，脂肪酸钠盐中加入并不断搅拌。所述板被允许在黑暗中进行干燥。脂肪酸由C摄取线虫培养于这些板然后可以通过气相色谱法来监测。
1。脂肪酸补充培养基的制备
- 测量出的媒体组成部分成适当大小的烧瓶中。每1升中，添加17克细菌用琼脂2.5克胰蛋白胨，3克氯化钠，加入1ml 5毫克/毫升胆固醇溶解在乙醇和10ml 10％的Tergitol溶解在水中。
- 加入80％的微孔水最终所需量和高压灭菌媒体以及空玻璃瓶（相当于不同的数脂肪酸浓度进行测试），以及适当的量筒。
- 在水浴中设定为55℃，阴凉媒体当介质被冷却制备由破开的玻璃小瓶中，使用的安全防范措施，并确保玻璃粒子不混在的脂肪酸，脂肪酸的钠盐的工作原液。称出足够的脂肪酸，使一个100毫米的工作股票。
- 带来的脂肪酸溶液至100mM的用纯化水的最终浓度。完全溶解的脂肪酸的钠盐通常需要约20-30分钟。吹扫的脂肪酸用氩气或氮气的工作原液，由于用惰性气体接触防止氧化。盖上瓶盖和存储作业储备，在黑暗中，直到媒体已经冷却。
- （可选）如果RNAi的媒体需要，测量氨苄青霉素和异丙基-β-D-1-硫代半乳糖苷（IPTG）解决方案在这里。
- 当琼脂冷却到55°C每增加1升：1毫升1M MgSO 4干燥，将1ml的1M的CaCl 2和25ml的磷酸盐缓冲液（108.3克KH 2 PO 4和35.6克K 2 HPO 4，每1升高压灭菌）。添加过滤除菌氨苄青霉素和IPTG的解决方案，如果做的RNAi板。对于所有类型的板，加无菌水至使最终的介质体积至1L。
- 附近的火焰，转移媒体的蒸压和适当大小的量筒，然后加入温水无菌水到所需体积。传输媒体回到初始瓶中，搅拌混合。
- 靠近火焰，传输介质分成若干瓶等于浓度通过用蒸压测量被测试的数量和适当大小的带刻度的量筒。使用水浴直至脂肪酸工作股价已充分溶解维持等分媒体称为液体。
- 将一个瓶子上的轰动板和搅拌，直到媒体是温暖的触感，但不热。请务必留下自己足够时间搅拌中的脂肪酸原液和倒片介质开始凝固之前。如果搅拌盘具有温度控制，将其设置为55°C。
- 稀释100毫米脂肪酸的工作股票进入媒体所需的终浓度。搅拌介质，直至白色沉淀物是在溶液中（约1分钟）。媒体可能还是稍微浑浊之后。
- （可选）如果RNAi的媒体需要加氨苄青霉素至0.1毫克/毫升和IPTG至最终浓度为2mM。
- 使用自动吸管援助和无菌25毫升吸管，加入8毫升媒体每60毫米板或每100mm板25毫升媒体倒媒体。重复脂肪酸加成和浇注板的其余瓶子的步骤。
- 之后，琼脂凝固，覆盖脂肪酸补充板与框或在室温下储存在通风良好的抽屉从光氧化保护。
- E.种子大肠杆菌 OP50到平板平板干燥后的两天后。60 MM平板上，移液器300μl的OP50过夜培养（在37℃生长）的。如果RNAi的板倾倒，种子用300μlRNA干扰细菌后平板干燥后四天。板的干燥时间可能需要由于各种实验室环境中湿度的差异进行调整。
- 孵育在黑暗环境中的板在室温下，而菌苔被干燥。
2。由DGLA的补充诱导生精细胞破坏
- 线虫生长在含0.3 mM的DGLA（20时03 N-6）板块成为不育是由于生殖细胞在这两个幼虫阶段和成年线虫的破坏。
- 通过治疗妊娠雌雄同体用碱性次氯酸钠溶液准备L1幼虫的同步人口（对于一个10 ml的溶液：0.5 5M的NaOH，2.5毫升家用漂白剂，和7ml H 2 O的毫升）。轻轻摇动在此解决方案的妊娠直到雌雄同体成虫s溶解。鸡蛋将被保留，并且可以通过低速离心沉淀。
- 在M9的缓冲液洗蛋准备3次（3克KH 2 PO 4，6克的Na 2 HPO 4，5克氯化钠，加入1ml 1米硫酸镁4，H 2 O至1 L。添加硫酸镁高压灭菌后）。以提供足够的氧气，重悬在鸡蛋15毫升的塑料管以5毫升M9缓冲液和岩石的终体积在摇床上过夜。
- L1幼虫应电镀的RNAi菌后用OP50，或一天播种后两天加入到补充板。蠕虫孵育在20℃，3天或直到他们达到成年阶段。
- 成虫可以拿下的使用解剖显微镜用足够高的倍率进行可视化的胚胎在子宫内发展不育。成功的生精细胞丢失会出现鸡蛋清子宫无效。
- 蠕虫还可以砍下通过固定并与核酸染色CID染料diamindinophenylindole吲哚（DAPI），这有利于晶核在生殖细胞中的可视化和发育中的胚胎。一种快速DAPI染色是由采摘蠕虫成M9的缓冲区上表面玻璃9的下降来实现。
- 洪水手表玻璃用1毫升0.2纳克/立方米。 DAPI在95％的乙醇溶液，让坐在约5分钟。
- 挑虫进入VECTASHIELD的幻灯片上的下降，然后盖上盖玻片。
- 密封盖玻片，并储存于4℃在黑暗中过夜，以获得最佳的染色，但是滑动也可立即观看。得分为存在或不存在使用装有紫外线灯和过滤器的荧光显微镜生殖细胞的细胞核。
3。确认脂肪酸的摄取气相色谱法
总体脂肪酸C的组成线虫可以通过生成脂肪酸甲酯（脂肪酸甲酯），它们然后被分离并用气相字符定量测定omatography 4。
- 洗它们了与水板，并转移到硅烷化13毫米×100毫米的玻璃螺丝顶管收集500-1000成虫。
- 让蠕虫清偿重力，然后删除尽可能多的水可能用玻璃巴斯德吸管。
- 用清水洗一次虫，然后再删除尽可能多的水可能。
- 脂肪酸甲酯是通过加入1ml 2.5％的H 2 SO 4的甲醇溶液，然后加热，在70℃进行1小时的水浴中形成的。
- 从水浴中取出试管并冷却1分钟。
- 通过加入1.5毫升的水和0.25毫升己烷提取脂肪酸甲酯。
- 回顾管和剧烈震荡。
- 离心管中，在台式临床离心1分钟以最大速度己烷从含水溶剂中分离出来。
- 转让正己烷（顶层）的GC样品瓶插件内的GC样品瓶，小心不要将任何水相。对于GC一nalysis，1-2μl，以正己烷脂肪酸甲酯被注入到适合脂肪酸甲酯分析极性毛细管气相色谱柱。在Agilent 7890 GC进样口被设定在250℃，用1.4毫升/分钟的流速，并在GC烘箱编程为在130℃的初始温度，这是保持1分钟。随后，将温度斜坡10℃/分钟直到190℃，然后再次升温速率5℃/分钟直到210℃并保持另外1分钟。
- 以确保已发生的DGLA的那摄取，用火焰离子化检测器（FID）或质谱（MS）检测，用真实标准为C的鉴定分析脂肪酸甲酯线虫脂肪酸。
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Representative Results
在C的补充线虫饮食是由细菌食物源的摄取和结合脂肪酸到细菌膜的能力的限制。要确定大肠杆菌的能力大肠杆菌 OP50吸收各种脂肪酸进入其的膜，OP50被镀到无补充剂，0.1毫米和硬脂酸（18:0），油酸钠（18:1 N-9），和钠DGLA（20 0.3mM的浓度媒体：3N-6）。平板在室温下干燥在黑暗中3天，并保温在20℃下进行3天。细菌草坪被轻轻地刮草坪成水与火焰消毒压舌板收集。细菌通过离心沉淀，并用2.5％的H 2处理的SO 4在甲醇中，以产生脂肪酸甲基酯，这是由GC / MS分析后，在操作步骤中列出的方法中，步骤3进行分析。结果表明，不饱和脂肪酸（油酸和DGLA）纳入OP50在较高量的比t他饱和脂肪酸硬脂酸（ 图1A）。
此外，L1 N2期幼虫在20℃下生长在同一批次补板和三天后生长收获蠕虫被洗掉通过GC / MS进行分析板和脂肪酸在总蠕虫的Preps的。在补充脂肪酸的变化作图， 如图1B所示 。这些研究表明，补充的饱和脂肪酸不改变在蜗杆组织中饱和脂肪酸的相对含量，而补充的不饱和脂肪酸的增加不饱和脂肪酸的相对量在C线虫脂类。合在一起， 图1A和图1B所示的数据表明，在C.补充脂肪酸的相对累积线虫直接关联与脂肪酸的膳食E.相对积累大肠杆菌 。
e_content“>我们先前的研究显示，饮食中的DGLA导致不育线虫 10。 图2所示的DGLA诱导不育线虫的剂量反应。的DGLA的蠕虫病毒脂质的浓度，其中50％人口将不育是约12％。有趣的是，响应DGLA可以通过基因突变线虫被改变。最近的发现是，胰岛素样生长因子依赖压力的途径可以抑制DGLA诱导生精细胞破坏8。补充饮食包含在任一的daf-2胰岛素/ IGF受体的daf-2（e1370），或者daf-16/FOXO转录因子，DAF-16（mu86），示出了该方法的实用性解开遗传途径有害突变的蠕虫该影响膳食脂肪的生理效应。同步L1幼虫吸移到DGLA补充媒体。后3-4天的生长，蠕虫进行评分对于不孕，如通过无卵在成虫子宫确定。 DGLA补充的daf-2（e1370）突变体育，很少或几乎与野生型（N2）的蠕虫在两个0.15毫米和0.3毫米补剂（ 图3）没有诱发生殖细胞损失，另一方面，DGLA补充蠕虫与非活动FOXO （DAF-16（mu86））显示的无菌蠕虫的比例较高与野生型相比在对含有0.15毫DGLA（ 图3）板供电。
图1。吸收和由E.注册成立补充脂肪酸大肠杆菌 OP50和C。线虫 。 A. 大肠杆菌 OP50生长于含有0.1mM的板或0.3mM的硬脂酸，油酸钠，钠或DGLA以及未补充板。 FIV后在平板上生长的20°C，Eê天大肠杆菌收获和生成脂肪酸甲酯，通过GC / MS分析。因为OP50不产生油酸或DGLA，并只产生微量的硬脂酸，每个补充脂肪酸中的大肠杆菌的百分比大肠杆菌的脂质揭示OP50的，以纳入补充脂肪酸的能力。误差线为标清。 乙 。变化三线虫脂肪酸在青壮年生长三天，开始在L1阶段，在E。大肠杆菌含有0.1mM或0.3mM的硬脂酸，油酸钠，或DGLA板。减去在生长在那些生长在unsupplmented板的蠕虫补充板蠕虫18:0或20点03分的相对含量分别获得变化的硬脂酸和DGLA的值。并监控摄取油酸，油酸加上下游C20多不饱和脂肪酸的总和（20时03分，20点04的n-6，20时04分的n-3和20时05分），分别计算在补充和未补充PLATES，因为掺入油酸是进一步去饱和和拉长。误差线为标清。 点击这里查看大图 。
图2。 DGLA的蚯蚓脂类浓度的增加有关联越来越不育C。线虫野生型（N2）蠕虫分别用不同浓度的DGLA。在％DGLA总蚯蚓脂类和不育人口的％被用于绘制绘制从使用膳食DGLA浓度为0-0.3毫米DGLA五个独立的喂养实验，17个数据点。 点击这里查看大图 。
图3。补充C的生理效应线虫与DGLA。饥饿的L1幼虫野生型，DAF-2（e1370），或DAF-16（mu86）接种到未补充，0.15毫米或0.3毫米DGLA补充媒体和成长为成年阶段。然后打进无菌至少150个人的蠕虫。该DAF-2（e1370）突变体几乎完全肥沃，甚至在0.3毫米DGLA，而DAF-16（mu86）突变体显示无菌蠕虫数量的增加与野生型相比在0.15毫米DGLA。误差线为SEM。 点击这里查看大图 。
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Discussion
这里我们描述的补充C的方法线虫与食物中的不饱和脂肪酸。如上所述，必须注意在多不饱和脂肪酸补充板的准备，因为在多不饱和脂肪酸的双键的反应自然会导致这些不饱和脂肪酸，通过热和光11是氧化敏感。为了避免氧化，该多不饱和脂肪酸加入到液体琼脂培养基后，媒体已经冷却至55℃，并存储板在黑暗环境中是很重要的。
他人已经介绍的游离脂肪酸为C。线虫使用DMSO或乙醇的载体，或者通过直接添加脂肪酸通过显微注射入外阴12-14。突变体的表型部分由救助脂肪酸补充剂的生长板在不使用的Tergitol（NP40）14-15被实现。显然有多种有效的方式引进脂肪酸为C。线虫 ，尽管它是二fficult来比较各种方法的效率，因为在大多数实验中，在线虫脂肪酸的摄取没有监测。我们发现，我们的方法允许不饱和脂肪酸的一致和有效的补充，以几线虫到几万的人口规模。
我们发现有必要监测在C补充脂肪酸的摄取线虫的实验结果的解释提供帮助。例如，脂肪酸由细菌食物的摄取依赖于E。大肠杆菌菌株作为食物来源的线虫。我们已经发现，OP50占用了较大量的不饱和脂肪酸的比E。大肠杆菌菌株HT115，HB101，或NA22，菌株通常用于喂养RNAi实验（HT115）或用于高密度线虫增长（HB101和NA22）。因为在某些脂肪酸摄取的变化来测试几种浓度的脂肪酸，它是重要的，并利用气相色谱法来监测摄取。大多数实验室已经取得了使用脂肪酸浓度在0.08-0.2毫米5,6,15-18范围突变表型的抢救，然而，对寿命的影响，已报告有补充花生四烯酸的浓度低至0.01毫14 ，和其他人用剂量高达0.6毫米的诱导使用HT115 大肠杆菌喂养的RNAi表型的救援coli菌株 19。在我们的手中，补充大肠杆菌的大肠杆菌 OP50具有非常高浓度的多不饱和脂肪酸，大于0.4毫米，导致过多的膳食多不饱和脂肪酸的积累蚯蚓脂类，占总脂肪酸高达50％。这导致非特异性外阴生长缓慢和异常。
该技术的局限性在于无法有效地与饱和脂肪酸的补充。在添加补充媒体以及效率低下的吸收和融合周六的时候溶解度问题在大肠杆菌中的U额定脂肪酸大肠杆菌离开此方法更适合于补充不饱和脂肪酸（ 图1）。
我们的方法提供的单-和多不饱和脂肪酸可再现的补充，包括通常不被C.制备脂肪酸线虫 ，如二十二碳六烯酸（DHA，22点06的n-3）。生长和神经系统缺陷的多不饱和脂肪酸缺乏的突变体如肥肉-3可以通过饮食多不饱和脂肪酸5相对较低的水平救出。脂肪酸补充剂可用于由研究员谁希望改变C的脂肪酸组成通过饮食手段线虫来研究一系列生理过程。
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Disclosures
作者宣称，他们有没有竞争的财务权益。
Acknowledgments
我们感谢Chris Webster对于执行图代表结果的3和Jason Watts和克里斯·韦伯斯特所示的初步实验对稿件有用的意见。资助这项研究是通过提供赠款来自美国国立卫生研究院（美国）（R01DK074114）到仲量行。在这项工作中所使用的一些线虫菌株是由线虫遗传学中心，这是由研究基础设施计划的美国国立卫生研究院办公室（P40 OD010440）提供资助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bacto-Agar | Difco | 214010 | |
| Tryptone | Difco | 211705 | |
| NaCl | J.T. Baker | 3624-05 | |
| Tergitol | Sigma | NP40S-500mL | |
| Cholesterol | Sigma | C8667-25G | (5 mg/mL in ethanol) |
| MgSO4 | J.T. Baker | 2504-01 | |
| CaCl2 | J.T. Baker | 1311-01 | |
| K2HPO4 | J.T. Baker | 3254-05 | |
| KH2PO4 | J.T. Baker | 3246-05 | |
| Sodium dihomogamma linolenate | NuCHEK | S-1143 | |
| Warm sterile Millipore water | |||
| Sterile water for collecting worms | |||
| Nuclease-free Water for DGLA stock solution | Ambion | AM9932 | |
| Ampicillin | Fisher Scientific | BP1760-25 | 100 mg/ml in water (for RNAi plates) |
| Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside (IPTG) | Gold Biotechnology | 12481C100 | 1 M in water (for RNAi plates) |
| HSO4 | J.T. Baker | 9681-03 | |
| Methanol | Fisher Scientific | A452-4 | |
| Hexane | Fisher Scientific | H302-4 | |
| diamindinophenylindole (DAPI) | Sigma | D9542 | |
| VectaShield | Vector Laboratories | H-1000 | |
| Glass Flask | Corning | 4980-2L | |
| Autoclaveable Glass bottles with stirbars | Fisherbrand | FB-800 | |
| Autoclaveable Glass Graduated Cylinder | Fisherbrand | 08-557 | |
| Stir Plate | VWR | 97042-642 | |
| Waterbath at 55+ °C | Precision Scientific Inc. | 66551 | |
| Screwcap Brown Glass Vial | Sun SRI | 200 494 | |
| Argon gas tank | |||
| Automated Pipette aid | Pipette-Aid | P-90297 | |
| Sterile Serological Pipettes (25 ml) | Corning | 4489 | |
| Bunsen Burner | VWR | 89038-534 | |
| Dissection microscope | Leica | TLB3000 | |
| Silanized glass tube | Thermo Scientific | STT-13100-S | for FAMEs derivitization |
| PTFE Screw caps | Kimble-Chase | 1493015D | |
| Clinical tabletop centrifuge | IEC | ||
| GC Crimp Vial | SUN SRi | 200 000 | |
| GC Vial Insert | SUN SRi | 200 232 | |
| GC Vial cap | SUN SRi | 200 100 | |
| Gas Chromatograph | Agilent | 7890A | |
| Mass Spectrometry Detector | Agilent | 5975C | |
| Column for gas chromatography | Suppelco | SP 2380 | 30 m x 0.25 mm fused silica capillary column |
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